5フレーバーの Sophora flavescens 腸被覆カプセルは実験的な大腸炎やフェロトーシス関連の変化を緩和します

サマリー

潰瘍性大腸炎のマウスモデルでは、5フレーバーの Sophora flavescens が腸内被覆カプセルを軽減し、酸化ストレス、炎症性サイトカインの不均衡、JAK2/STAT3シグナル伝達、フェロプトーシス関連マーカーの変化を改善しました。

要約

潰瘍性大腸炎は、効果的かつ標的を絞った治療法が限られており、酸化ストレス、炎症性シグナル伝達、調節された細胞死経路が粘膜損傷に寄与する可能性があるため、依然として管理が困難です。本研究では、5フレーバーの Sophora flavescens 腸被膜カプセル(FSEC)が実験的な大腸炎を緩和するかどうかを評価し、酸化ストレス、炎症、フェロトーシスのマーカーに関する関連する変化を探りました。潰瘍性大腸炎のマウスモデルは、2.5%デキストラン硫酸ナトリウムへの周期的曝露と腫瘍壊死因子αチャレンジを組み合わせて確立されました。マウスは低用量、中用量、高用量のFSECまたはTLR4受容薬CRX-526を陽向き対照介入として投与しました。大腸組織病理はヘマトキシリンおよびエオシン染色で評価されました。血清スーパーオキシドジムターゼ、カタラーゼ、グルタチオン、ミエロペルオキシダーゼ、Fe²⁺レベルを生化学的アッセイを用いて測定しました。大腸組織のサイトカインは酵素結合免疫吸着アッセイで定量化され、JAK2およびSTAT3の発現は免疫組織化学で評価され、GPX4、FTH1、ACSL4の発現はウェスタンブロッティングで解析されました。FSEC治療は大腸粘膜損傷および炎症性細胞浸潤を減少させ、抗酸化指数を上げ、ミエロペルオキシダーゼのレベルを低下させました。FSECはまた、TNF-αおよびIL-1αのレベルを低下させ、IL-13のレベルを部分的に回復させ、JAK2およびSTAT3の免疫染色が弱いと関連していました。同時に、FSECはFe2^⁺およびACSL4レベルの低下、GPX4およびFTH1発現の増加など、フェロトーシス関連マーカーの変化を改善しました。これらの発見は、FSECが少なくとも部分的にマウスの実験的潰瘍性大腸炎を緩和し、酸化ストレス状態の改善、炎症性シグナル伝達の緩和、フェロトーシス関連マーカープロファイルの回復を図ることを示唆しています。

概要

潰瘍性大腸炎(UC)は、主に大腸および直腸粘膜に影響を及ぼす慢性炎症性疾患であり、粘膜炎症、潰瘍、バ^{リア機能障害}の再発エピソードを特徴とします。遺伝的感受性、環境要因、上皮バリア機能障害、免疫調節障害がUCの病因に関与しているとされていますが、持続性粘膜損傷のメカニズムはまだ完全には解明されていません。現在の薬理学的治療、例えばアミノサリチル酸、コルチコステロイド、免疫抑制剤、生物学的製剤は、多くの患者で疾患の活動を抑制することができます。しかし、治療中止後の再発、副作用、高額な費用、不完全な治療効果により臨床使用が制限される場合があります^。

鉄分依存性の細胞死の一種であるフェロプトーシスは、脂質過酸化と鉄代謝の変化を特徴とし、腸の炎症および潰瘍性結腸炎(UC)に関連する上皮損傷に関与することがますます示唆されています(^4,5,6,7,8)。同時に、伝統中国医学の処方は多標的^{治療の可能性から}、UC治療の補完的なアプローチとして注目を集めています。

5フレーバーの Sophora flavescens 腸被膜カプセル(FSEC)は、伝統中国医学の臨床において軽度から中等度の活動性潰瘍性潰瘍性大腸炎(UC)の治療に使用されています。過去の研究では、FSECが多成分・多標的メカニズムを通じてUC症状を改善する可能性が示唆されています¹⁰。しかし、FSECが酸化ストレス、炎症性シグナル伝達、JAK2/STAT3活性、フェロプトーシス関連変化に及ぼす実験的UCへの影響は、依然として十分に解明されていません。

酸化ストレスや炎症性シグナル伝達は、潰瘍性大腸炎における腸粘膜損傷の重要な要因です。活性酸素種の過剰な産生は上皮の完全性を乱し、炎症細胞の浸透を促進し、抗酸化防御システムを損なう可能性があります。JAK2/STAT3シグナル伝達などのサイトカイン媒介経路は炎症増幅や組織損傷に寄与します(11,12,13,14,15)。さらに、酸化ストレスとフェロプトーシスは抗酸化防御、鉄代謝、脂質過酸化の変化を通じて密接に関連しています(16,17,18,19,20)。したがって、酸化ストレス指数、炎症性サイトカイン、JAK2/STAT3シグナル伝達、フェロプトーシス関連マーカーの同時評価により、実験的UCにおける粘膜損傷および治療反応のより包括的な理解が可能となる可能性があります。

本研究では、環状デキストラン硫酸ナトリウムおよび腫瘍壊死因子α-挑戦マウスモデルを用いて、低用量、中用量、高用量のFSECの効果を評価しました。この設計の重要な方法論的強みは、組織病理学的評価と血清酸化ストレス指数、大腸組織サイトカイン、JAK2/STAT3免疫組織化学、フェロプトーシス関連タンパク質のウェスタンブロット解析の測定を単一の実験枠組み内で統合していることです。このアプローチは、FSECが実験的UCを緩和するかどうかを判断し、酸化ストレス、炎症性シグナル伝達、フェロトーシス関連マーカープロファイルの関連変化を特徴づけるために用いられました。全体的な実験設計および分析ワークフローは 図1にまとめられています。

図1:マウスモデルの実験ワークフローおよび下流解析。 慢性実験的潰瘍性大腸炎は、実験プロトコルの最終週に2.5%デキストラ硫酸ナトリウム(DSS)への周期的曝露と腫瘍壊死因子α(TNF-α)挑戦を組み合わせて誘発されました。マウスは正常対照群、モデル群、低用量FSEC、中用量FSEC、高用量FSEC、CRX-526陽性対照群に割り当てられました。FSECは体重108、216、または432 mg/kgの用量で胃内漏尿で投与されました。CRX-526はポジティブコントロール介入として使用されました。最終処理後、組織病理学的評価、酸化ストレス関連生化学的アッセイ、ELISAによるサイトカイン解析、免疫組織化学、ウェスタンブロット解析のためにサンプルが採取されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコル

すべての動物処置は南昌医科大学動物福祉倫理委員会(承認番号)によって審査・承認されました。NY2SC 20250407)。すべての実験は、実験動物の飼育および使用に関する機関のガイドラインに従って実施されました。化学物質、試薬、機器は 材料表に記載されています。

1. 動物と治療

本研究では、野生型の雄C57BL/6Jマウス(生後8週)が使用されました。動物は標準的な実験室環境で温度と湿度が管理され、餌や水は無料で提供されました。順応後、飲料水中に2.5%デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を3サイクル投与することで慢性大腸炎が誘発されました。各サイクルは1週間続き、定期的に水を飲む2週間の回復期間が挟まれていました。実験プロトコルの最終週に、モデル群および治療群のマウスに腫瘍壊死因子α(TNF-α;10 μg/100 g体重、1日2回)を胃内ガベージ投与し、大腸損傷をさらに悪化させました。正常対照マウスは単に車両のみを投与し、DSSやTNF-αには曝露されませんでした。

5フレーバーの Sophora flavescens 腸被覆カプセル(FSEC)は、商業的に入手可能な承認された中国特許医薬品として使用されました。製剤には Sophora flavescens Aiton、Sanguisorba officinalis L.、Indigo naturalis、Bletilla striata (Thunb.)が含まれていました。 Rchb.f.、およびグリキュリザ・ウラレンシス・フィッシュ(原DC)も含まれます。同じ生産バッチのカプセル内容物は計量され、無菌蒸留水に懸濁され、投与前に新鮮な投与懸濁液を準備しました。懸浮液は各ガベージの前に十分に混合され、均一な分散を確保しました。製品供給源、承認番号、医薬品仕様、品質管理情報は材料表に記載されています。製品の品質は、承認された医薬品仕様および製造元提供の情報(カプセル仕様、外観、腸内放出および分解要件、微生物限度要件、品質管理基準など)に従って記述されました。

FSEC治療マウスは、モデル最終週に胃内ガベージを1日2回、低用量FSEC(108 mg/kg体重)、中用量FSEC(216 mg/体重)、または高用量FSEC(432 mg/kg体重)を投与しました。用量レベルは、承認された臨床用量、体表面積換算、および予備的な用量範囲の考慮事項に基づいて選定されました。車両処理マウスには、同じ量の滅菌蒸留水を胃内ガベージで投与しました。

陽性対照群は、モデル化最終週に尾静脈注射でTLR4アンタゴニストCRX-526を1 mg/kgで投与しました。CRX-526は抗炎症介入の基準として使用されました。本研究には6つのグループ(n=6群)が含まれ、正常対照群、モデル群、低用量FSEC、中用量FSEC、高用量FSEC、CRX-526陽性対照群が含まれていました。マウスは最後の研究処理から24時間後に生贄にされました。安楽死は、実験動物のケアおよび使用に関する機関ガイドラインに従い、イソフルラン麻酔下での子宮頸部脱臼によって行われました。

2. ヘマトキシリンおよびエオシン染色による組織学的評価

肛門と回盲部の間の巨視的に最も影響を受けた大腸組織を採取しました。各マウスに対して、この領域の代表的な結腸セグメントを10%中性緩衝ホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込み、切片し、ヘマトキシリンとエオシンで染色しました。組織学的評価のために、各動物から少なくとも3つの切片が準備され、各切片ごとに5つの重複しない高倍率場が検査されました。フィールドは断面を一端から端まで無作為にスキャンし、破れたり折りたたまれたり、染色が不十分な部分を避けて体系的に選定されました。粘膜潰瘍、腺の破壊、うっ血、炎症性細胞浸潤などの組織病理学的変化を光学顕微鏡下で評価しました。

3. 酸化ストレス関連生化学指標の測定

血液サンプル(0.5mL)は抗凝固剤入りチューブに採取され、約1160 ×g で4°Cで10分間遠心分離されました。 上澄液は採取され、製造元の指示に従い、材料表に記載された対応するアッセイキットを用いて血清鉄、超酸化物ジムターゼ(SOD)、グルタチオン(GSH)、カタラーゼ(CAT)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)レベルを測定しました。

4. JAK2およびSTAT3の免疫組織化学的解析

パラフィン埋め込みの大腸組織切片(5μm)はキシレンで脱水され、グレード化されたエタノール系列で再水和され、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄されました。抗原回収はクエン酸バッファー(pH 6.0)でマイクロ波加熱を用いて行われました。室温まで冷却した後、内因性過過酸化物酵素活性を3%のH₂O₂で10分間遮断しました。切片は5%正常ヤギ血清で室温で30分間ブロックし、4°Cで1:50および1:80の希釈でそれぞれJAK2およびSTAT3に対する一次抗体とともに一晩インキュベートしました。リン酸塩緩衝塩水洗浄後、製造元の指示に従いホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合の二次抗体で切片を培養しました。免疫反応性シグナルは3,3′-ジアミノベンジジンを用いて可視化し、核はヘマトキシリンでカウンター染色された。断片は脱水され、装着され、光学顕微鏡で検査されました。

5. 酵素結合免疫吸着アッセイによるサイトカインの定量

大腸組織は2〜^{3 mmの} 3片に切断され、リン酸塩緩衝塩水で氷上で均質化され、12,000 × gで4°Cで15分間遠心分離されました。 上清液を採取し、製造元の指示に従い対応するELISAキットを用いてTNF-α、IL-1α、IL-13の濃度を測定しました。吸収度値はマイクロプレートリーダーを用いて測定され、各アッセイごとに生成された標準曲線からサイトカイン濃度が計算されました。

6. フェロプトーシス関連タンパク質のウェスタンブロット解析

大腸組織から総タンパク質を抽出し、ビシンコニン酸アッセイを用いてタンパク質濃度を測定しました。各サンプルから等量のタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、膜に移しました。室温で5%無脂肪乳または同等のブロッキングバッファーを2時間ブロッキングした後、膜を4°Cで一晩、GPX4、FTH1、ACSL4および材料表に記載されたロードコントロールタンパク質βアクチンに対する一次抗体とともに培養しました。翌日、膜を洗浄し、対応するホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合の二次抗体と室温で2時間培養しました。タンパク質バンドは化学発光基質を用いて可視化され、化学発光イメージングシステムで画像化されました。バンド強度は密度測定ソフトウェアを用いて定量化されました。GPX4、FTH1、ACSL4の発現レベルはβアクチンに正規化され、統計解析のために相対タンパク質発現を算出した。

7. 統計解析

データは平均標準偏差(SD)±表示されています。複数群間の比較は分散の一方通量解析を用い、その後、分散の正規性と均質性の仮定が満たされた際にボンフェローニの事後検定を実施しました。P < 0.05の値は統計的に有意とされました。

結果

FSECは潰瘍性大腸炎マウスの組織病理学的損傷を緩和し、酸化ストレス関連指標を改善します
図2に示すように、正常な対照群は結腸粘膜構造が完全な状態で、よく組織された腺と最小限の炎症細胞浸潤を示しました。対照的に、モデル群は上皮の破壊、粘膜潰瘍、腺の破壊、うっ血、著しい炎症性細胞浸潤を特徴とする重度の粘膜損傷を示しました。モデル群と比較して、高用量、中用量、低用量のFSECを投与したマウスは、粘膜破壊や炎症性細胞浸潤の減少を含む組織病理学的損傷が減少しました。最も顕著な組織学的改善は高用量および中用量FSEC群およびCRX-526陽性対照群で観察されました。

ディスカッション

本研究は、実験的潰瘍性大腸炎(UC)のマウスモデルにおける5フレー バーSophora flavescens 腸被覆カプセル(FSEC)の効果を調査し、酸化ストレス関連指標、炎症性サイトカイン、JAK2/STAT3シグナル伝達、フェロプトーシス関連マーカーの関連変化を評価しました。主な発見は、FSEC治療が大腸の組織病理学的損傷を緩和し、抗酸化物質関連生化学指標を改善し、TNF-αおよびIL-1αレベルの低下、IL-13の部分回復、JAK2およびSTAT3免疫染色の弱化、フェロトーシス関連マーカープロファイルの改善を伴ったことでした。これらの観察結果は、FSECが実験的な潰瘍性結腸炎において保護効果を発揮し、酸化ストレス、炎症性シグナル伝達、フェロトーシス関連経路の協調変化に関連していることを示している。

酸化ストレスはUC¹⁵における腸粘膜損傷の発症および持続に密接に関与しています。鉄依存性の酸化損傷も腸の炎症に関与しており、鉄の利用可能性の変化は...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3,3'-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	HRPベースの免疫組織化学用クロモゲン基質。
ACSL4抗体（F-4）	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	ウェスタンブロット用マウスモノクローナル一次抗体；使用希釈倍率1:500；RRID: AB_10842002。
抗原回収溶液、クエン酸緩衝液、pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	パラフィン切片免疫組織化学用熱誘起エピトープ回収バッファー。
BCAタンパク質アッセイキット	Beyotime Biotechnology	P0012	ウェスタンブロッティング前のタンパク質定量。
C57BL/6Jマウス	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	8週齢のオスSPFマウス；提出された倫理審査承認資料と一致した動物源。
カタラーゼ（CAT）アッセイキット	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	血清CAT活性測定用比色キット。
ChemiDoc XRS+イメージングシステム	Bio-Rad Laboratories	1708265	ウェスタンブロット検出用化学ルミネッセンスイメージングシステム。
CRX-526	TargetMol	T27090	TLR4アンタゴニスト、ポジティブコントロール介入として使用；CAS番号245515-64-4。
デキストラン硫酸ナトリウム塩（DSS）、大腸炎グレード	MP Biomedicals	160110	DSS、大腸炎グレード、分子量36,000～50,000 Da；飲料水に2.5％使用。
ECL化学発光基質	Bio-Rad Laboratories	1705061	HRPベースのウェスタンブロット信号検出用Clarity Western ECL基質。
ELISAキット、マウスIL-13	Abcam	ab219634	マウスIL-13定量用比色サンドイッチELISAキット；450 nm読み取り。
ELISAキット、マウスIL-1α	Abcam	ab199076	マウスIL-1α定量用比色サンドイッチELISAキット；450 nm読み取り。
ELISAキット、マウスTNF-α	Abcam	ab208348	マウスTNF-α定量用比色サンドイッチELISAキット；450 nm読み取り。
エタノール、絶対	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	組織処理、脱水、試薬調製に使用。
二価鉄（Fe2+）アッセイキット	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	血清または組織サンプル中のFe2+測定用比色キット。
五味子黄耆腸溶性カプセル	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA承認番号Z20150002	中国特許薬；0.4 g /カプセル；製剤には黄耆、キサノスモラ、アゾウム、シロツメクサ、カンゾウが含まれる；薬事規格YBZ00152015
グルタチオン（GSH）アッセイキット	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	血清GSH測定用還元型グルタチオンアッセイキット。
GPX4抗体（E-12）	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	ウェスタンブロット用マウスモノクローナル一次抗体；使用希釈倍率1:500；RRID:サプライヤーデータシートに記載されていない。
ヘマトキシリンとエオシン染色キット	Solarbio	G1120	パラフィン埋め込み結腸組織切片のH&E染色。
ラット抗マウスIgGに結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	ウェスタンブロット用二次抗体；使用希釈倍率1:50,000；RRID: AB_631736。
ImageJソフトウェア	National Institutes of Health	バージョン1.54	ウェスタンブロットバンド定量に使用する画像分析および密度計測ソフトウェア。
免疫組織化学検出キット	ZSGB-BIO	PV-9000	パラフィン切片免疫組織化学用ポリマーベースのHRP検出キット。
JAK2抗体（D2E12）	Cell Signaling Technology	3230	パラフィン切片JAK2免疫組織化学用ウサビモノクローナル一次抗体；RRID: AB_2128522。
マイクロプレートリーダー	BioTek Instruments	Synergy H1	450 nmでのELISA吸光度測定用プレートリーダー。
ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性アッセイキット	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	血清MPO活性測定用比色キット。
中性緩衝ホルマリン、10％	Sigma-Aldrich	HT501128	パラフィン埋め込み前の結腸組織固定。
正常ラット血清	Solarbio	SL038	免疫組織化学用ブロッキング試薬。
パラフィン	Leica Biosystems	39601006	結腸組織処理用埋め込み媒体。
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	Solarbio	P1020	組織ホモジネート、洗浄、免疫染色手順用バッファー。
PVDF膜	MilliporeSigma	IPVH00010	ウェスタンブロッティング用タンパク質転写膜。
組換えマウスTNF-αタンパク質	R&D Systems	410-MT	最終週の炎症チャレンジ用組換えマウスTNF-α。
SDS-PAGEおよび転写システム	Bio-Rad Laboratories	1658004	SDS-PAGEおよびウェスタンブロット転写ワークフロー用Mini-PROTEAN Tetraシステム。
SPSS Statisticsソフトウェア	IBM	バージョン24.0	単因子分散分析およびBonferroni事後検定用統計分析ソフトウェア。
STAT3抗体（124H6）	Cell Signaling Technology	9139	STAT3免疫組織化学用マウスモノクローナル一次抗体；RRID: AB_331757。
スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）アッセイキット	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-3-2	血清SOD活性測定用WST-1法キット。
キシレン	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418	パラフィン切片処理用脱蝋剤。
β-アクチン抗体（C4）	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	ウェスタンブロット用マウスモノクローナルロー