新鮮な膵臓組織からの骨髄間葉幹細胞由来のアイレットオルガノイド様構造の生成

サマリー

ここでは、豚の膵組織溶解液を用いて骨髄間葉質幹細胞(BMSC)を膵島オルガノイド様構造に分化するプロトコルを提示します。オルガノイド様構造は22日後に形成されます。このシンプルでコスト効率の高い方法は、in vitro試験や薬物スクリーニングのために膵島に形態学的に類似した構造を生成します。

要約

世界中で広く見られる慢性疾患である糖尿病(DM)は、体内のグルコースバランスの乱れを特徴とします。1型糖尿病(T1DM)では、自己免疫反応が膵臓のβ細胞を完全に破壊し、インスリン全不全を引き起こします。この疾患を持つ患者には生涯にわたる補足インスリン治療が必要です。本研究は、骨髄間葉幹細胞(BMSC)から膵島オルガノイド様構造を生成する信頼性が高く経済的な培養プラットフォームの構築を目指しています。このプラットフォームは移植のためのドナーアイレット不足を緩和するだけでなく、糖尿病関連研究のin vitroモデルとしても機能します。

豚膵組織溶解液の調製プロセスを最適化(12,000 rpmで遠心分離、4°Cで30分間遠心分離、その後0.22 μmのろ過による滅菌)により、BMSCは膵島状オルガノイド状構造への分化を成功裏に誘導しました。形態学的検証により、誘導されたBMSCのみがコンパクトで厚く、非常に透明な島状集合体を形成する一方、誘導されていないBMSCは顕著な真空化と透明度の低下を示したことが確認されました。

動的モニタリングにより、細胞凝集体(直径50〜100μm)が培養16日目に形成され、22日目にはカプセル状の構造(直径200〜300μm)に発達することが示されました。この方法は操作が簡単でコスト効率が高く、複雑な機器を必要としません。得られるオルガノイドは膵島と形態学的に類似しており、in vitro試験や関連する薬物スクリーニングのツールを提供します。

概要

三次元(3D)in vitroモデルシステムとして、膵島オルガノイド様構造は、多細胞組成や空間構造を密接に模倣できる能力から、糖尿病研究や再生医療において重要なツールとして浮上しています^。これらのモデルは、膵島発生生物学や糖尿病の病理的メカニズムを理解するための独自のプラットフォーム^{を提供するだけでなく、}細胞置換療法や薬物^{スクリーニングシステムの開発}にも寄与します4。糖尿病の世界的な有病率が上昇し続けている中、特に1型糖尿病における不可逆的なβ細胞損傷による絶対的なインスリン欠乏症が顕著であるため、従来のインスリン補充療法は症状を抑えられますが、病気を治すことはできません。一方で、島移植はドナー不足が深刻であり、拡張可能な代替島源の開発が緊急の優先事項^{となっています。}多能性幹細胞や成人幹細胞の指向性分化の可能性を活用することで、膵島オルガノイド様技術がこの制限を解消するのに役立つ可能性があります(^6,7,8)。

近年、ヒト胚性幹細胞(hESC)および誘導多能性幹細胞(iPSCs)に基づく膵島類オルガノイド様培養システムにおいて大きな進展が見^{られています。}複数の研究により、誘導プロトコルと培養条件の最適化により、幹細胞はグルコース応答性インスリン分泌機能を持つ孤島状細胞に分化できることが確認されています¹⁰。化学的再プログラミング技術のブレークスルーにより、遺伝子操作を行わずにhiPSCsの生成が可能となり、翻訳ポテンシャルが向上しました^。培養システムに関しては、3D培養と特定の細胞外マトリックスおよび成長因子の組み合わせを組み合わせることで、アイレット前駆細胞の自己組織化を促進し、α、β、δ細胞からなるオルガノイド構造へと移行できます¹²。しかし、既存の技術は依然として多くの課題に直面しており、不安定な分化効率、機能成熟度の不足、血管ネットワークや免疫微小環境の欠如など、広範な応用を制限する主要な制限要因¹³ があります。

膵島類オルガノイド様構造の研究が進展しているにもかかわらず、この分野におけるいくつかの重要な科学的課題は依然として解決されていません¹⁴。第一に、標準化されたオルガノイドの定義や構造手順がないため、異なる研究室間で結果を直接比較することが困難^です。第二に、現在の培養システムでは、ネイティブ膵島の複雑な細胞組成や正確な空間配置を完全に再現^{することはできません。}第三に、長期オルガノイド培養中の機能的安定性や移植後の生存率といった核心的な課題は十分に解明されていません¹⁷。さらに、既存の多くのプロトコルは依然として動物由来マトリックス材料に依存しており、組成が不明でバッチごとに大きなばらつきがあり、^{臨床応用の}品質管理を妨げています。これらの知識と技術的ギャップは、膵島状オルガノイド状構造の基礎研究から臨床実践への移行を深刻に妨げています。

このプロトコルは、骨髄間葉幹細胞(BMSC)を用いて膵島オルガノイド様構造物を生成する安定的で手頃かつ再現性のあるアプローチを構築することを目的としています。確立された方法は、実験室での実験研究および前臨床薬物スクリーニングの応用を目的としています。BMSCによるアイレット分化の現行戦略は、過剰なコスト、運用基準の不一致、適用範囲の限界など、複数の制約を抱えています。既存の多くの誘導システムは高価な組換えサイトカイン、専門用培養マトリックス、高精度培養装置に依存しており、これらの広範な利用を大きく制限しています。これらの欠点を解決するため、本プロトコルでは豚膵臓組織溶解液をコア誘導因子として採用しています。この最適化・簡素化された培養戦略により、通常の実験機器や条件だけでBMSCを島状構造へ効率的に分化させることが可能となります。

hESC、iPSC、高コスト成長因子カクテルに依存する従来の手法と比べて、本戦略はいくつかの明確な実用的利点を提供します。高価な試薬や複雑な培養装置を不要にし、実験コストを削減し、バッチ間ばらつきを最小限に抑えつつ一貫した結果^{を実現します。}異種遺伝子マトリックスベースのシステムとは異なり、このプロトコルは簡略化された組織溶解液を使用し、実験室間での制御性と再現性を向上させます(15,16,17,18)。さらに、BMSCは入手しやすく、培養中で安定し、多能性幹細胞に伴う倫理的制約もないため、このアプローチは日常的な実験室での使用に特に適しています。

既存の研究アプローチは膵臓器モデルの分野で極端に分かれており、臨床変換のための高度なオルガノイドプラットフォームはコストが高く技術的に複雑であり、単純化された代替モデルは詳細な機能解析をサポートできません。本研究で提案されたプロトコルは、標準化された中間的な技術的スキームを提供することで、この研究ギャップを埋めています。このアプローチは膵島の基本的な生理的特性を保持し、従来の基本的な実験室環境とも完全に互換性があります。これは、特に日常的な細胞培養インフラは備えているものの、専門的な幹細胞培養プラットフォームを持たないチームにとって、膵島発生メカニズム、糖尿病疾患モデル、予備薬剤候補評価に焦点を当てる研究者にとって実用的なツールとなります。この方法は特定の高度な研究のために完全に血管形成または免疫学的に適合したオルガノイドを生成することはできませんが、予備的な実験スクリーニング、機構的探究、アイレット生物学研究の学術訓練には適しています。

本研究は、膵島オルガノイド様構造の経済的かつ標準化された培養システムの構築に焦点を当て、糖尿病関連研究のための信頼できる三次元研究モデルを提供することを目指しています。多様な誘導プログラムや培養環境がオルガノイド形成効率や形態的特徴にどのように影響するかを体系的に分析することで、本研究はこの分野の進展を妨げる主要な技術的障害を突破しようと試みます。主要な研究目標は、高度な機器を使わない通常の基礎実験室に適用可能なユニバーサル培養プロトコルの確立、オルガノイドの品質を評価する定量的評価基準の策定、そして長期培養期間中のオルガノイドの形態学的および機能的安定性を維持するための培養戦略の最適化という3つの主要な側面をカバーしています。本研究の成果は、in vitro実験探求に確固たる技術的支持を提供するとともに、膵島発生メカニズムや低血糖薬のスクリーニングに関する実用的かつ信頼性の高いモデル構築に寄与します。

プロトコル

すべての実験手順は、広西医科大学倫理委員会(承認番号:SYXK 2014-0003)が承認した実験動物福祉のガイドラインに準拠し、国際医科学機関評議会(CIOMS)が策定した動物に関する国際生物医学研究指導原則に定められた動物ケアおよび使用に関する倫理規範に準拠しています。

組織処理および試薬調製に関わるすべての作業は、汚染を防ぐためにクラスIIのバイオセーフティキャビネット内で行われなければなりません。新鮮な組織処理と膵島類オルガノイド状構造誘導器の準備が完了するために少なくとも8時間の期間を設けてください。実験中はすべてのサンプルと試薬を氷に保管してください。

1. 実験的調製

1. 7日齢のスプラグ・ドーリー(SD)が頸部脱臼で乳を吸うラットを安楽死させてください。家畜豚に対して20 mg/kgのペントバルビタールナトリウム静脈注射で麻酔し、足筋離脱反射の消失と安定した呼吸数の消失により十分な麻酔を確認します。
2. 無菌条件下のクラスIIバイオセーフティキャビネットで豚の膵臓組織を処理します。採取後24時間以内に新鮮な豚の膵臓組織を処理してください。採取した組織サンプルは、完全なDMEM培地( 表1参照)で4°Cの温度で保存し、処理を待つ。
3. 冷蔵遠心分離機を4°Cに設定し、低速遠心分離モードを選択してセルの処理物を傷つけないようにします。実験で使用するまで、1000μLピペットチップ、200μLピペットチップ、50mL遠心分離チューブを−20°Cの冷凍庫に保存してください。0.22μmの滅菌フィルターと20mLの使い捨て滅菌注射器を十分に用意してください。眼科ハサミ、湾曲ピンセット、ガラスペトリ皿、アンプルは高温オートクレーブ(121°C、20分)で滅菌します。
4. 実験使用前に、完全に準備された膵組織溶解液をアリコートします。最適な実験的一貫性を確保するために、ホモジネート100μLを個別の1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブにピペットで分離し、別々に保管し、その後使用します。

2. 新鮮な膵組織を処理し、膵島状オルガノイド状構造誘導剤を製備する

1. 新鮮な豚の膵臓標本を採取し、すぐにドライアイスに移して組織の生体活性を維持します。獲得した組織はまずピペッティングによる無菌生理食塩水で繰り返し洗浄されます。初期洗浄の後、3mLの無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を用いてさらに徹底的に洗浄し、残留血痕や組織汚染物質を完全に除去します。
2. 滅菌培養プレートから残留液体を除去・廃棄し、その後2mLのDMEM培地を補足します。事前処理された膵組織は、無菌眼用ハサミで均一な1 mm³の断片に細分されます(図1A,B)。すべての挽いた組織片は50mLの遠心分離機チューブに集められ、その後10回上下に優しくピペッティングして均質な混合を実現します。
3. 組織均質化は滅菌ガラス乳棒を用いて行われます(図1C)。粉砕過程では、膵臓組織断片をDMEM培地と1:1の体積比で均等に混合します。完全に均質化された組織懸濁液は50 mLの遠心分離機管に移され、4°Cの条件下で21,600 × gの高速冷蔵遠心分離で30分間行われます。
4. 遠心分離後、清算された上清液は無菌ピペットでゆっくりと抽出されます。採取された上清液は0.22μmの滅菌フィルターに通され、微小な組織の破片や未溶解不純物を除去します(図1D)。精製液は最終的に1.5mLのマイクロ遠心分離機管に分割され、1本あたり100μLの固定容量で密封保存とその後の実験が行われます(図1E)。
5. 割り当てられた膵島状オルガノイド状構造誘導器を−20°Cで保管します。
   注:適切な保管条件下では1年間安定します。調製済み解体の誘導活性を目視検査と機能誘導で評価します。活発な溶解液は、透明で淡いピンク色、明らかな降水がない外観で識別できます。目に見える降水による活動喪失や典型的なアイレットオルガノイド形成の失敗を認識します。

3. 誘導培地の調製

1. 誘導培地は細胞培養手術直前に新たに準備してください。自己調製膵島オルガノイド誘導薬を、表1に記載された割合に厳密に従い、10%胎児用牛血清(FBS-H-DMEM)を含む高グルコースDMEM培地と組み合わせます。
2. 培養した膵臓器サンプルを、一定温度37°C、CO₂飽和度5%の細胞インキュベーターに入れて連続培養します。

4. オルガノイドの形態学的観察および成長モニタリング

1. 顕微鏡観察は培養期間中の定められた時間点、例えば細胞シード後1日目、3日目、7日目、10日目、15日目に実施されます。
2. 各検出セッション中に膵臓器類構造の形態変化、成長条件、細胞生存率を追跡するために光学顕微鏡が採用され、構造物の動的成長特性を記録します。

5. オルガノイドの通過と低温保存

1. 種子通透3 BMSCは、6ウェル培養プレートで1個×10個^5細胞の 密度で行われ、完全な培地で一晩培養して細胞の付着を許可し、誘導後に誘導します。
2. 培養系に0.02%のEDTAを含むトリプシン1 mLを加えます。培養皿の表面を優しくピペットで5〜8回擦り、膵臓器官を皿から剥離します。
3. トリプシン消化を終了するために10%のH-DMEM-F12培地を2mL加えます。冷蔵遠心分離機を使って、1,500 × g で4°Cの5分間遠心分離します。遠心分離後、上澄液を吸引して捨てます。
4. 細胞ペレットに10%のFBS-H-DMEM培地を2倍の体積に加え、1:2の通過比を実現します。
5. オルガノイド培養の凍結保存は以下の通りです:得られた細胞ペレットを1mLの血清フリークライオ保存液に再懸浮させます。再懸濁オルガノイドは短期保存(最大1年)のために−80°Cで保存し、長期保存時は液体窒素で保存します。
   注意:異なる通過比率を得るために、新鮮培地の体積を調整してください。例えば、1:1のパッセージでは初期の体積と同じ媒体を使い、1:3の文章では初期の媒体の3倍の体積を足す。

結果

膵島状オルガノイド状培養の成長動態を時間経過で記録することは、特に培養開始から数週間にわたり重要であり、これにより後の実験における培養システムのパフォーマンスを予測できます。 図2は22日間の培養例を示しており、BMSCが生後7日の授乳ラットの骨髄から効率的に分離され、膵島状オルガノイド構造の生成に成功した例です。BMSCの同一性は、三系統分化および表面マーカーの発現(CD29⁺、CD90⁺、^CD34−、CD45⁻)(補足図S1)によって確認されました。新たに形成されたオルガノイドの表現型は多様で、散在する球状オルガノイドから球状・集合体状の培養まで多岐にわたり、これらの表現型の違いは膵島オルガノイド様構造の発生段階に依存します。膵島状オルガノイド様構造の形態変化は成長中に急速かつ多様ですが、広範な誘導および培養観察に基づいていくつかの成長および発生パターン...

ディスカッション

糖尿病は世界的な代謝障害であり、主に1型糖尿病(T1DM)と2型糖尿病(T2DM)に分類されます。T1DMは膵臓β細胞の選択的破壊を特徴とする自己免疫疾患であり、絶対的なインスリン欠乏症を引き起こす¹⁹。患者は生涯にわたる外因性インスリン療法を必要としますが、重度の低血糖や微小血管合併症のリスクに直面しています²⁰。現在、膵島移植は内因性インスリン分泌を回復させる唯一の治療法^です6が、ドナー不足と免疫拒絶反応により臨床応用は制限されています²¹。したがって、代替アイレットソースの開発や新しい治療戦略の開発は、糖尿病研究において重要な方向性となっています。近年、幹細胞技術とオルガノイド培養の急速な発展により、^{糖尿病治療に}新たな希望がもたらされました。特に、在来の膵島の構造を模倣できる三次元膵島類オルガノイド様構造は、ドナー不足や免疫適合...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 & μ;m無菌フィルター	メルク・ミリポール	SLGP033RB	膵臓組織の不純物や破片を除去するための滅菌ろ過
0.25%トリプシン(0.02%EDTA以内)	ウィーツン	325-043-CL	膵島オルガノイドの軽度解離による通過手術
1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ	コーニング・アクシジェン	AXY-20-1500	膵臓組織溶解液(100 & μ;1本あたりL)
10 & mu;Lピペットチップ	エッペンドルフ	22491653	抗体および小容量酵素溶液の液体移動
1000 & mu;Lピペットチップ	エッペンドルフ	22491651	試薬および細胞懸濁液の液体移動
-20°冷凍庫	ハイアール	HYC-326	試薬(例:FBS、トリプシン)およびピペットチップの保管
200 & mu;Lピペットチップ	エッペンドルフ	22491652	小容量試薬(例:溶解液アリクォート)における精密な液体移動
10 & mu;Lピペットチップ	ハイアール	DW-86L626	膵臓組織溶解液およびクライオ保存オルガノイドの長期保存
50 mL遠心分離機チューブ	コーニング	430829	膵臓組織の溶解液および細胞懸濁の高速低温遠心分離
6井戸培養プレート	コーニング	3516	膵島オルガノイドおよびBMSCの培養
クラスIIバイオセーフティキャビネット	ハイアール	HR40-IIA2	豚膵臓組織の滅菌処理およびオルガノイド培養手術
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	3111	膵島オルガノイドの37°での潜伏;C、CO2環境
湾曲鉗子	上海華綺医療機器有限公司	HQ-1302	処理中の膵臓組織の取り扱い、高温滅菌
DMEMミディアム(高グルコース)	ウィーツン	318-025-CL	膵島オルガノイド誘導培養に使用
DMEM中(低血糖)	ウィーツン	319-015-CL	BMSC培養および組織処理のための基礎培地
胎児用牛血清(FBS)	Gibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)	10099141C	細胞培養および消化終了のために10%の体積比でDMEMに追加
H-DMEM-F12 媒体	ウィーツン	315-080-CL	オルガノイド通過中のトリプシン消化を終わらせるために用いられます
高温オートクレーブ	ハイアール	GR80DA	器具の滅菌(121°C、20分)とガラス製品
光学顕微鏡	オリンポス	CX43	膵島オルガノイドの異なる倍率(および時間;4、 と10、 と20)
眼科ハサミ	上海華綺医療機器有限公司	HQ-1201	豚の膵組織を1mm³に切断すること;高温オートクレーブで滅菌された断片
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15140122	培養液中の細菌汚染を防ぐために1%の体積比で使用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Gibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)	10010023	豚の膵臓組織と細胞洗浄のための洗浄バッファー
冷蔵遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	高速遠心分離は4度、Cは膵臓溶解液の調製および細胞ペレット採取のための
血清フリークリオパーソナリーソリューション	蘇州新賽邁バイオテクノロジー有限公司	#C40050	膵島オルガノイドの凍結保存に用いられ、-80度以前に細胞ペレットを再懸濁させる。Cストレージ