エリートボクサーの運動誘発代謝シフトを液体クロマトグラフィー質量分析法で解析するための標準化されたメタボロミクスプロトコル

サマリー

このプロトコルは、液体クロマトグラフィーとクアドルーポール飛行時間タンデム質量分析(LC-QTOF-MS/MS)および多変量データ解析に基づく標準化された血清代謝学ワークフローを記述し、エリート男性ボクサーの急性および短期回復に関連する代謝変動のプロファイリングを用いています。

要約

エリートボクシングは、従来の生理学的測定では完全に捉えられない急速な代謝変化を引き起こします。液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間タンデム質量分析法(LC-QTOF-MS/MS)に基づく標準化された非標的血清代謝学ワークフローが、スパーリング前、スパーリング直後、およびスパーリング後24時間以内のサンプルに適用され、7人のエリート男子ボクサーが対象となりました。ワークフローには標準化されたサンプル採取、統合された品質管理モニタリング、代謝物プロファイリング、多変量統計解析、経路解釈が含まれていました。急性スパーリングは解糖作用および糖新生に関連する代謝物の変化と関連し、24時間の時間点は硫黄代謝と関連していました。

ホスファチジルノシトールPI(16:0/18:2(9Z,12Z))はスパーリング直後の状態を強く識別し、チオ硫酸は24時間の回復状態と関連していました。これらの発見は、この7人のエリート男性ボクサーのコホートにおける運動関連代謝変化の再現性プロファイリングにこのワークフローを用いることを支持しています。このプロトコルは急性運動および短期回復の小規模な管理研究を目的としており、再現可能なサンプル取り扱い、統合された品質管理モニタリング、解釈可能な下流解析を重視しています。

概要

エリートボクシングは、2分間の高強度スパーリングを3ラウンドずつ行うもので、嫌気性と有酸素代謝の組み合わせに依存し、エネルギー基質、酸化ストレス媒介物質、組織修復関連代謝物の急速な変化を引き起こします。従来の評価(血中乳酸および心拍数)は、孤立した生理学的エンドポイントのみを捉え、「スパーリング前のベースライン→スパーリング後の急性ストレス→24時間の回復にまたがる全身的かつ相互に関連した代謝変化を解決できません。

液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間タンデム質量分析法によって可能となる非標的メタボロミクスは、生物サンプル中の小分子代謝物を包括的にプロファイリングすることでこの制約を解消します。通常、数千の代謝ピークを検出し、厳選されたデータベース^1、2、3との統合を通じて数百から数千の代謝物に注釈を付けます。このアプローチは、従来の方法が見落としている微妙な代謝動態を明らかにできますが、既存のボクシングに焦点を当てたメタボロム研究では標準化が行き届いていません。管理されたスパーリングプロトコルや厳格な品質管理(QC)ステップ、長期的な回復期間が省略されているため、再現性のない結果が出てしまい、トレーニングや回復戦略への応用が限られています ^4,5。

液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間タンデム質量分析に基づく標準化されたメタボロミックワークフローを提案し、エリートボクサー向けに最適化され、急性運動反応と遅延回復の両方を捉えます。プロトコルには、一時的なストレスと持続適応を区別するための3つの重要な時間点(スパーリング前[T0]、スパーリング直後[T1]、スパーリング後24時間[T2])^{が含まれています。}重要な技術的特徴には、(1) 運動強度の一貫性を確保するための制御されたスパーリング(最大心拍数80–85%)^7,9;(2) 低存在比血清代謝物の感度検出のための高分解能LC-QTOF2,3,10;(3) 主成分解析(PCA)、直交部分最小二乗判別解析(OPLS-DA)、ペアワイズ統計検定を含む多変量および単変量解析による運動反応代謝物の同定 ^6,8,11;および(4)複数回の注入による検査の安定性を評価するための単一のプール血清QCサンプル(研究サンプルの均量混合)¹²。

このプロトコルは、スプリントやレスリングなど他の高強度・短時間スポーツにも適応できる可能性がありますが、その移行可能性にはスポーツ固有のコホートでの検証が必要です。本研究では、このワークフローがエリート男性ボクサーにおけるストレスと回復の代謝マーカーを特定するための予備的枠組みを提供します。このワークフローは、血清ベースの非標的代謝体学を用いた小規模でよく特徴づけられた運動コホートにおける急性運動および短期回復の管理研究に最も適しています。他のスポーツ、女性アスリート、より多様な集団、または追加の検証なしの長期適応研究への直接的な外挿には適さない場合があります。

本研究は、エリートボクシングスパーリングによって誘発される血清代謝変化の特徴付けと、急性スパーリング後の反応と24時間の回復関連変化を区別することを目的としました。急性スパーリングは主にエネルギー代謝に影響を与え、24時間の回復は酸化還元バランスや組織修復に関連する代謝物と関連していると仮説が立てられました。全体のワークフローは 図1に示されています。

プロトコル

すべての手続きは、首都体育スポーツ大学人間研究倫理委員会(承認番号2025A005)の承認に従って実施してください。

注意:すべての人間の血液検体は感染の可能性があるとみなしてください。手袋、実験用コート、そして目の保護具を着用してください。機関のバイオセーフティ手順に従い、静脈血液採取、血清取り扱い、廃棄物処理を行います。サンプル取り扱い後に作業面の除染を行います。

注意:メタノール、アセトニトリル、蟻酸は有害な化学物質です。認定された化学煙幕で溶媒の準備、抽出、再構成の工程を担当します。皮膚への接触や吸入は避けてください。溶剤廃棄物は承認された容器に集めてください。

1. 研究参加者の募集と準備

1. 20〜28歳のエリート男子ボクサー7名をリクルートし、60〜75kg級で競技します。
2. 各参加者が少なくとも5年の専門的な研修経験を持ち、代謝疾患の既往歴がないことを確認してください。
3. 過去6か月間に筋骨格系損傷を負った参加者は除外します。
4. 検査前に3日間、炭水化物55%、タンパク質25%、脂肪20%の標準化された食事を実施するよう指示します。
5. 検査前の48時間、最大心拍数の60%以上の激しい運動を避けるよう指示してください。
6. 採血前に12時間断食するよう指示します。断食期間中の水分摂取を許可してください。
7. スパーリングの1週間前に段階的な運動テストを行い、最大心拍数を測定してください。
8. 疲労するまで3分ごとにトレッドミルの速度を1km/h上げます。測定された最大心拍数を使ってスパーリングのターゲット強度を定義します。

2. スパーリングプロトコルと血清サンプル採取

1. 標準的な6×6mのボクシングリング、16オンスのグローブ、胸ストラップ心拍計を用意してください。
2. 標準化された10分間のウォームアップを行い、8 km/hで5分間ジョギング、3分間のダイナミックストレッチ、2分間のシャドーボクシングで構成されます。
3. スパーリングプロトコルは以下のように実行します。
   1. 各ラウンド2分のスパーリングを3ラウンド行います。
   2. 対戦相手は体重クラスや技術レベルで対戦します。
   3. ラウンド間には1分間の休憩を設けてください。
   4. セッション中は30秒ごとに心拍数をモニターしてください。
   5. スパーリング強度を調整し、心拍数をMHRの80%〜85%に保つ。
   6. 心拍数がMHRの90%を超えた場合はスパーリングを一時停止してください。心拍数が目標範囲に戻った後にのみスパーリングを再開してください。
4. 以下の3つの時点で血清サンプルを採取してください。
   1. T0のウォームアップから30分後に8mLの血清分離チューブ(SST)を用いて肘部前静脈から5mLの静脈血を採取します。
   2. 新しいSSTを使って、T1の最終ラウンドから5分以内に5mLの静脈血を採取してください。
   3. 新しいSSTを使ってT2のT0と同じ時間帯に5mLの静脈血を採取してください。参加者がT0と同じ断食制限と活動制限を守るようにしてください。
5. 血液サンプルの処理は以下の通りです。
   1. 収集後1時間以内に、各SSTを11000gで 4°Cで15分間遠心分離×
   2. 上部血清層の2〜3 mLを1.5 mLのクライオビアルに移す。
   3. クライオビアルはすぐに-80°Cで保存してください。
   4. 各サンプルは凍結融解サイクルを最大2回までに制限してください。
6. プールされたQCサンプルを準備してください。
   1. 21点すべての研究血清サンプル(7名の参加者からT0、T1、T2)を氷で解凍し、その後QC調製を行った。
   2. 各試験サンプルから均等なアリコートを1本の1.5 mLチューブに移します。
   3. 各サンプルから20μLを移し、最終的な420μLのプールQC体積を得ます。
   4. プールされたQCサンプルを10秒間渦巻かせます。
   5. プールされたQCサンプルをLC-QTOF-MS分析中に繰り返し注入し、機器の安定性と信号ドリフトを監視します。

3. 血清サンプルからの代謝物抽出

1. -80°Cから凍結した血清サンプル(T0、T1、T2、QC)を除去します。 サンプルを氷で30分間解凍し、それぞれ10秒ほどボルテックスします。
2. 100μLの血清を1.5mLの低タンパク質結合マイクロ遠心分離機チューブにピペットします。メタノール:アセトニトリル(1:1、v/v)からなる氷冷抽出溶媒500μLを加えます。30秒のボルテックス。
   1. 抽出時に内部標準を加えないでください。最終的なワークフローにおいて、内部標準に基づく抽出補正や下流正規化を適用しないでください。
3. 4°Cの氷水浴で300W、40kHzで10分間、管をソニック処理します。チューブを-20°Cで1時間培養し、タンパク質を沈殿させます。
4. チューブを13200 g × 4°Cで20分間遠心分離します。 約450μLの上清液を新しいマイクロ遠心分離機チューブに移し、ペレットを有害な生物廃棄物として廃棄します。
5. 上清液は37°C、-0.09MPaの真空濃縮器で45分間乾燥させ、完全に乾燥するまで乾燥させます。
6. 乾燥抽出物を100μLのアセトニトリル水(1:1、v/v)で再構成します。30秒のボルテックス。
   注:アセトニトリル:水(1:1、v/v)は、このワークフローで使用された逆相クロマトグラフィーカラムと互換性があり、予備試験で目に見える沈殿を生じなかったため使用されました。
7. 再構成された溶液を13200gで遠心分離×4°Cで15分間処理します。 約90μLの上清液を200μLインサート付きのLC-MSガラスバイアルに移し、バイアルを密封します。

4. 液体クロマトグラフィー質量分析検出

1. 液体クロマトグラフィー系に血清代謝学に適した逆相クロマトグラフィーカラム(材料表参照)を設置します。コラムオーブンを40°Cに設定します。
2. 超純水中に0.1%(v/v)の蟻酸として移動相Aを準備します。モバイル相Bをアセトニトリル中に0.1%(v/v)の蟻酸として準備します。
3. 両方の移動相を0.22μmの膜を通してろ過します。
4. 流量を400μL/min、注入量を5μLに設定します。
5. 勾配は0.0–0.5分、Aは95%、Bは5%;0.5〜5.5分、50% Aおよび50% Bへの線形勾配;5.5〜9.0分、5% Aおよび95% Bへの線形勾配;9.0〜10.5分、5%A、95%B;10.5〜12.0分、95%Aと5%Bに戻し、再平衡します
6. 液体クロマトグラフィーシステムを、電気スプレーイオン化源を備えた高分解能質量分析計に接続します。
7. 正イオンモードとマイナスイオンモードで別々のランでデータを取得してください。
8. 正イオンモードでは、キャピラリー電圧を2500V、コーン電圧を30Vに設定します。
9. 負イオンモードでは、キャピラリー電圧を-2000V、コーン電圧を25Vに設定します。
10. 溶け込みガスの温度を500°C、溶け込みガス流量を800 L/h、円錐ガス流量を50 L/hに設定します。
11. m/z 50–1200のデータを0.2秒のスキャン時間で取得します。
12. 0 Vで低衝突エネルギー、10〜40 Vで高衝突エネルギーを用いてタンデム質量分析データを取得します。
13. サンプルを次の順番で実行します:再構成溶媒の空白注入1回;プールされたQCサンプルを3回連続で注入しました。すべての試験サンプルは、5サンプルごとにブランク注射1回とQC注射1回を行ったもので、最後のQC注入;そして最後のブランクインジェクション
14. プールQC相関解析および主成分解析(PCA)クラスタリングを用いて、両方のイオンモードにおけるデータ品質と分析安定性を評価します。
15. プールされたQC相関係数が0.8を超える場合は、解析シーケンス全体で許容される解析的安定性を示すと解釈します。

5. データ前処理および統計解析

1. 生の液体クロマトグラフィー質量分析ファイルをデータ処理ソフトウェアにインポートし、保持時間アライメント、デコンボリューション、ピークアラインメント、特徴抽出を行います(材料表参照)。
   1. 最初のプールされたQC注入をアライメント基準として選択します。
   2. 選択したソフトウェアのデフォルトワークフローを使って、保持時間アライメント、デコンボリューション、ピークアライメントを実行します。保持時間許容範囲を±0.1分、質量許容範囲を5ppm±使用してください。
   3. ピークピッキングを行い、少なくとも1つのグループでサンプルの80%以上に存在する強度のカウントを保持します。
   4. どちらのイオンモードにも追加の後処理正規化は適用しないでください。
   5. m/z、保持時間、ピーク面積値を含む処理済み特徴表をエクスポートします。
   6. Log2変換はすべてピーク強度を保持します。
   7. 欠損値を各特徴の最小正の値の5分の1で補足します。
   8. 各特徴量を平均中心にし、標準偏差で割ってから多変量解析を行います。
   9. 変換・拡大行列を主成分解析(PCA)、部分最小二乗判別解析(PLS-DA)、直交部分最小二乗判別解析(OPLS-DA)、クラスタリング、相関解析に用いてください。存在量プロットには元の処理済み特徴強度を使いましょう。
2. ヒトメタボロームデータベース(HMDB)、京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)、該当する場合はLIPID MAPSなどの公開メタボロミクスデータベースと照合して特徴を照合して代謝物を注釈します。
   1. 各注釈には前駆体イオン質量誤差、同位体分布、並列質量分析の断片マッチングで評価します。各基準に最大20点を割り当てます。
   2. 前駆体イオン質量誤差ウィンドウを100 ppm、フラグメントイオン質量誤差ウィンドウを50 ppm適用します。固定の保持期間のウィンドウを適用しないでください。
   3. 注釈は合計60点中40点以上保持してください。得点の低い注釈は除外します。
3. 比較群を明示的に次のように定義します:A = T0(スパーリング前)、B = T1(スパーリング直後)、C = T2(スパーリング後24時間)。
4. 統計計算ソフトウェアおよび関連する解析パッケージ(材料 表参照)を用いて下流の統計解析を行います。
   1. 単位分散スケーリング後に主成分分析(PCA)を実行し、スコアプロットを可視化します。
   2. A対B、B対C、A対Cのモデルを部分最小二乗判別解析(PLS-DA)および直交部分最小二乗判別解析(OPLS-DA)モデルを構築します。
   3. サンプル数が7以上の場合は7重クロスバリデーションを用いてください。サンプル数が7未満の場合は、フォールドの数をサンプル数と等しくします。
   4. モデルの妥当性を評価するために200回の置換検定を実施します。
   5. 差異代謝物は以下の閾値を適用してスクリーニングします:フォールド変化(FC)≥2またはFC ≤ 0.5、投影における可変重要度(VIP)≥1、t検定 P. <0.05。
   6. 火山プロットや関連する統計図を作成し、ペア比較を行います。
   7. log2変換および単位分散スケール行列を用いてヒートマップを生成します。
   8. 有意性閾値P≤0.05の相関ヒートマップを作成し、最大20の代謝物を表示します。
   9. k-平均群集化の前に最適なクラスタ数を決定します。単位分散スケーリング後にk-平均クラスタリングを行います。
   10. 元の処理された特徴強度から存在量バープロットを生成します。
   11. ペアワイズ比較の重複を要約するためのベン図を作成してください。
   12. 選択された代謝物の受講者動作特性(ROC)解析を行います。診断性能は曲線下面積(AUC)で評価します。
5. 適切なバイオインフォマティクスパッケージ内の経路濃縮関数を用いて、差代謝物をKEGG経路にマッピングします(材料表参照)。
   1. P.0.05で経路を解釈<。最終解析記録には複数回検定の補正は報告されませんでした。

結果

LC-QTOF-MS/MSデータの品質管理(QC)検証

信号の安定性と再現性を評価するため、プールされたQCサンプルを両イオンモードで繰り返し注入しました。プールQC注入間のスピアマン相関係数は両イオンモードで0.8を超え、解析シーケンス全体で安定した機器性能を示しました。全試験サンプルおよびQC注入のPCAでは、QC注入のクラスターが厳密に分布し、明確な外れ値が見られず、分析的安定性が許容されることを支持しました(図2)。QC拡散や大きな空白キャリーオーバーは観察されませんでした。いずれの発見も分析性能が最適でないことを示し、再注入やバッチ除外が必要だったでしょう。これらの観察結果により、分析ワークフローが両方のイオンモードで適切に動作していることが確認されました。

時間点ごとのグローバル代謝差異

ディスカッション

この標準化されたワークフローは、エリートボクシングスパーリングおよび短期的な回復に関連する代謝物の変化を、小規模で管理されたコホートで特徴づけました。プールQC注入、QCベースの相関解析、PCAクラスタリング、多変量解析を組み合わせて、許容可能な解析安定性を支持しました。プロトコルの成功は主に4つの要素に依存していました。すなわち、スパーリング強度を最大心拍数の80%〜85%以内に保つこと、採血後1時間以内に血液サンプルを処理すること、各サンプルを最大2回の凍結融解サイクルに制限すること、そして繰り返しのプールQC注射による分析シーケンスのモニタリングです。本データセットでは、プーリングQC相関係数>0.8、PCAスコアプロットにおけるQCクラスタリングの厳密さ、そして主要な空白キャリーオーバーの不在によって、許容可能な方法性能が支持されました。プールされたQCサンプルでPCA分散が広がったり、プールされたQC相関が0.8を下回ったり、空白のキャリーオーバーが明らかになった場合は、分析シーケンスを再確認し、影響を受けたサンプルまたはバッチを再注入または除外する必要があり...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬	アセトニトリル	メルク	LC-MSグレード、CAS 75-05-8
試薬	メタノール	メルク	LC-MSグレード、CAS 67-56-1
試薬	蟻酸	TCI	LC-MSグレード、CAS 64-18-6
消耗品	真空管猫 血清血栓活性化剤	グライナー・バイオ・ワン	8mL血清血栓活性化チューブ
消耗品	ナルゲン クライオジェニックバイアル	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	1.5 mL、外ネジ
消耗品	プロテインLoBindチューブ	エッペンドルフ	キャット。0030108442、1.5mL
ガラス製品	インサート付きのねじトップガラスバイアル	アジレント	2 mL バイアルに200 & μ;L型ガラスインサート;猫を挿入。番号5183-2090
消耗品	ミレックス-GPフィルター	メルク	キャット。いいえ。SLGP033RS、0.22 & mu;M膜
楽器	カスタムボクシングリング 6x6 m	ムエタイスポーツ	6 & times;6mトレーニングリング
消耗品	プロスタイル2 ボクシンググローブ	エヴァーラスト	16オンス
楽器	ポーラーH10	ポーラー	胸ストラップ心拍センサー
楽器	クエーサー	H/P/コスモス	モーター付きトレッドミル
楽器	遠心分離機 5425 R	エッペンドルフ	冷蔵マイクロ遠心分離機
楽器	ブランソニックCPX2800	エマーソン/ブランソン	40 kHz デジタル超音波浴
楽器	サバント・スピードバックSPD1030	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	統合真空濃縮器
楽器	VWRミニボルテックスミキサー	アヴァントル / VWR	キャット。番号10153-688
楽器	TSX ULTフリーザー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	モデルTSX50086A
楽器	アクイティUPLC Iクラスプラス	水域	UHPLCシステム
楽器	Xevo G2-XS QTof	水域	QTOF質量分析計
楽器	アクイティUPLC HSS T3カラム	水域	P/N 176001132、1.8 & mu;m, 2.1 & times;100mm
ソフトウェア	マスリンクス	水域	バージョン4.2
ソフトウェア	プロジェネシスQI	水域	バージョン2.3
ソフトウェア	R	R統計計算財団	バージョン 3.6.1
ソフトウェア	PRCOMP	基底R	基底R関数
ソフトウェア	ロプルス	バイオコンダクター	Rパッケージ
ソフトウェア	フィートマップ	クラン	Rパッケージ
ソフトウェア	コープロット	クラン	Rパッケージ
ソフトウェア	クーンズ	基底R	基底R関数
ソフトウェア	NbClust	クラン	Rパッケージ
ソフトウェア	ベン	クラン	Rパッケージ
ソフトウェア	メタボアナリストR	CRAN / Xiaラボ	バージョン1.0
ソフトウェア	pROC	クラン	バージョン 1.15.0
ソフトウェア	clusterProfiler	バイオコンダクター	バイオコンダクターパッケージ
データベース	ヒトメタボロームデータベース(HMDB)	HMDBです	オンラインデータベース
データベース	京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)	ケッグ	オンラインデータベース
データベース	脂質マップ	脂質マップ	オンラインデータベース