自発性脳内出血後の院内肺感染症に関連するサイトカインおよび炎症性遺伝子多型

サマリー

本回顧的研究は、入院後の早期採血、血清サイトカインおよびToll様受容体の測定、炎症性遺伝子多型の遺伝子型解析、自然性脳内出血患者の感染リスク評価に関する再現可能なワークフローを提示します。

要約

院内内性肺感染症は、自然発生性脳内出血後の一般的な合併症であり、神経の回復を悪化させ、入院を長引かせ、臨床負担を増やす可能性があります。この後ろ向き臨床・実験室研究は、原発性自然性脳内出血後の院内肺感染症に関連する炎症バイオマーカーおよび宿主免疫遺伝プロファイルを評価するための再現可能なワークフローを提供します。患者は入院後に発生した院内肺感染症の有無によって分類されます。末梢静脈血は、入院後初期の標準化された事前分析条件下で採取されます。血清は分離され、分離され、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α、TLR2、TLR4、TLR9の酵素結合免疫吸着アッセイ測定のために保存されます。並行して、抗凝固全血からゲノムDNAを抽出し、選択されたサイトカインおよびトール様受容体関連遺伝子座のポリメラーゼ連鎖反応制限断片長多型型解析に用いられます。ワークフローには、サンプル取り扱い、重複ELISA測定、DNA純度評価、遺伝子型コール、リピートゲノタイピングの品質管理手順も含まれています。統計解析には、臨床的特徴とバイオマーカーレベルのグループ間比較、ハーディ・ワインバーグ平衡検定、遺伝子型および対立遺伝子関連のロジスティック回帰分析、関連する臨床共変量の調整、複数遺伝子比較における偽発見率の補正が含まれます。この臨床的、炎症的、免疫遺伝学的なワークフローの組み合わせは、自然性脳内出血後の感染リスクプロファイルの特性評価に役立つ可能性がありますが、通常の臨床適用前には前向きな多施設検証が必要です。

概要

自然性脳内出血(ICH)は、脳血管の非外傷性破裂によって引き起こされる重度の脳卒中の亜型であり、神経学的な死や障害の主な原因となっています。臨床的には、ICHは一般的に一次性か二次性に分類されます。原発性ICHはほとんどの症例を占め、主に高血圧性動脈症または脳アミロイド血管症に関連して^います。これに対し、二次性ICHは動脈瘤、動静脈奇形、桃山谷病、凝固障害などの構造的または血液学的な原因と関連しています。ICHは虚血性脳卒中に比べて脳卒中全体の割合は小さいものの、短期死亡率と長期的な機能負担が不釣り合いに高い2,3,4,5を負います。

ICH後の主要な入院合併症の中で、院内性肺感染症は特に頻繁に、臨床的に影響を及ぼす。過去の研究では、脳卒中や脳内出血後の入院患者のかなりの割合で肺感染症が起こり得ることが示されており、入院期間の延長、医療負担の増加、神経学的な回復の低下、死亡率の増加と関連しています^6,7,8。この合併症の臨床的重要性は呼吸管理だけにとどまりません。意識低下、嚥下や咳反射の障害、固定、機械的気道支持、侵襲的な排尿処置は、ICH後の急性期における感染リスクを高める可能性があります。同時に、肺感染症は全身炎症をさらに悪化させ、酸素供給を妨げ、神経集中治療を複雑にし、二次的な損傷の進行を増幅させる可能性があります。

この関係は生物学的に妥当であり、ICHは局所的な脳血管イベントであるだけでなく、全身免疫調節障害の引き金でもあるためです。急性脳出血は炎症性カスケードを引き起こし、自然免疫シグナル伝達を変化させ、神経炎症と末梢宿主防御のバランスを乱すことがあります。この文脈では、同様の臨床管理下でも一部の患者は院内感染にかかりやすくなることがあります。したがって、ICH後の肺感染症は、単にベッドサイド曝露や支持療法の結果として捉えるべきではありません。また、宿主の炎症活性化や免疫応答性の違いを反映している可能性もあります。

この合併症の臨床的関連性にもかかわらず、早期リスク階層化の実践的なアプローチ^{は依然として}限られています。ICH後肺感染症に対する既存の臨床リスク層別アプローチは、神経学的重症度、年齢、嚥下障害、併存疾患、侵襲的手技、機器被曝期間などのベッドサイドおよび入院関連の変数に依拠することが多いです。これらのツールは、救急、集中治療、神経集中治療の現場で迅速に適用できるため臨床的に有用です。しかし、臨床変数だけでは、神経学的重症度が同等でケア曝露が異なる患者が異なる感染結果を示す理由を完全に説明できない可能性があります。炎症バイオマーカーや宿主免疫遺伝因子は、特に予防的監視や呼吸管理の意思決定が行われる入院後初期の期間において、生物学的感受性に関する追加情報を提供する可能性があります。

サイトカインは免疫および炎症反応の中心的な媒介者であり、トール様受容体(TLR)経路は病原体の認識や自然免疫活性化において重要な役割を果たします。血清サイトカインおよびTLRタンパク質の測定は、早期の全身炎症活性化のスナップショットを提供しますが、選択された免疫遺伝子多型はサイトカイン産生、受容体シグナル伝達、炎症調節におけるより安定した宿主の違いを反映している可能性があります。臨床評価単独と比較すると、バイオマーカーと多型性を組み合わせたワークフローは、現在の炎症状態と各患者の基礎となる免疫反応の両方を捉えることができます。このアプローチはベッドサイド臨床評価に代わるものではなく、自発的な感染性肝炎後により厳密な感染監視が必要な患者の特定に役立つ検査室および宿主遺伝情報を加えることで補完することを目的としています。

この基礎に基づき、自発性ICH患者が院内肺感染症を発症した場合、感染がない患者と異なる免疫関連遺伝的多型分布を示すと仮説を立てました。この仮説を検証するため、本研究では、原発性自発性ICH患者の入院後早期血清サイトカイン、TLR2、TLR4、TLR9の血清タンパク質レベル、および選択された炎症性遺伝子多型を解析しました。このワークフローは、急性入院時に採取された末梢血、ELISAベースのタンパク質定量、PCR-RFLPベースの遺伝子型解析、院内性肺感染症有無の患者の統計的比較を用いています。この目的は、感染リスクに関連する炎症性および宿主遺伝的プロファイルを再現性のある枠組みで特徴づけ、急性期病院環境で高リスク患者の早期認識を支援することでした。

プロトコル

本研究は、中国浙江省嘉興市嘉興市第一病院付属病院の倫理委員会により承認されました(承認番号2025-LP-599)。人間参加者を含むすべての手続きは、機関の要件およびヘルシンキ宣言の原則に従って実施されました。血液採取およびデータ利用に関する書面によるインフォームドコンセントは、サンプル採取前にすべての参加者および/またはその法的に認可された代理人から取得されました。

このワークフローで使用されるすべての市販キット、試薬、消耗品、計測機器、ソフトウェア、製造元、カタログ番号、主要な運用仕様は材料 表に一覧化されています。

研究範囲、適格性、患者グループ分け

本研究は、2019年5月から2024年9月にかけて、浙江省嘉興市嘉興市嘉興大学付属病院の救急集中治療室または集中治療室に入院した原発性自然性脳内出血(ICH)患者を対象とした単一施設後ろ向き臨床・検査室コホート分析として実施されました。ICHの診断は、中国脳出血診断治療ガイドライン(2019年)に従い、頭蓋コンピュータ断層撮影または磁気共鳴画像法によって確定されました¹⁰。

患者は、画像診断で原発性自然間質性内臓病(ICH)を有し、症状発症から3日以内に入院し、主要な臨床変数が完全に揃っている場合、炎症バイオマーカーの測定や遺伝子解析のための末梢血サンプルを備えていることが条件でした。患者は、外傷性頭蓋内出血、二次性ICH、入院前または入院後48時間以内の肺感染症、医師の指示に反して退院した、入院後48時間以内の死亡、悪性腫瘍または自己免疫疾患の既往、または主要な臨床・検査・遺伝子型解析記録の不完全性がある場合を除外しました。スクリーニングの結果、360名の患者が適格基準を満たし、最終解析に含まれました。そのうち180人が入院中に院内肺感染症を発症し、180人は発症しませんでした。入院後に院内肺感染症が発生したかどうかに基づき、患者は肺感染症グループまたは非感染グループに割り当てられました。

最終グループ分け前に、画像診断、入院時間、感染時期、血液サンプルの入手可能性、臨床および検査記録の完全性を確認しました。このステップは誤分類を減らし、臨床比較、炎症バイオマーカーの測定、遺伝子型付けのための完全なデータを確保するために用いられました。

院内性肺感染症の定義

院内肺感染症は放射線学的証拠と臨床基準¹¹を組み合わせて定義されました。放射線学的確認には、胸部X線撮影またはコンピュータ断層撮影で新たなまたは進行性の浸潤性、定着性、またはグラウンドグラス病変が必要でした。さらに、以下の基準のうち少なくとも2つが認められなければなりませんでした:体温>38°C、膿性呼吸器分泌物、または末梢白血球数異常で白血球数が4<×10^9/Lまたは> 10 ×^9/Lである。

入院前に存在した肺感染症、または入院後48時間以内に診断されたものは院内性肺感染症とは分類されなかった。感染分類は放射線報告書、体温記録、呼吸器分泌物の記録、末梢血球計数結果、臨床診断記録を用いて検証されました。

バイオセーフティと廃棄物処理

ヒト血液、血清、血液由来DNAは標準的なバイオセーフティレベル2の予防措置のもと取り扱われました。検査室の職員は、血液処理、血清アリクォート、ELISA検査、DNA抽出、PCR調製、ゲル電気泳動、制限消化、紫外線可視化の際に手袋、実験用コート、マスク、防護用アイウェアを着用しました。血液チューブは処理前に漏れや破損がないか検査されました。遠心分離はキャップ付きのチューブや、利用可能な場合は密閉された遠心分離バケットを使用して行われました。

シャープはすぐに認可されたシャープス容器に捨てられました。血液に汚染されたチューブ、ピペットの先端、手袋、ELISAプレート、その他の使い捨て消耗品は生物学的実験廃棄物として廃棄されました。液体生物廃棄物は処分前に機関の手順に従って消毒されました。アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、染色試薬、電気泳動関連材料は、機関の化学廃棄物および実験室廃棄物の要件に従って廃棄されました。

PCR試薬の調製、DNAテンプレートの添加、増幅生成物の取り扱い、制限分解、ゲル電気泳動は可能な限り分離され、汚染を減らしました。PCRおよびDNA処理にはエアロゾル耐性ピペットチップが使用されました。紫外線可視化は保護シールドやゲル記録システムのみを用いて行われ、目や皮膚への直接紫外線曝露は避けられました。

末梢血液採取とサンプル処理

分析前のばらつきを減らすため、入院翌朝8時に10 mLの末梢静脈血を採取し、少なくとも12時間の夜間断食の後に実施しました。5 mLは血清調製のために単純な真空管に血液を採取し、残りの5 mLはヘパリン化チューブでゲノムDNA抽出を行いました。

処理前に、各チューブは患者識別、採取時間、チューブタイプ、血液量、漏れ、目に見える凝固、粗大溶血などを確認しました。誤った標識、血容量不足、管漏れ、抗凝固チューブ内の目に見える血栓があるサンプルは、下流解析から除外されました。単純なチューブ内の血液は室温で60分間凝固させ、その後1,500× g で4°Cで10分間遠心分離しました。 血清上清液は細胞層を乱すことなく無菌の低タンパク質結合ポリプロピレンチューブに移され、0.5 mLの分割に分割され、−80°Cで保存され分析が行われました。

目に見える中等度または重度の溶血を示すサンプルはELISAベースの定量から除外されました。軽度溶血されたサンプルは記録され、一次サイトカイン解析には使用されませんでした。目に見える濁度、明らかなリピウム、残留体積不足、または繰り返しの凍結融解曝があるサンプルは検査前にフラグが立てられました。血清アリクォートは分析前に1回以上の凍結・融解サイクルを経ていません。

ELISAによるサイトカイン定量

IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-αの血清濃度は、市販のヒトサンドイッチELISAキットを用いて測定し、血清サンプル用に検証されました。血清アリコウトは解凍され、優しく混合され、溶血、濁度、脂肪血症、体積不足、凍結解凍履歴を調べた後に装填しました。

標準試験、ブランクウェル、血清サンプルは重複してロードされました。キットの説明書に従い、標準濃度の連続希釈とブランクコントロールを用いて各プレートに標準曲線が生成されました。光学密度は450 nmで測定され、570 nmで校正済みマイクロプレートリーダーを用いて基準補正が行われました。濃度は4パラメータロジスティック曲線フィッティングによって算出されました。

アッセイ結果は、標準曲線が適切な濃度応答パターンを示し、ブランクウェルで背景が低く、重複サンプルの変動係数が≤10%である場合にのみ受け入れられました。CVが重複したサンプルは、十分な体積が得られた時点で元の血清アリコートから再アッセイ>されました。信頼できる標準曲線範囲外のサンプルはキットの指示に従って希釈または繰り返し使用されました。標準の不一致、過剰な背景、明らかなエッジ効果を示すプレートも繰り返し表示されました。

データ受容に用いられた低い分析検出限界は、IL-1βの2.0 pg/mL、IL-6の1.5 pg/mL、IL-10の2.0 pg/mL、IL-17の3.0 pg/mL、IFN-γの4.0 pg/mL、TNF-αの2.5 pg/mLでした。最終的なサイトカイン値は、統計解析前にサンプル識別子、プレートマップ、重複読み取り記録、サンプル品質のノートと照合されました。

ELISAによる血清TLR2、TLR4、TLR9の定量化

血清TLR2、TLR4、TLR9のタンパク質レベルは、市販のヒトELISAキットを用いて血清標本で検証されたものを用いて測定しました。血清サンプルは解凍され、優しく混合され、サイトカイン測定に適用されたサンプル品質基準と同じ基準で検査されました。

標準サンプル、ブランクウェル、血清サンプルが重複分析されました。プレートは450nmで読み取り、参照補正は570nmで測定され、濃度は4パラメータロジスティック回帰を用いて計算されました。標準曲線が有効で、ブランクウェルが期待される背景範囲内であり、重複したCVが10%≤した場合に結果が受け入れられました。この重複CV閾値を超えるサンプルは、十分なサンプルが残った場合に再検査されました。

結果受容に用いられた低い分析検出限界は、TLR2で0.10 ng/mL、TLR4が0.12 ng/mL、TLR9で0.15 ng/mLでした。最終的なTLR2、TLR4、TLR9の値は、統計解析前にサンプル識別子、プレートマップ、重複表示記録、サンプル品質のノートと照合されました。

ゲノムDNA抽出

ヘパリン抗凝固血液からゲノムDNAをシリカ柱ベースの血液ゲノムDNA抽出キットを用いて抽出しました。抽出前に、抗凝固血液サンプルの適切なラベル表示、十分な体積、目に見える凝固、漏れ、保管状態が確認されました。

DNA純度と濃度は分光光度測定で評価されました。下流PCR増幅のためには、A260/A280比率が1.80から2.00のサンプルのみが受け入れられました。この範囲外のサンプルは、穏やかな混合後に再測定されました。異常な純度比率が維持された場合、十分な全血が残った時点でDNA抽出を繰り返しました。

DNAはヌクレアーゼフリー水で希釈され、作業濃度50 ng/μLにされ、PCR増幅まで-20°Cで保存されました。PCR設置前に、各DNAサンプルの濃度、純度、サンプル識別、凍結・融解履歴がチェックされました。

PCR-RFLP遺伝子型解析および遺伝子型呼びかけ

IL-1B +3954 C/T、IL-10-1082 G/A、IL-10-819 T/C、TNF-α-308 G/A、TLR2-196から174インチ/デル、TLR4 Asp299Gly、TLR4 Thr399Ile、TLR9 rs187084、IFN-γ +874 A/T、およびIFN-γ +2108 A/Gの遺伝子型特異的プライマー配列、期待されるアンプリコンサイズ、制限酵素、遺伝子型特異的消化パターンは 補足表1に記載されています。

PCR増幅は最終反応容積25μLで行われ、1×0 μLバッファー2.5 μL、dNTP混合物2.0 μL(各2.5 mM)、前方プライマー1.0 μL(10 μM)、逆プライマー1.0 μL(10 μM)、Taq DNAポリメラーゼ 0.25 μL(5 U/μL)、ゲノムDNA(50 ng/μL)2.0 μLを含みます。 および16.25μLのヌクレアーゼフリー水。PCRマスターミックスはクリーンなプレPCR領域で準備され、DNAテンプレートは最後に追加されました。各PCRランにはテンプレートなしの陰性対照が含まれていました。

熱的プロファイルは、95°Cで5分間の初期変性、その後95°Cで30秒の変性35サイクル、プライマーペアに応じて58〜62°Cで30秒のアニーリング、72°Cで30秒伸長、最終72°Cで7分間拡張するというものでした。PCR生成物は制限消化前に1.5%アガロースゲル上で最初に確認されました。

PCR増幅は、期待されるアンプリコンバンドが見え、無テンプレート対照では増幅が認められなかった場合にのみ認められました。弱いバンド、非特異的増幅、プライマー-ダイマー干渉、または陰性対照群での汚染を示す反応を元のDNAテンプレートから繰り返し行いました。

PCR産物は、製造元の指示に従い、37°Cで3時間にわたり制限性エンドヌクレアーゼと共に消化され、総消化量は15μLでした。消化断片はほとんどの遺伝子座に対して2.5%アガロースゲルで分離されました。TLR2-196から-174 in/del locusは8%ポリアクリルアミドゲル上で分離され、断片識別を改善しました。

制限消化は、断片パターンが期待される遺伝子型特異的な消化プロファイルと一致する場合のみ認められました。消化不完全、帯状のにじみつき、予想外の断片サイズ、または分離の不明瞭な反応が繰り返し見られました。核酸染色後、紫外線照射下でバンドが可視化されました。ゲル画像はサンプル識別子、遺伝子座名、実行日、ゲル番号とともに保存されました。

遺伝子型の割り当ては、2名の盲検検査官によって独立して実施されました。不協和または曖昧な遺伝子型コールは元のゲル画像を用いてレビューし、必要に応じてPCR増幅から繰り返しました。無作為に選ばれたサンプルの10%が品質管理のために再遺伝子型分けされ、一致率は99.2%でした。最終的な遺伝子型データは、サンプル識別子、遺伝子座名、遺伝子型判定、品質管理記録の確認後にのみ解析データセットに入力されました。

統計解析

統計解析は適切な統計解析ソフトウェアを用いて実施されました。臨床データセット、ELISAデータセット、遺伝子型データセットは非識別化された患者コードを使用して統合されました。分析前に患者コードの重複、不一致、欠損が確認されました。全患者が主要な臨床、炎症、遺伝子型データを持っていたため、完全症例戦略が用いられました。

適切な統計解析ソフトウェアでは、肺感染症の状態をグループ化変数として符号化し、「無肺感染症グループ」が参照カテゴリとして用いられました。連続変数はまずシャピロ・ウィルク検定を用いて正規性を検証しました。正規分布の連続変数は平均±標準偏差で表され、独立サンプルの学生のt検定を用いて比較されました。非正規分布の連続変数は四分位数範囲の中央値として報告され、Mann-Whitney U検定で比較されました。カテゴリ変数はカウントとパーセンテージで表され、必要に応じてカイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定で比較されました。

無肺感染群の遺伝子型分布は、関連解析前にハーディ・ワインバーグ平衡の有無を評価しました。遺伝子型および対立遺伝子の頻度はn(%)とまとめられました。多変数ロジスティック回帰モデルを用いて、肺感染症リスクのオッズ比および95%信頼区間を推定した。肺感染症の状態を従属変数として入力しました。遺伝子型、対立遺伝子、バイオマーカーの変数は各解析ごとに指定された独立変数として入力されました。

年齢と性別は事前に主要なモデルに入力されました。BMI、慢性閉塞性肺疾患、心臓疾患、脳脊髄液漏れ、ドレーンの留留時間、入院カテゴリーは、これらの変数が臨床的に関連性があったか、グループ間のベースライン不均衡を示したため、完全調整モデルに同時に入力されました。多重共線性は分散インフレーション係数(VIF)を用いて評価され、VIF<5.0が許容範囲とされました。

複数の多型性が検証されたため、Benjamini-Hochberg偽発見率補正が遺伝関連解析に適用^{されました。}遺伝的関連検査の P 値は小さい順に順にランク付けされ、Benjamini-Hochberg法に従って修正された有意性が決定されました。すべての検査は両側検定であり、 P <0.05は複数比較調整後に特に指定がない限り統計的に有意とみなされました。

最終出力は、原稿作成前にソースデータセット、ELISA品質管理記録、遺伝子型呼び出し記録、表値と照合されました。研究が後ろ向き観察デザインを用いたため、結果は因果効果ではなく関連性として解釈されました。

結果

臨床指標

基準臨床的特徴は表1にまとめられています。最終解析には、自然性脳内出血の患者360名が含まれ、入院中に院内性肺感染症を発症した患者180名とそうでなかった患者180名が含まれていました。年齢(62.4歳±6.8歳±7.0歳、>P.0.05)、性別分布(142/180、78.9% 対137/180、76.1%、P>0.05)、喫煙歴(94/180、52.2%対99/180、55.0%、P.05)、飲酒歴(99/180、55.0%対106/180、58.9%、P>0.05)、糖尿病(180人180人、10.0%21/180、180人、180人>、飲酒歴(180人中99人、55.0%、10.0%、10.0%、10.0%、10.0%、180人、180人、180人、180人、180人、1、飲酒歴、99/180人、58.9%、160人、16.0人、16.05人、糖尿病(180人中180人、10....

ディスカッション

自然性脳内出血(ICH)は依然として最も重篤な脳卒中亜型の一つであり、依然として重大な早期死亡と長期的な障害の負担を引き起こし続けています¹³。臨床現場では、ICH患者は特に病院内の合併症に脆弱です。なぜなら、神経系の損傷は気道保護を弱め、咳の効果を低下させ、可動性を制限し、侵襲的な支持療法への曝露を増やす可能性があるからです。これらの合併症の中でも、院内性肺感染症は入院期間を長引かせ、資源使用を増加させ、酸素供給の低下や全身性炎症ストレスによる神経回復をさらに損なう可能性があるため、特に重要です¹⁴。これらの臨床的現実は、感染リスクが高い患者の早期特定と急性期におけるより集中した監視の必要性を強調しています¹⁵。

本研究では、院内肺感染症を発症した患者は、慢性閉塞性肺疾患、心臓疾患、脳脊髄液漏れの増加、ドレーンの留置時間の延長、入院中のグラスゴー昏睡スケールスコアの低さな...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Human TNF-α ELISA Kit	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	KHC3011	ELISA kit for quantitative measurement of human TNF-α in serum.
Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit	Sigma-Aldrich / Merck	RAB0744-1KT	96-well ELISA kit for measurement of human TLR2 in serum or plasma samples.
Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric	Novus Biologicals / Bio-Techne	NBP3-11807	Colorimetric sandwich ELISA kit for measurement of human TLR4 in serum, plasma, or other biological fluids.
Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric	Novus Biologicals / Bio-Techne	NBP2-76574	Colorimetric ELISA kit for measurement of human TLR9 in serum samples.
Absorbance microplate reader	Agilent BioTek	800 TS	Microplate reader for ELISA optical-density measurement at 450 nm with reference correction at 570 nm.
QIAamp DNA Blood Mini Kit	QIAGEN	51104	Silica membrane-based kit for genomic DNA extraction from anticoagulated whole blood.
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Microvolume spectrophotometer for DNA concentration and A260/A280 purity assessment.
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermal cycler used for endpoint PCR amplification in PCR-RFLP genotyping.
PCR Master Mix, 2X	Thermo Scientific	K0171	Premixed PCR reagent containing Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, and reaction buffer; used for conventional PCR amplification.
Recombinant Taq DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0401	Alternative enzyme source for locus-specific PCR reactions when separate PCR components are used instead of 2X master mix.
Nuclease-free water	Thermo Scientific	R0581	Molecular-biology-grade water used for PCR setup, DNA dilution, and no-template controls.
Custom DNA primers	Sangon Biotech	Custom synthesis	Locus-specific primers for PCR-RFLP genotyping; primer sequences are listed in Supplementary Table S1.
Restriction endonucleases for PCR-RFLP	Thermo Scientific / New England Biolabs	Locus-specific enzymes listed in Supplementary Table S1	Restriction enzymes used for genotype-specific digestion of PCR products. The enzyme selected for each locus should match the digestion pattern listed in Supplementary Table S1.
Agarose I, molecular biology grade	Thermo Scientific	17850	Agarose for preparation of 1.5% and 2.5% gels used to confirm PCR products and resolve most RFLP fragments.
GeneRuler 50 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0371	DNA size marker for PCR amplicons and RFLP fragment-size estimation.
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	S33102	Nucleic-acid gel stain for visualization of DNA in agarose or acrylamide gels; used as a reduced-hazard alternative to ethidium bromide.
Horizontal agarose gel electrophoresis system	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base	Electrophoresis system for agarose gel separation of PCR and RFLP products.
Vertical PAGE electrophoresis system	Bio-Rad	Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001	Vertical electrophoresis system for 8% polyacrylamide gel separation when higher-resolution fragment discrimination is required.
Gel documentation system with UV or blue-light transillumination	Bio-Rad / equivalent laboratory system	Gel Doc XR+ or equivalent	Imaging system for documenting stained DNA bands after gel electrophoresis. Use UV shielding or blue-light mode where available.
Refrigerated centrifuge	Eppendorf / equivalent laboratory centrifuge	5424 R or equivalent	Refrigerated centrifuge used for serum separation at 1,500 × g and 4 °C.
−80 °C ultra-low temperature freezer	Thermo Scientific / equivalent laboratory freezer	Forma 900 Series or equivalent	Storage of serum aliquots before ELISA analysis.
IBM SPSS Statistics	IBM	Version 25.0	Statistical software used for descriptive statistics, normality testing, group comparisons, logistic regression, and model-output export.
Spreadsheet software	Microsoft	Excel for Microsoft 365	Used for data checking, plate-map organization, duplicate-value review, and preparation of merged analysis files before SPSS analysis.