方法論記事

マウスの腎虚血再灌流損傷におけるレーザースペックルコントラストイメージングによる微小血管灌流

DOI：

10.3791/70762

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2026年2月27日

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1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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マウスの右腎切除後の片側性腎虚血再灌流時の腎微小血管血流の変化を監視するために、レーザースペックルコントラストイメージングシステムを用いました。

要約

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レーザースペックル造影画像法(LSCI)は、広範囲にわたる浅い血液灌流を測定するための非侵襲的な技術です。高い時空間分解能により、LSCIは画像領域内の異なる領域における異質な血流変化を半定量化します。ここでは、マウスにおける片側性腎虚血再灌流損傷(IRI)時の血流記録のためのLSCI技術を示します。右腎摘出術後、マウスの位置とLSCIシステムの対物鏡の焦点を調整し、左腎臓が視野に入るようにしました。LSCIスキャンは、腎虚血の前、中、後に実施されました。さらに、関心領域(ROI)を選択することで、各領域の血流を同時に監視しました。LSCIの方法は腎臓の微小血管灌流を可視化し、血流のリアルタイムマッピングを可能にします。これは、マウスの腎臓IRIや類似の動物モデルにおいて、微小血管血流のモニタリングや介入が再灌流速度学および空間的均質性に与える影響を評価するために利用されることがあります。

概要

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溶血再灌流損傷(IRI)は急性腎障害(AKI)の主な原因の一つであり、患者の罹患率や死亡率の高さと関連しています1,2。腎血行動態の変化は、IR誘発性AKI1の重要な要因の一つです。IR誘発による微小循環機能障害は損傷の発生の主な原因であり、細胞の酸素欠乏やミトコンドリア機能障害を引き起こします3,4。したがって、血流変化をリアルタイムで監視することは、腎臓の虚血や再灌流の成功を確実にし、この疾患の動物モデルにおけるIRIの度合いを評価する効果的な方法です。

組織の微小血管灌流を測定する技術は複数あり、レーザードップラーフローメトリー(LDF)5、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド脱水素酵素(NADH)自家蛍光イメージング6,7,8、赤外線イメージング9、インドシアニングリーン(ICG)血管造影10などがあります。その中でも、赤外線イメージングやNADH自己蛍光イメージングは微小血管灌流を間接的に測定します。LDFは光学プローブを用いて局所血流5のみを監視し、スキャンLDFではI/R条件11での組織微小血管灌流のリアルタイム変化を監視するには十分に速くありません。ICG血管造影は腎閉塞血管も特定できますが、造影剤の投与が必要であり、使用は限られた測定回数に制限されます。レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)は、腎微量灌流をリアルタイムで監視するための効率的な非侵襲的手法です。血流動態に関連する空間的に解読された情報を生成するために用いられてきました。コヒーレントビームが粗い表面に照射されると、反射または散乱された光波は微細な経路差のために干渉し、「スペックル」と呼ばれる明暗の斑点パターンのランダム分布を形成します。LSCIは、レーザー光が組織を照射した際に生じる「動的斑点」のぼやけ度を解析することで、表浅組織の血流速度をマッピングします。12,14,15。本研究では、LSCIシステムは785 nmのレーザー波長、空間分解能3 μm、視野角は6.3 mm×4.7 mmおよび42 mm× 31 mmで調整可能で、最大120フレーム/秒の撮影速度を持ち、皮質微小血管灌流の高解像度リアルタイムマッピングが可能となりました。これらの利点を踏まえ、LSCIは火傷16、網膜灌流17、脳血流18、食道19、腸20など、さまざまな実験的および臨床的文脈で血流モニタリングに適用されています。

LSCIは主に表層組織の灌流を評価し、絶対流量ではなく相対流量を提供し、組織の光学特性や運動アーティファクトの影響を受ける可能性があることに注意が必要です。これらの固有の特性は画像データの解釈時に考慮されます。

この研究は、右腎摘出術を用いたモデルを用いて対側腎の曝露と画像化を促進し、LSCIを用いた片側腎I/Rマウスモデルにおける虚血の前後および微小血管灌流の変化をモニタリングし、腎表面の血流の空間的不均一性を示しました。

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プロトコル

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すべての動物処置はNIHの実験動物ケア・使用ガイドおよび実験動物のケア・使用ガイドに準拠し、汕頭大学医科大学の施設動物ケア・使用委員会の承認を受けています。性別および株に基づくIRI効果の違いを排除するため、本研究ではオスのC57BL/6Nマウスのみを使用しました。すべてのマウスは年齢と体重で一致させ、比較可能な結果を得ました。n=5のサンプルサイズを用い、技術的検証にLSCIを用いた従来の方法論的研究と一致した21。動物たちは人道的なケアを受け、実験後はCO2 吸入により安楽死させられました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

手術開始前に、レーザースペックルコントラストイメージングシステムを起動してください。本研究で使用されるシステムは785nmレーザーで動作します。作業距離は手術視野の約15〜20cm上に設定します。このシステムは空間コントラストアルゴリズムに基づき、レーザースペックル灌流装置(LSPU)内の血流を計算します。進行前に楽器が温まり安定していることを確認しましょう。

1. 動物の準備と開腹手術

  1. 各手術の前に手術台を消毒してください。必要なすべての材料(滅菌器具と綿棒、ガーゼ、希釈した麻酔薬、温熱パッド、血管クランプ、生理食塩水、除毛クリーム、綿球、縫合糸、皮膚消毒液、縫合糸)を手術台に準備し、置いてください。
  2. 痛みを和らげるために、マウスに30分前にメロキシカム(0.2 mg/kg体重、皮下注射)を投与します。
  3. 一定量の滅菌生理食塩水を清潔な容器に注ぎます。次にガーゼを一枚取り、中央に適切な開口部を切り出します。
  4. マウスに2.5%トリブロモエタノール(体重400 mg/kg、以前は滅菌生理食塩水で希釈)を腹腔内注射して麻酔します。
    注:右腎摘出術の過程で麻酔薬としてトリブロモエタノールを使用しました。また、1%イソフルランは長時間の血流モニタリングの麻酔に使用されました。
  5. ネズミを温熱パッドにテープで置き、脱毛クリームで腹部の毛を除去します。手術中は、直腸温度を37°C±0.5°Cに保つために温熱パッドを使用してください。
  6. 手術部位の皮膚をまず75%アルコールで消毒し、その後綿棒でヨードホアで消毒します。
  7. 鉗子を使ってマウスの足の指をつまんでください。マウスが痛みを感じないとしたら、ハサミで腹部の正中線に沿って垂直に切開します。皮膚を腹膜から優しく切り離し、腹膜を切り開いて腹腔に入ります。
  8. マウスにリトラクターを当てて視界を最適化し、手術部位をガーゼで覆い、ガーゼの隙間を腹腔に合わせて生理食塩水で湿らせます。

2. 右腎摘出術

  1. 綿棒を使って腸を優しくガーゼの片側に押し込み、右腎臓と周囲の組織を露出させます。ガーゼを折りたたんで腸を覆い、生理食塩水で湿らせて腸が乾燥しないようにします。
  2. 角度のある鉗子を使って右の尿管を持ち上げます。6-0縫合糸2本を尿管に通し、2か所で結紮を行います。
  3. 2つの結紮の間の尿管をマイクロシザーで切断します。
  4. 通常の生理食塩水で綿球を湿らせた後、細かい鉗子で綿球を持ち上げ、肝臓を優しく押し上げて綿球で固定し、右側の腎臓と血管を露出させます。
  5. 角度のある鉗子を使って、腎臓の側面に沿って腎臓の脂肪パッドを鈍く切り離し、腎動脈と静脈が完全に露出するまで続けます。
    注意:同時に腎臓の上にある副腎組織の塊を分離してください。
  6. 慎重に角度のある鉗子を腎動脈と静脈の下に滑り込ませ、通路を作ります。その後、6-0シルク編み縫合糸を血管の周りに巻きつけて結紮します。
  7. 腎臓近くの閉塞した腎動脈と静脈を切断します。腎臓と残った癒着組織を摘出します。
  8. 肝臓を固定するための綿球を取り除きます。

3. 虚血再灌流中のレーザースペックル造影画像(LSCI)による腎血流のモニタリング

  1. LSCIシステムと機器専用ソフトウェアを起動してください。
  2. 「オリジナル画像」と「プレビュー」をクリックすると、手術部位の生の未処理画像をご覧いただけます。
  3. マウスの位置を変え、鼻のコーンから 1%イソフルランを600 mL/分投与して麻酔を維持し、元の画像を観察しながらカメラの拡大率を調整して標的腎臓をはっきりと見ることができます。
  4. 同時 表示 をクリックすると、リアルタイムの血流画像が表示されます。倍率を2.5×に設定し画像を最適化するために自動 血流調整 を選択してください。次に、 血流パラメータを固定します。さらに、5000msごとに1フレームの映像を録画する設定も可能です。
    注:濡れた綿球は腎臓の位置を安定させ、周囲の臓器や組織を近づけないため、腎臓の領域と背景の区別を強めるために使用できます。
  5. 正方形面積パラメータのサイズを112に設定し、腎臓ビューで5つの正方形の領域を均一に固定された向きで配置します。 リアルタイム画像登録 と 記録 をクリックして、血流データの記録を開始してください。
    注意:この機械はレーザースペックル灌流ユニット(LSPU)を自動的に記録します。LSPUはROI内のリアルタイム血流単位を表し、解析に利用できます。検出過程で、呼吸に関連する動きや環境の変化により視野がずれることがあります。検出領域でシステムがこれを示した場合、電流記録は停止されるべきです。次に「 リアルタイム画像登録 」をクリックして再度 録画してください 。
  6. 30分の基準値を記録した後、左腎臓血管を囲む脂肪組織を分離します。止血鉗子を使ってマイクロクランプを掴み、左腎動脈と肺門近くの静脈に当てます。さらに30分間リアルタイム監視を続けてください。
  7. マイクロクランプを解除して再灌流を開始します。腎微小血管血流のリアルタイム回復を監視・記録します。
  8. 血流再灌流が少なくとも60分間モニタリングされたら、モニタリングを停止し、腹部切開部を7-0シルク編み縫合糸で縫合してください。

4. 術後の回復とケア

  1. 手術後の脱水を防ぐため、腹膜内1mLの生理食塩水注射で点滴を投与します。
  2. マウスはヒートパッドの上に置いておきましょう。意識を取り戻し、意識を取り戻し、自力で立て直せるようになるまで、注意深く観察してください。

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結果

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本論文は、IR誘発性AKI時の腎血流の変化を検出することを目的としました。したがって、右腎摘出術(図1A)と対側腎への介入外術(図1B)という共通マウスモデルを採用しました。IRI中の血流のリアルタイムモニタリングが必要だったため、マウスの操作は全過程を通じて器具領域で行われました(図1C)。

器具パラメータを設定し視野角を調整した後、まず30分間の血流測定を行い、腎微小血管灌流のベースラインレベルをモニタリングしました。最初の30分間で、マウスの腎微小血管内の血流は徐々に安定しました(図2A-C)。特に、虚血発生前に異なるROIの灌流レベルに不均一性が存在しました(図2...

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ディスカッション

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本研究は、マウスのIRI中に腎微小血管の血流動態をリアルタイムかつ高解像度で可視化するためのLSCIシステムの応用を説明しています。このプロトコルは、LDFのような空間分解能が限られた従来のエンドポイント測定や手法に比べて、腎臓微小循環内の局所的異質性を捉える二次元灌流マップを提供するという大きな利点を提供します。術中リアルタイムモニタリングにおけるLSCIの効率性と利用性は、この手法の重要な強みです。

雄マウスの虚血の前後および後の血流変化をモニタリングしたところ、30分間の虚血後に再灌流しても、マウスの腎微小血管血流は基準レベルに戻れず、腎門の近位または遠位領域に異質性が存在することがわかりました。結果はラット11で得られたものと一致しています。この初期充血の後、持続的な低灌流のパターンは、大脳モデル21で観察される微小血管反応と類似しており、臓器間で共通の病態生理メカニズムがあることを示唆しています。適切なROIの...

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開示事項

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著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

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この研究は広東省大学の革新的チーム研究プログラム(2022KCXTD009)の資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
吸収型キャニスター(麻酔用)深圳来月バイオテック有限公司、中国10-0210
アルコール、医療(75%)中国新疆、ヘンリヤ該当なし皮膚消毒剤
麻酔用ヴェポライザーミッドマークhttps://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
綿棒青島海諾生物工学有限公司、中国https://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
除毛クリームVEEThttps://www.veet.com.cn/jingchun/whx
ガーゼ包帯ウィナー医療有限公司、中国、深圳https://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
ヒートパッド任秋鼎生暖房設備有限公司、中国HD-1902体温維持のために
ヨードフォー溶液中国、錦仙市泰新康https://www.11467.com/nanchang/co/120661.htm皮膚消毒剤
イソフルランRWDライフサイエンス株式会社、中国R510-22-10吸入麻酔
レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)システム湖北尋威光電子技術有限公司、中国SIM BFI HR PROムーアFLPI-2相当系
メロキシカム祁路動物健康製品有限公司、中国https://en.qiludb.com/companion_animal/500.html体重1kgあたり0.2mg;鎮痛剤
マイクロクランプ上海医療機器(グループ)有限公司、中国W40140血管クランプ
生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム)中国、チセン製薬株式会社https://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
シルク編み縫合(6-0)揚州福大医療機器有限公司、中国http://www.fdma.com.cn/products_detail/12.html血管結紮のために
シルク編み縫合(7勝0敗)ウェゴ・テルモ(威海)医療製品有限公司、中国https://www.weigaoholding.com/創傷閉鎖には、湾曲針を用いた吸収性の外科用縫合
注射器(1 mL)山東安得医療機器有限公司、中国https://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.html26G針で
トリブロモエタノールシグマ・オルドリッチT48402-100G2.5%の解決策;注射麻酔

参考文献

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