ヒト骨細胞と脱細胞化細胞外マトリックスを用いて筋骨格系疾患をモデル化する3D骨培養プラットフォーム

サマリー

このプロトコルは、メタクリル化ゼラチン(GelMA)ハイドロゲルに埋め込まれたヒト骨細胞を用いて、脱細胞化細胞外マトリックスを補完した3D骨構造の製造を説明しています。この方法は低コストで拡張性が高く、基本的な実験機器と互換性があり、筋骨格系疾患の研究のための翻訳プラットフォームを提供します。

要約

骨粗鬆症などの筋骨格系疾患のモデル化には、ヒト骨生物学の重要な特徴を正確に再現する in vitro プラットフォームが必要です。従来の3D培養システムは細胞間および細胞間マトリックスの相互作用に関する貴重な洞察を提供しますが、高価な材料、バイオプリンター、または特殊なインフラへの依存が、より広範な普及を制限しています。ここでは、GelMAハイドロゲルに埋め込まれたヒト由来の骨細胞を用いて、提供された大腿骨頭から得られる脱細胞化細胞外マトリックス(dECM)を補う、3D骨構造を生成する堅牢かつコスト効率の高いプロトコルを説明します。このピペッティングを用いた方法により、標準的な実験機器を用いて生理温度(37°C)で再現可能で骨のような構造物を製造することが可能です。

その結果生まれた構成体は高い生存性と構造的完全性を維持し、免疫蛍光イメージングや分子アッセイなどの後続応用を支援します。患者由来のdECMの導入により、人間の骨の再構築や疾患進行をよりよく反映することで、翻訳関連性が向上します。このアプローチは、薬物検査、再生医療、骨生物学のメカニズム的研究のためのアクセスしやすく拡張可能なプラットフォームを提供します。全体として、このプロトコルは高コストのバイオプリンティング技術に対する実用的な代替手段を提供し、他の組織特異的dECMソースにも容易に適応可能です。

概要

この手法は、GelMAとヒト骨組織由来のdECMを組み合わせることで、骨粗鬆症を含む筋骨格系疾患のモデリングをコスト効率よく再現可能な3D細胞培養プラットフォームを構築することを目的としています。この戦略により、従来の二次元培養よりも生理的微小環境をより正確に再現する骨様構造物の生成が可能となり、生物学的に関連^{した条件下での}細胞間および細胞-マトリックスの相互作用の研究を支援します。患者由来の骨細胞および大腿骨頭から臨床的に採取されたdECMの使用は、翻訳価値を高め、in vitro実験と臨床研究のニーズとの実用的なつながりを提供します^。

この方法は、既存の3D培養およびバイオファブリケーションシステムの主要な制約に対処するために開発されました。これらのシステムはしばしばバイオプリンター、独自のバイオマテリアル、または高価な消耗品(例:マトリゲル)を必要とし、多くの^3,4でアクセスのしやすさを制限しています。さらに、合成ハイドロゲルはしばしば鉱化した骨細胞外マトリックスの生化学的複雑さや、常駐骨細胞の挙動を再現^{できません。}対照的に、このプロトコルはヒト骨由来のdECMを取り入れ、鉱物化成分、天然タンパク質、シグナル分子を保存しつつ、付加製造技術に伴うインフラの要求を回避しています⁶。

GelMAとdECMの組み合わせはいくつかの利点を提供します。GelMAは細胞の接着、生存性、分化をサポートし、37°Cで処理可能で、専用機器なしで細胞カプセル化を可能にします。低コストの紫外線(UV)源(365 nm)を用いた架橋は、さらにアクセス性を高め^ます。dECM補足は、合成置換物にはない組織特異的な手がかりを構造に富ませ、骨形成適合性を向上させ、免疫蛍光や分子プロ^{ファイリングなどの}下流アッセイを促進します。

この手法は、動物実験への依存を減らすヒト関連骨モデルの開発の現在の取り組みと一致しており、動物研究の翻訳精度は種^{間差によって}制限されることが多い^1,9,10。このプロトコルは3Rs¹¹の原則と整合しており、他の組織特異的dECMを用いた構成要素生成にも適応可能であり、軟骨、皮膚、心血管組織工学への応用の可能性を拡大^します。

全体として、この技術は生理学的に関連した条件下での骨生物学の研究にアクセスしやすく拡張可能なプラットフォームを提供します。通常の実験室インフラとの互換性やヒト臨床サンプルの取り込み能力により、学術や病院ベースの研究グループに特に適しています。この方法は骨プロセスのさらなる骨研究のプラットフォームを提供するだけでなく、再生医療や個別化治療開発におけるより応用的な応用の出発点となる可能性があります。

プロトコル

この研究はコンセプシオン保健サービスの科学倫理委員会によって承認されました。ヒト骨組織は、チリのコンセプシオン外傷病院で股関節置換手術を受けた患者から提供された大腿骨頭から、書面によるインフォームド同意のもと採取されました。サンプルは使用まで−80°Cで保管されていました。すべての手技は、研究におけるヒト組織の倫理的利用に関する機関ガイドラインに準拠していました。すべてのヒト骨組織は、チリのコンセプシオン外傷病院の患者から提供された大腿骨頭から採取され、コンセプシオン保健サービスの科学倫理委員会の承認とインフォームド同意の上に取得されました。すべての手技はヒト組織使用に関する機関ガイドラインに準拠しています。

1. GelMA合成

1. タイプAゼラチンA10gをリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.5)100mLに、60°Cで絶えず攪拌しながら溶解します。
2. 温度を50°Cに下げ、無水メタクリル5mLを0.5 mL/分の速度で1〜3時間優しくかき混ぜて加えます。
3. 反応混合物を40°Cで予温したPBSで5×希釈して反応を止めます。
4. 12〜14 kDaの膜を用いて、蒸留水3〜5L、40°Cで5〜7日間溶けて、毎日水を補充します。
   注意:(重要なステップ)未反応のメタクリル無水物を除去するために、毎日完全な水交換を必ず行ってください。
5. 透析液を24時間凍成し、凍結乾燥したGelMAは使用まで4°Cで保存します。

2. GelMAハイドロゲル製剤

1. GelMAハイドロゲルを10 mLのバッチで5、10、または15 w/v%で準備します。
2. 0.5、1.0、または1.5gの凍成GelMAを、50°Cの脱イオン水9.5mLに溶かします。
3. 溶液を37°Cまで冷やします。
4. Irgacure 2959フォトイニシエーター溶液0.5mL(絶対エタノール中に0.5 w/v%)を加えます。
5. 溶液を優しく混ぜ、37°Cの温度で0.22μmセルロースアセテート膜フィルターを通して無菌ろ過を行います。

3. 骨の細胞分離

1. 大腿骨の頭は徐々に25°Cまで溶けていきます。 大腿骨の亀頭を半分に切り、さらに小さな塊にします。
2. 作品を60°Cの無菌蒸留水に浸し、15分間(40kHz、連続音)ソニック処理します。
3. サンプルを60°Cで予熱し、200rpmで5分間振った蒸留水300mLで洗浄します。
4. 遠心分離機は1850g×25° Cで15分間加熱します。 洗浄と遠心分離機の工程を3回繰り返します。
5. 組織を60°Cで3%過酸化水素と0.02%過酸化酢酸を含む溶液で10分間超音波処理(40kHz、連続)で滅菌します。
6. 組織を70%エタノール300mLに移し、21°Cで10分間ソニックネート(40kHz、連続)を投与します。
7. サンプルを300 mLの蒸留水で2回洗浄し、60°Cで200 rpmで10分間振り、遠心分離機で1850 × gで25 °Cで15分間洗います。
8. まず、骨を-80°Cで4時間予凍し、その後、脱細胞化した骨を広い基底で24時間凍凍乾燥させ、均一乾燥を確保し、-40〜-60°Cの0.05 mbarで過剰なサンプル高さを防いでいます。
   注意:(重要なステップ)サンプルの容器内高さが2〜3cmを超えないようにし、不完全な凍結乾燥を防ぐこと。

4. 骨微粒子の調製

1. 脱細胞化された骨片を250 mLのエルレンマイヤーフラスコに滅菌液に入れ、均質化剤で均質化し、均一な白色溶液が得られるまで均質化します(補足動画1)。
2. 1850 × g で25°Cで15分間遠心分離し、上清液を捨て、300 mL蒸留水で200 rpmで攪拌しながら20分間洗浄します。最終遠心分離は1850× g で25°Cで15分間行います。
3. 生成された物質を48時間凍成(0.05 mbar、-40〜-60°Cで保存)し、使用まで-80°Cで保存します。
4. 冷凍乾燥した皮質骨または髄質骨を滅菌セラミックモルタルで機械的に粉砕し、細かい粉末を得るまで行います(図1)。
5. 粉末を200μmのメッシュまたはふるいに通し、最終材料を計量して-80°Cで保存します。
   注意:(重要なステップ)粉末が完全に乾いていることを確認し、凝集や不正確な粒子サイズ選択を防ぎます。

補足動画1:骨均質化手術。ホモジナイザーを用いて脱細胞化された骨片を均質化し、均一な白色懸浮液が生成されるまで行います。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

図1:骨微粒子の調製。(A) OV5ホモジナイザーによる均質化後の脱細胞化骨片と-80°Cでの保存。(B,C) 脱細胞化された骨を粉砕して細かい粉末にするための滅菌セラミックモルタル。(D) 篩分け後の最終脱細胞化骨微粒子。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

5. ボーンジェル製造

1. 10 w/v%のGelMAを50°Cの9.5 mL脱イオン水に溶かして調製します。
2. 溶液を37°Cまで冷却し、イルガキュア2959フォトイニシエーター溶液を加えます。
3. 溶液を37°Cに保ち、0.22μmフィルターを用いて滅菌ろ過を行います。
4. 1%のw/vで脱細胞化骨微粒子(DBMP)を加えます。
5. 気泡ができないように40°Cで慎重に混ぜ、ピペットで均一な懸濁液が得られて骨ゲル(BG)が形成されるまで上下にピペットを動かします。
6. BGは最大2週間4°Cで保存します。
   注意:(重要なステップ)細胞取り込み前にハイドロゲルをゲルリング温度(≥37°C)以上に保ち、早期固化を防ぐこと。

6. 骨細胞一次培養

1. 骨髄採取と初期洗浄
   1. 大腿骨頭内部から無菌手術器具を用いて骨髄組織を抽出し、粉砕します(図2)。
   2. 挽いた組織を無菌のペトリ皿に移します。
   3. α-MEM培地に抗生物質・抗菌液(ペニシリン100 μg/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、アンフォテリシン0.25 μg/mL)を補足して組織を3回洗浄します。
   4. ハンクのバランスソルト溶液(HBSS)で一度洗い流してください。
      注意:(重要なステップ)細胞の生存率を維持するために、組織採取と処理の間の時間を最小限にしてください。
2. 酵素的消化
   1. 組織を37°Cで25分間、穏やかに攪拌しながらコラーゲナーゼタイプI溶液でキュベートします。
   2. HBSSで洗いましょう。
   3. ステップ6.2.1–6.2.2をさらに2回繰り返します(合計3回のコラーゲン酵素消化)。
   4. 組織を37°Cで0.5 mMのエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)で25分間培養します。
   5. HBSSで洗い、EDTAの手順をさらに2回繰り返します。
   6. 最後に1回のコラーゲナーゼI型消化(37°Cで25分間)を行い、その後HBSS洗浄を行います。
      注意:(トラブルシューティング)消化不完全は細胞収率の低下につながることがあります。必要に応じて酵素培養時間を5〜10分延長してください。
3. 細胞回復と培養
   1. コラーゲナーゼ溶液を採取し、最終的なHBSS洗浄液を50mL遠心分離機チューブに移します。
   2. 室温で1,000 × g で5分間遠心分離機にします。
   3. 上澄液を廃棄し、ペレットを2 mLの完全なα-MEMに再懸濁させます。
   4. 細胞懸濁液を2つのT75培養フラスコに種まき、37°Cで5%のCO₂で培養します。
      注意:十分な合流が得られるまで、培地を2〜3日ごとに交換してください(図3)。

図2:骨髄組織の採取。 (A) 股関節置換手術で得られた大腿骨頭、細胞分離に用いられる髄質領域を示す。(B) 髄質骨片を細かく砕き、酵素による消化前に無菌のペトリ皿に入れる。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:一次骨細胞培養。骨細胞はヒト髄質骨から分離された後、T75内で単一層として付着・増殖します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

7. 3D細胞培養

1. BGハイドロゲルの量を37°Cで予温してください。
   注意:(重要なステップ)作業エリアに隙間風がないようにすること;冷却は早期ゲル化を加速させます。
2. 培養骨細胞を剥離し、500 × g で15 mLのチューブ内で5分間遠心分離します。
3. ペレットを200μLの培養培地に再懸浮させ、BGハイドロゲルと混合して最終細胞密度を少なくとも1000セル/μL(以下バイオインクと呼びます)にします。
4. 1000μLピペットでバイオインク50μLを吸引し、37°Cで保持して沈着させます。
5. 各構成体につき50μLのバイオインクを培養皿の各ウェルにピペット注ぎます(補足動画2);室温での物理ゲル化にはおおよそ5分を許容します(図4)。
6. 各ウェルを365nmの紫外線に1分間照射し、不可逆的な架橋(0.30 J/cm^²)を実現します。
7. 培養培地を加え、37°C、5%_CO2 で必要な時間帯に培養します。各時間点ごとに別々のプレートを使いましょう。

図4:3D細胞培養構造物の調製。 ピペッティング直後およびUV(365 nm)架橋直後の細胞含有GelMA構成体。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足動画2:3D細胞搭載構造物の準備。 UV架橋の前に、単純なピペッティング技術を用いて12ウェルプレートにハイドロゲルセル混合物を堆着します。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

8. 生体適合性試験

1. 生死染色
   1. 細胞を含む足場を所望の時間間隔で培養します。
   2. 滅菌PBSで優しく洗ってください。
   3. 構成体を暗闇で30分間インキュベートし、PBS中に0.2%エチジウムホモダイマー-1(EthD-1)と0.05%カルセインAMを含む生死溶液で培養します。
   4. カルセインAM(~495/515 nm)およびEthD-1(~495/635 nm)フィルター付きの蛍光顕微鏡で即時画像化できます。標準的なフルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)およびテキサスレッドフィルターセットは、それぞれカルセインAMおよびEthD-1検出に互換性があります。
   5. 緑色細胞質蛍光で生細胞を、赤色核蛍光で死んだ細胞を識別します。
      注:平面画像はImageJ(フィジー)で処理可能です。対物レンズ、露光時間、ゲイン、照明強度は比較対象のすべてのサンプルで一定に保たれ、信号飽和を避けるためのみ調整されました。自己蛍光による誤解を最小限に抑えるため、各実験内のすべてのサンプルで同じ取得設定を維持し、細胞を持たない足場/骨微粒子構造物の対照観察を用いて生体材料に関連する背景蛍光パターンを認識しました。これらのコントロールにより、画像解釈時に粒子由来の信号と真の丸みを帯びた細胞染色を区別できるようになりました。
2. Alamarblueの定量化
   1. 5%のアラマーブルー加工液を完全な培地に準備します。
   2. アラマーブルー溶液で37°C、5%のCO₂で光から保護された状態で2.5時間培養します。
   3. 上清液100 μLを96ウェルプレートに三重に移し、コントロールも含めて行います。
   4. 蛍光を360/40nmの励起と460/40nmの放射で測定します。
   5. 蛍光値を対照群に正規化して相対的な代謝活性を決定します。

結果

一次骨細胞はヒト大腿骨頭から成功裏に単離され、抽出後約5日後に培養で検出可能となりました。細胞は星状の形態を示し、骨細胞の形態に特徴的な相互連結ネットワークを形成し、成功した分離、付着、生存可能性を確認しました(図5)。

図5:3次元骨細胞培養の代謝活性。 アラマーブルーの代謝アッセイは、各時間間隔で骨細胞含有構造体を対象としています。対照群に対する有意な差がすべての複製で観察されています(ANOVA、P = 0.05)。

ディスカッション

提示されたプロトコルは、3D骨様構造を生成するためのアクセスしやすく翻訳的な手法を提供し、高価なバイオプリンターや独自の行列への依存など、現行手法の主要な制約に対応し^{ています。}GelMAとヒト脱細胞化骨細胞外マトリックス8を^{組み合わせることで}、標準的な実験機器だけで生理学的に重要な構成要素を製作できます。この単純さにより、資源が限られた環境での採用が可能であり、筋骨格系疾患のメカニズム研究に必要な重要な手がかりを保持しています。一次ヒト骨細胞¹⁴と臨床的骨組織の利用は、患者に関連する骨疾患のモデリングや、生理学的条件下での生体物質反応の評価を支援することで、翻訳応用性をさらに強化します(^6,15)。このプラットフォームを基盤に、骨粗鬆症由来細胞における薬物反応、骨細胞特異的遺伝子発現プロファイルの変化、骨再構築に...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959)	Sigma-Aldrich	410896-10G	ヒドロゲル重合用フォトイニシエーター
AlamarBlue細胞生存率試薬	Invitrogen	DAL1100	定量的生存率アッセイ用
Antibiotic-Antymycotic (100´)	Gibco	15240-062	培養液成分
細胞培養フラスコ（T75）	SPL Life Sciences	70075	骨芽細胞培養用
コラーゲナーゼタイプ1	Gibco	17100-017	骨サンプルの酵素分解用
コニカルチューブ、15mL	SPL Life Sciences	50015	ヒドロゲル調製用
DarkDawn D15-365 nm	DarkDawn	-	ヒドロゲルのUV架橋用
DPBS、粉末、カルシウムなし、マグネシウムなし	gibco	21600069	ヒドロゲル溶媒、LIVE/DEADキット溶媒
EDTA二ナトリウム塩2-HID	Winkler	ED-0760	骨サンプルの酵素分解用
Eppendorf遠心機5702	Eppendorf	5702000010	骨マイクロパーティクル調製用
分析用エタノール絶対	Supelco	1,00,98,32,511	骨の細胞外マトリックス除去用（70%に希釈）、フォトイニシエーター溶媒
胎児ウシ血清	Gibco	A52567-01	培養液成分
ブタ皮由来ゼラチン	Sigma-Aldrich	G1890-500G	ヒドロゲル成分
HBSS（10´）	Gibco	14185-052	骨髄サンプルの洗浄用
L-アスコルビン酸2-ホスフェート	Sigma-Aldrich	A8960-5G	培養液成分
LIVE/DEAD生存率/細胞毒性キット	Invitrogen	L3224	定性的生存率/細胞毒性アッセイ用
MEM Alpha（1´）	Gibco	12571-063	培養液成分
メタクリル酸無水	Sigma-Aldrich	276685-500G	ヒドロゲル成分
マイクロ遠心チューブ	Citotest	4610-1844	alamarBlueとLIVE/DEAD染料の調製用
NuncIon delta surface	Thermoscientific	150628	サンプルの播種用12ウェルプレート
OLYMPUS BX43蛍光光源 Olympus U- LH100HG	Evident	U- LH100HG	蛍光分析用光源
RC-6 Plus遠心機	Thermo Scientific Sorvall	46910	骨の細胞外マトリックス除去と骨マイクロパーティクル調製用
Synergy HTXマルチモードリーダー	BioTek Instruments	-	分光光度計
針付きシリンジ	NIPRO	SY3-WN-R-03	ヒドロゲル濾過用
96ウェル組織培養プレート	Jet Biofil	TCP001096	96ウェル、alamarBlue生存率アッセイ用
超音波洗浄器	VWE	97043-958	骨サンプルの超音波処理用