大腿骨頭のステロイド誘発性骨壊死に対するシナモミ皮質の探究のためのネットワーク薬理学および実験検証

サマリー

本研究は、ネットワーク薬理学、分子動力学シミュレーション、動物実験を統合することで、大腿骨頭骨壊死治療におけるシナモミ皮質の潜在的なメカニズムを探ることを目指しています。

要約

大腿骨頭のステロイド誘発性骨壊死(SONFH)は激しい痛みと可動性の制限を引き起こし、患者の生活の質を著しく低下させます。シナモミ皮質(CC)はこの状態を効果的に緩和することが示されていますが、その作用機序はまだ明確ではありません。本研究は、CCの有効化合物を特定し、SONFHにおけるそのメカニズムを探ることを目指しています。活性成分はHERB 2.0、PubChem、SwissADMEデータベースを用いてスクリーニングされ、対応するターゲットはスイスのターゲット予測データベースで予測されました。SONFHの標的は、GEO、DisGeNET、GeneCards、OMIMデータベースの標的と化合物関連標的を交差させることで同定されました。STRINGデータベースを用いてタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを構築し、DAVIDデータベースを通じてGOおよびKEGG濃縮解析を実施しました。最も有望な化合物-標的相互作用は、分子ドッキング(MD)および分子動力学シミュレーションによって検証されました。研究者たちは563の潜在的標的を特定し、そのうち61はSONFH関連標的で、AKT1、HIF-1α、STAT3が中枢節として機能しました。KEGG濃縮解析は、HIF-1αシグナル伝達経路が重要なメカニズムであることが明らかになりました。さらに、動物実験では、SONFHを用いたマウスモデルにおいて、CCの活性成分が大腿骨頭の構造損傷を効果的に軽減することが示されました。研究結果は、CCが低酸素適応の調整や血管新生および骨形成の調節を通じてSONFHを改善する可能性を示唆しています。

概要

大腿骨頭のステロイド誘発性骨壊死(SONFH)は^、大腿骨頭への血流の障害や減少によって引き起こされる重大な骨関節障害です。骨細胞および骨髄成分の死は大腿骨頭の構造的損傷と股関節の機能障害を引き起こします^。臨床的には、患者は通常股関節の痛みと可動域の制限を訴えます。³.効果的な治療がなければ、SONFH患者の80%が大腿骨頭虚脱に進行し、全股^関節置換術が必要となります。患者に深刻な心理的圧力と重い経済的負担を強い^る5.臨床上、SONFH治療には抗凝固薬、線溶薬、血管拡張剤、脂質低下薬の組み合わせが推奨されており、これらは一定の臨床的潜在力を示しているものの、一般的に治療効果は限定的です。⁶.

伝統中国医学(TCM)はSONFH⁷の治療にその積極的な効果をますます示しています。TCMは症状緩和、疾患制御、関節の可動性の向上および患者の生活の質向上に期待を寄せています⁸.臨床的には、CCおよびその成分がSONFHの改善に広く利用されており、顕著^{な効果を示しています}9。CCに含まれる多くの生物活性物質は、抗炎症、抗酸化、血管新生促進、微小循環改善など多様な生物学的作用を持っています¹⁰。骨組織工学と代謝の先行研究では、CCの主要な有効成分であるシナマルデヒドが骨のリモデリングに関連するシグナル伝達経路を調節できることが確立されています¹¹。初期の研究では、Yougui錠剤(YGPs)が血管新生を促進し炎症反応を促進することでSONFHの治療可能性を持つことが示されました¹²。YGPにおける主権薬として、CCは陽を温め、気を潤し、経絡の閉塞を解消し、SONFH¹³に有益な治療効果をもたらします。しかしながら、その効果の正確なメカニズムは依然として不明です。CCがSONFHの改善に用いる多標的調節ネットワークを明確にすることは、その薬理学的性質を理解するだけでなく、臨床的にも賢明な使用と関連する改善策の創出を促進することにつながるでしょう。バイオインフォマティクスとネットワーク薬理学の統合^は、作用機序を解明する効果的なアプローチを提供します。

ネットワーク薬理学はハーブ中のバイオアクティブ成分を特定し、これらの薬物成分と遺伝子標的との関連を予測できます¹⁵。MDは候補有効化合物と主要な治療標的間の結合相互作用の検証に用いられます。分子動力学はニュートン力学を用いて、運動シミュレーション¹⁶を通じてリガンド-受容体の結合の安定性と柔軟性を評価します。著者らはネットワーク薬理学、MD、分子動力学シミュレーションを用いてCCがSONFHに与える潜在的な影響を包括的に調査しました。これらの発見は、CCの薬理力学的材料基盤とメカニズムに関する今後の深部研究の参考文献となります。研究フローチャートは 図1に示されています。

プロトコル

すべての実験プロトコルは浙江中国医薬大学動物実験倫理委員会(IACUC-20240708-22)により承認され、国立衛生研究所発行の実験動物のケアと利用に関するガイドに準拠しています。この実験では、20〜22gの10週齢の雌C57BL/6Jマウス20匹が使用されました。これらのマウスは浙江中国医科大学動物センターから取得されました。このプロトコルで使用されるすべての試薬、機器、ソフトウェアの一覧は、 材料表 をご覧ください。

CCの有効化合物および標的のスクリーニング
CCの化学化合物は、Herb 2.0¹⁷ を用いて「CC」というキーワードで同定されました。PubChem IDがない、または同じIDの化学物質は除外されました。その後、重複を統合・除去してCCに対応するターゲット部位を取得します。PubChemデータベース¹⁸ を用いてLipinskiの法則(Mw ≤ 500、miLogP ≤ 5、nOHNH ≤ 5、nOH ≤ 10)¹⁹に基づいて初期スクリーニングを行います。著者らはPubChemデータベースを用いて各化合物のSMILES表現を決定しています。SwissADMEデータベースを用いて、著者らは「高」GI吸収と≥2つの「はい」値がDruglikeness²⁰で制限されている化合物を選定しています。Swiss-Target Prediction^{database 21} を利用して、確率がゼロより高い標的タンパク質を抽出します。その後、重複を統合・削除してCCに対応するターゲットサイトを取得します。

SONFHに関連する遺伝子標的のコンパイル
SONFH関連ターゲットはデータベースから取得されました:DisGeNETデータベース²²;GeneCardsデータベース²³;OMIMデータベース²⁴、GEOデータベース²⁵です。著者らはOMIMおよびDisGeNETデータベースからSONFH遺伝子をダウンロードし、重複を除去しました。重複を除去した後、GeneCardsデータベースから合計233件の疾患関連標的が取得されました。回収されたすべてのターゲットは関連スコアが0以上であり、その後の解析に含まれました。回収された遺伝子の最小関連スコアは6.48でした。SONFHに関連する差異発現遺伝子(DEG)は、GEOデータベースのGPL15207プラットフォーム上のGSE123568系列から取得されました。バッチ効果はリマパッケージを用いてRで補正され、|logFC|> 1 と P < 0.05²⁶.ggplot2パッケージを用いてDEG分布を可視化するための火山プロットを作成し、その結果を示すためのヒートマップが作成されました。SONFH疾患標的ライブラリは、RのVennパッケージを使って重複標的を除去することで確立されました。

PPIネットワークの設立
CCおよびSONFH関連ターゲットのアクティブコンポーネントの予想ターゲットに基づき、Venny 2.1.0²⁷によってベン図が作成されました。PPIデータの取得を目的として、著者らはターゲット^をSTRINGデータベースにインポートしました。生物のスクリーニング基準の限界は「ホモ・サピエンス」で、信頼指数は≥0.4でした。著者らはCytoscape 3.7.2を用いてPPIネットワークのキーターゲットを設定しました。次数中心性(DC)を用いてPPIネットワークの主要ターゲットを調べました。パラメータフィルターは中央値の2倍以上です。主要なターゲットをさらに特定するために、Cytoscapeのアドオンが採用されました。

遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)データベースを用いて濃縮解析が行われました
CCとSONFHの共通標的は、DAVID^{データベースを通じて}GOおよびKEGG濃縮解析のために解析されました。トップ10のGO用語とトップ20のKEGG経路を可視化するために、ウェイシェン・シン³⁰ を用いてエンリッチメントドットバブルチャートを作成しました。

ネットワーク建設
SONFHの改善におけるCCの分子メカニズムは、ハーブ-化合物-標的-標的(H-C-T)および化合物-標的-経路(C-T-P)ネットワークを通じて解明されました。Cytoscape 3.10.3ソフトウェアがネットワークを説明しました。H-C-Tネットワークは、CCの有効化合物とそれらが共有する標的を用いて開発されました。次に「ネットワーク分析」ツールを使いましょう。経路、化合物、ターゲット間の関係性の理解を深めるために、上位20の経路とそれに関連する標的および化合物をNetwork ToolsによってC-T-Pネットワークに編成しました。

MD検証
PPI解析からコアターゲットであるHIF-1α、STAT3、ESR1、AKT1、SRC、ERBB2、CASP3、EGFRを得ました。対象はUniportデータベース³¹ でヒューマンの例外を除いて検索され、RCSB PDBデータベース³²でレビューされました。比較的高い分解能を持つヒトタンパク質構造が選ばれました。有効成分はC-T-Pネットワークから同定されました。対応する3D構造はPubChemデータベースからmol2形式でダウンロードされました。各ファイルはChem3Dで開かれ、エネルギーは最小化されました。その後、著者らはAutoDockTools³³ ソフトウェアを用いて、受容体タンパク質の脱水、水素添加、ガスタイガー電荷の計算を行いました。リガンドと受容体はPDBQT形式で保持されました。空間的位置と結合能力に基づき、著者らはドッキングの実現可能性と安定性を評価しています。AutoDock Vinaを通じて、ドッキンググリッドボックスと高分子が予測されました。この研究では、配位子のすべての回転可能な結合が自由に回転し、受容体は剛性に設定されました。ドッキングスコアは受容体とリガンド間の結合親和性を示します。スコアが低いほど、結合親和性は高くなります。この原理に従い、著者らは結合エネルギーが最も有利な立体構造を選び、リガンドとタンパク質の結合相互作用を調査します。その視覚的結果はPyMOLによって示されました。

分子動力学シミュレーション
分子動力学シミュレーションは、CHARMM36力場を用いたGROMACS³⁴を用いて実施されました。タンパク質-リガンド複合体は、最小溶質ボックス距離1.0 nmの立方体周期シミュレーションボックス内に中心に配置され、SPC216水モデルを用いて系を溶かしました。適切なNa⁺およびCl⁻対イオンを加えることでシステムを中和しました。エネルギー最小化は、最も急降下アルゴリズムを用いて順次的に行われ、その後共役勾配法を用いて不利な原子接触を除去しました。長距離静電相互作用は、カットオフ距離10 Åの粒子メッシュEwald(PME)法を用いて計算されました。水素原子を含むすべての共有結合はLINCSアルゴリズムで制約されました。温度はVリスケールサーモスタットで300 Kに保たれ、圧力は等方結合によるベレンセンバロスタットで1バールで制御されました。平衡段階では、力定数1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻² の位置拘束がリガンドに適用されました。エネルギー最小化後、システムは2 ns NVTと2 ns NPTシミュレーションで平衡され、その後2 fsの時間ステップで100 nsの生成分子動力学シミュレーションが行われました。原子座標は10 pごとに記録され、その後の軌道解析が行われました。

SONFHマウスモデルにおける実験的検証
動物とSONFHモデル設立
浙江中国医科大学動物センターから、生後10週、体重20〜22gの雌C57BL/6Jマウス20匹を採取しました。マウスは7日間の環境環境での慣れ期間を経て、食事と水を制限なく提供されました。すべてのマウスはランダムにグループに割り当てられました(n=5匹あたり):対照群、SONFH群、SONFH + CC低用量群(CC-低用量、7.5g/kg/d)、およびSONFH + CC高用量群(CC-高用量、15g/kg/d)群です。SONFHモデルは前述の通りに確立されました。簡単に言うと、SONFH、SONFH + CC-Low、SONFH + CC-High群のマウスは、0日目にリポ多糖(LPS;20 μg/kg)の静脈内注射を2回受けました。その後、LPS注射から24時間ごとに24時間間隔でメチルプレドニゾロン(MPS;40 mg/kg)を筋肉内注射3回投与しました。治療群のマウスには、最後のMPS注射日から6週間にわたり毎日経口口胃口でCCエキスを投与されました。対照群マウスは、対応する時間点で同等量の生理食塩水を受け取りました。

サンプル採取と調製
6週間の治療期間終了時に、マウスは安楽死処分されました。両側の大腿骨頭は慎重に解剖され、摘出されました。各動物に対して、左大腿骨頭は48時間48°Cで固定され、その後の脱石灰とパラフィン埋め込みが行われました。右大腿骨頭は固定され、脱石除去なしで直接マイクロCTスキャンに使用されました。

組織学的解析(ABH染色)
脱石化およびパラフィン埋め込み後、大腿骨頭部切片はAlcian Blue/Hematoxylin(ABH)プロトコルを用いて染色され、骨壊死の変化を評価しました。短時間、1%アルシアンブルー(pH2.5)で30分間染色し、すすいでハリスヘマトキシリンでカウンターステインしました。脱水とマウント後、スライドは光学顕微鏡で画像化されました。骨壊死の定量化は、ImageJソフトウェアを用いて2人の盲検観察者によって行われました。空欠損の比率は、軟骨下領域内のサンプルごとにランダムに選ばれた3つの高出力場で(空洞数/欠損総数)×100%と計算されました。ピクノティック核の比率も同様に決定されました。

マイクロコンピュータ断層撮影(Micro-CT)解析
大腿骨頭の三次元骨微細構造は高分解能のマイクロCTスキャナーを用いて解析されました。固定された試料は10μm(70kV、114μA)の解像度でスキャンされました。一次荷重領域を含む標準化された球体積(VOI)を再構築し、CTAnソフトウェアを用いて解析しました。以下の形態計測パラメータが定量化されました:骨体積/総体積(BV/TV)、小梁厚(Tb.Th)、および小梁分離(Tb.Sp)。

免疫蛍光(IF)染色
骨の微小環境を評価するために、パラフィン切片に対して免疫蛍光染色が行われました。抗原採取とブロッキング後、4°Cで次の一次抗体(ウサギ抗HIF-1α(1:200)、ウサギ抗ALP(1:300)、ウサギ抗VEGF(1:150)と共に切片を一晩インキュベートしました。洗浄後、切片はフルオロフォア結合の二次抗体の混合物で培養されました:Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギ抗体IgG、Alexa Fluor 555標識ヤギ抗ウサギ抗ウサギIgG。核はDAPIで染色されました。画像は蛍光顕微鏡を用いて一定の露光設定で撮影されました。各マーカーの相対蛍光強度は、ImageJソフトウェアを用いてサンプルあたり3つのフィールドで定量化しました。

統計解析
すべての定量データは平均±標準偏差(SD)として提示されます。分散の一方的解析(ANOVA)とTukeyの事後検定をGraphPad Prismソフトウェア(バージョン9.0)を用いて実施し、グループ間の統計的有意性を判断しました。P値が0.05未満の場合は統計的に有意とみなされました。

結果

CCのアクティブコンポーネントおよび予測ターゲットの特定、そして「H-C-T」ネットワークの開発。
SONFH改善におけるCCの主要成分および標的メカニズムを探るため、著者らはHERB 2.0データベースを用いてスクリーニングされたすべてのCC成分を特定しました。CCの209の候補有効成分のうち85の推定バイオアクティブ化合物が検出されました(補足表1)。スイスターゲット予測プラットフォームを用いて重複および無効なエントリーを除去し、これらのCCコンポーネントに対応する推定ターゲット563件を得ました(補足表2)。著者らはCCの活性成分と標的を特定しました。

SONFHの発症および進行に関与する分子メカニズムを調査し、潜在的なバイオマーカー標的を特定すること。GEOデータベースのGSE123568データセットの解析により、SONFHに関連するDEGが特定され、207のアップレギュレーション遺伝子と216のダウンレギュレーション遺伝子が含まれていました。425のDEGの火山プロットは図2Aに示されており、上位60のDEGの発現パターンは発現レベル別にランク付けされたヒートマップとして図2Bに示されており、色の強度は対数変換後の表現値を反映しています。DisGeNET、OMIM、GeneCardsのデータベースは、SONFHに関連する711件のターゲットを提供しました。GEOデータベースの425のDEGを合わせると、合計1136のターゲットがSONFHにリンクされています。重複を除去した後、図2Cに示されるように1115件のSONFH関連標的が確認されました。著者らはSONFHの疾患標的ライブラリを予備的に確立しています。

ターゲットと一次成分を特定するために、CCの563ターゲットと1115のSONFH関連ターゲットの交差解析により、61つの共通ターゲットが特定されました(図3Aおよび補足表3)。これらはCytoscape 3.10.3に取り入れられ、「H-C-T」ネットワークを構築しました(図3B)。このネットワークは147ノードと413エッジで構成されていました。トポロジカル解析の結果、(s)-4-ノリド(次数:16)、イソホモゲノール(次数:15)、ネリル酢酸塩(次数:14)、メリロトカルパンA(次数:14)、3-メトキシシンナマルデヒド(次数:13)がタンパク質標的との結合性が最も高いことが示されました。

PPIネットワークの開発と位相的評価。
SONFH改善におけるCCのターゲットをさらに探求するために。Cytoscape 3.10.3は、61個の同一ターゲットがSTRINGデータベースに登録された後、PPIネットワークの閲覧に使用されました。ネットワークには463エッジと60ノードがありました。 図4Aでは、節の色と大きさが明るく小さいから暗く大きく変化し、度数が低いから高い度へと増加していることを示しています。MCODEプラグインはこれらのターゲットを2つの機能モジュールにクラスタリングすることを可能にしました(図4A)、そのうちクラスタ1は23ノードと216エッジで構成され、スコアは19.636でした。ネットワークアーキテクチャをさらに特徴づけるために、DC、BC、CCがトポロジカル指標として用いられました。これらのパラメータの中央値をカットオフポイントとして設定し、著者らは8つのアクティブなターゲットを特定しました(図4B)。CytoHubbaプラグインはMCCアルゴリズムを利用してノードをランク付けし、上位10遺伝子を特定しました。(図4C)

Go濃縮解析
ONFH改善におけるCCのメカニズムをさらに探求するため、BP、CC、MFを用いて61の潜在的標的に対してGO濃縮解析を実施しました。合計435のGO項が濃縮され、そのうち293 BP項、41 CC項、101 MF項が含まれます。これらの発見は 補足表4、5、 6に示されています 。図5A は、バブルチャートを用いて上位10の強化BP、CC、MF用語を視覚的に示しています。結果は、BP用語が主にシグナル伝達、RNAポリメラーゼIIによる転写の正の調節、アポトーシス過程の負の調節、DNAテンプレート転写の正の調節、RNAポリメラーゼIIによる転写の負の調節に関連していることを示しました。解析の結果、MF項は主にタンパク質結合、金属イオン結合、同一タンパク質結合に関与していることが明らかになりました。CCの結果は、標的の大部分が主に細胞質、膜、そして細胞膜に存在していることを示しました。

KEGG解析
CCがSONFHを改善する可能性のある生化学的メカニズムに関する情報を明らかにするため、KEGG経路濃縮解析が行われ、CCがSONFHを改善する生化学的メカニズムを明らかにしました。 P <0.05およびFDR<0.05のスクリーニング基準を用いて、48件のKEGG濃縮エントリーを特定しました(補足表7)。フォールドリッチメントとカウントによって決定された上位20の有意に濃縮された経路は、バブルプロットとバープロットを用いて可視化されました(表1、図5B および 5C)。Cytoscape 3.10.3を用いて、167ノードと589エッジを持つC-T-Pネットワークが構築されました(図5D)。CCのSONFHへの影響は主に、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス感染、HIF-1シグナル伝達経路、脂質および動脈硬化に関連しており、これはGO機能解析およびKEGG経路濃縮解析で示されています。

MD検証
有効化合物と主要標的間の潜在的な相互作用を評価するため、C-T-Pネットワークからアネトール、メリロトカルパンA、ネリル酢酸、カプリル酸、イソホモゲノール、3-メトキシシナマルデヒド、(S)-4-ノリド、ミリスチシン、ボルネオール、シナミル酢酸酸を含む10の化合物を、主要標的であるAKT1、HIF-1α、STAT3、ESR1、CASP3、SRC、EGFRとドッキングしました。すべての化合物–標的ペアのドッキング結果は 補足表8にまとめられており、化合物、標的、ドッキングパラメータの詳細は 補足表9に記載されています。 図6 は結合エネルギー分布のヒートマップを示しています。

全体として、いくつかの化合物-標的ペアは比較的良好な結合親和性を示し、結合エネルギー値が低いほどより安定した予測相互作用を示しました。特筆すべきは、ドッキング結果で化合物と標的の結合親和性に明確な異質性が示されたことです。メリロトカルパンAのような特定の化合物は複数の標的に対して比較的強い結合親和性を示した一方で、他の化合物はより中程度または弱い相互作用を示しており、異なる化合物が予測される薬理学的効果に不均等に寄与している可能性を示唆しています。

さらに、ターゲット間でばらつきも観察されました。例えば、STAT3やEGFRのような特定の標的は、複数の化合物に対して比較的中程度または弱い結合親和性を示し、AKT1やSRCのような標的と比べて-5.0 kcal/molに近いものもありました。このパターンは、すべてのコア標的が特定された化合物の直接的な高親和結合パートナーとして機能するわけではなく、むしろ相互作用ネットワーク内で間接的な調節役割を果たすことを示しています。これらの違いは、配位子とタンパク質結合部位間の構造適合性の違いや、標的の固有の特性に関連している可能性があります。

評価されたペアの中で、AKT1はメリロトカルパンAとの結合エネルギーが最も低く(-9.6 kcal/mol)、潜在的に良好な相互作用を示しました。 図7 はこの複体の予測結合モードを示しています。具体的には、AKT1のSER205はメリロトカルパンA、アネトール、ミリスチシンと水素結合を形成します。さらに、メリロトカルパンAはHIF-1αのGLY309、STAT3のLEU438およびTHR440、ESR1のSER433とARG412、SRCのARG500とGLU510と水素結合を形成すると予測されました。

代表的な候補化合物を特定するために、各ターゲットの最低結合エネルギーを用い、結合エネルギー閾値を≤-5.0 kcal/molと設定して比較的安定した相互作用を示しました。これらの基準に基づき、メリロトカルパンA、アネトーレ、ミリスチンが主要な化合物として特定されました。全体として、CCの有効成分の大多数は選択された治療標的との潜在的な相互作用を示し、一部の化合物は複数の標的に対して比較的強い結合傾向を示しました。しかし、MDは潜在的な相互作用の予備的予測を提供する簡略化された計算手法であり、タンパク質の柔軟性や複雑な生物学的環境を完全には考慮できない可能性があることに注意が必要です。したがって、これらの結果は慎重に解釈されるべきであり、観察された相互作用は直接結合の決定的な証拠とはなりません。

分子動力学シミュレーション
複合体の安定性をさらに評価するため、著者らは分子動力学シミュレーションのためにAKT1-メリロトカルパンA、HIF-1α-メリロトカルパンA、STAT3-メリロトカルパンAを選定しました。予測対象の中には、PPIネットワークにおける中心的役割とSONFH病理への生物学的関連性に基づき、STAT3とHIF-1αがMDシミュレーションに選ばれました。STAT3はPPIネットワークの中でも最も高い結合度の一つを示し、複数のシグナル伝達経路における調節役割の可能性を示しています。HIF-1αが選ばれたのは、KEGG濃縮解析の結果、HIF-1シグナル伝達経路が骨壊死における血管新生および低酸素適応に関連する最も重要な経路の一つであることが特定されたためです。

同時に、著者らはAKT1を代表的な標的として注目しました。これは、強いドッキングスコアとSONFHの病理的特徴、特に低酸素誘発性血管新生および骨再生との直接的な関連性からです。計算資源の制約により、詳細なMDシミュレーションのために3つの代表的な複合体が選ばれ、これはネットワーク薬理学ベースの分子シミュレーション研究で一般的に採用される戦略です。二乗平均平方根偏差(RMSD)は、タンパク質-リガンド複合体の立体構造安定性を効果的に評価し、値が低いほど構造的安定性が高いことを示します。図8Aに示すように、AKT1-メリロトカルパンA複合体は最初の12 ns以内に緩和を完了し、その後安定したプラトーに達しました。約50〜55 nsで一時的な変動が観察され、その後急速に平衡に戻りました。シミュレーション全体のRMSDは約0.369 nmでした。図8Bは、HIF1A-メリロトカルパンA複合体が最初の16 ns以内に緩和を経験し、その後安定したプラトーが維持されたことを示しています。38 n秒から42 nsの間で一時的に変動し、その後急速な安定化が観測されました。この複合体の総RMSDは0.25海里でした。図8Cでは、STAT3-メリロトカルパンA複合体が0.3 ns以内に緩和を経験し、その後安定したプラトーに達しました。この短い変動は5ナショナルから80ナショナルの間で起こりました。全体のシミュレーションは約0.21 nmでした。AKT1-メリロトカルパンA、HIF-1α-メリロトカルパンA、STAT3-メリロトカルパン複合体は、顕著な変化なく安定性を維持し、比較的安定した組み合わせを示しています。

タンパク質中のアミノ酸残基の柔軟性は、二乗平均起伏(RMSF)を用いて評価されました。 図9Aでは、平均的な全残基変動は約0.17 nmであり、安定性は主に構造コアと結合ポケットによって維持されていたことを示唆しています。高い柔軟性は主にポケットコアではなく、端末セグメントやループ領域のような本質的に移動性の高い領域に限られていました。これらの領域が柔軟性があることはよく知られています。 図9B は、約94%の残基が0.20 nm未満のRMSF値を示し、約6%が0.30 nmを超えたことを示しており、全体のタンパク質骨格および内部残基が安定した範囲内で変動していることを示しています。図9Cは、平均グローバル残基が約0.17 nmであったことを示しています。データでは0.15 nmを超える変動は検出されず、結合ポケットがシミュレーション全体を通じて安定した立体構造を維持していたことを示しています。AKT1-メリロトカルパンAおよびHIF-1α-メリロトカルパンA複合体は、強く安定的に相互作用することが示されています。

水素結合はタンパク質とリガンドの相互作用を促進する上で極めて重要です。 図10A は、AKT1-メリロトカルパンA錯体は通常、1つの水素結合を形成しており、水素結合の数は0から2の間で変動します。メリロトカルパンAとHIF-1αの間は0.35 nm未満の間隔があります。AKT1はメリロトカルパンAと頻繁に相互作用します。HIF-1α-メリロトカルパンA錯体は、主に1つの水素結合を形成する0から2の水素結合を形成します( 図10Bに示されています)。図10 Cでは、STAT3-メリロトカルパンA錯体の水素結合の数は0から4です。ほとんどの場合、メリロトカルパンAとHIF-1αの間のA原子は0.35 nm未満の間隔があります。HIF-1α-メリロトカルパンA複合体は1〜3組の接近接触を形成し、時には7〜9組の接近ペアも形成します。これは、小分子と標的タンパク質間の効果的な水素結合相互作用を示唆しています。まとめると、AKT1-メリロトカルパンAおよびHIF-1α-メリロトカルパンA複合体は安定性と強度を示します。

CCはSONFHマウスの炎症反応とアポトーシスを抑制します
ABH染色を用いた組織学的解析では、SONFH群に顕著な骨壊死変化が認められ、空洞の欠孔の増加、ピクノティック核、小梁構造の乱が特徴となりましたが、これらの病理的特徴はCC治療後に著しく緩和されました(図11A)。定量解析により、CC処理群の空洞性ラクネーとピクノティック核の比率がSONFH群と比較して有意に減少していることが確認されました(図11B–C)。マイクロCT解析により、SONFH群で重度の小梁骨減少が認められ、CC投与により部分的に改善しました(図11D)。一貫して、CC治療はBV/TVおよび結核を有意に増加させました。一方で、Tb.SpはSONFH群に対して減少しています(図11E–G)。免疫蛍光染色ではSONFH群でHIF-1α発現が上昇し、ALPレベルが低下し、VEGF発現の変異が見られました。CC治療はHIF-1αおよびVEGFの発現を調節し、ALPシグナルを増強し、骨の微小環境および骨生成活性の改善を示しました(図11H)。

データの利用可能性:
現在の研究で使用または解析されたデータセットはリンク https://zenodo.org/records/19730455 で入手可能です。

図1:SONFHのCC改善のためのネットワーク薬理学研究戦略のフローチャート。図1は、研究がデータベースからCCの有効成分の潜在的な標的を特定し、SONFHを中核疾患としていることを示しています。これらを疾患関連標的と交差させた後、「成分–標的–経路」ネットワークとGO、KEGG項が構築されました。その後、分子ドッキングおよび分子動力学シミュレーションを用いて、主要成分とコアターゲット間の結合親和性を評価し、最終的な検証は実験的検証によって行われます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:SONFHに関連する交差標的のスクリーニング。 (A) 疾患サンプルにおける異なる発現遺伝子の分布を示すVolcanoプロット。赤い点は遺伝子の上位化、青い点は下位化した遺伝子、灰色の点は有意な差異発現を欠く遺伝子を示します。(B) 60の差異発現遺伝子の発現パターンを示すヒートマップ(列はサンプル、行は遺伝子に対応しています)。(C) 異なるデータベースから得られた疾患関連標的の重複を示すベン図。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:CCとSONFH間の交差標的のスクリーニング。 (A) CC(黄色)およびSONFH関連疾患標的(紫)における有効成分の予測標的間で共有される61の共通標的分布を示すベン図。(B) ハーブ-化合物-標的(H-C-T)ネットワークは、化合物と対応する標的間の相互作用を示します。青い四角節は病気、緑の四角節は有効化合物、オレンジの四角節は共通標的を示します。辺は化合物とその標的間の相互作用を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:PPI解析による候補ターゲットの特定。 (A) MCODEプラグインでクラスタ化されたPPIネットワーク。(B) PPIネットワーク内のトポロジカルスクリーニングの回路的ワークフロー。(C) CytoHubbaプラグインによってPPIネットワークから抽出された主要な遺伝子。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:61の共通ターゲットに対するGO濃縮解析結果およびKEGG経路濃縮解析。 (A) BP、CC、MFのGO濃縮分析用語トップ10を示すバブルチャート。(B) 著しく濃縮された上位20のKEGG経路を示すバブルプロット。(C) KEGG機能分類に基づく上位20の濃縮経路の分布。(D) 大腿骨頭の骨壊死を改善する可能性のあるメカニズムを示す示像的なC-T-Pネットワーク。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:CCの有効化合物と主要ターゲット(kcal/mol)間の相互作用の結合エネルギーヒートマップ。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図7:特定の有効化合物による主要標的の結合モード。 AKT1-メリロトカルパンA(A1)、HIF-1α-メリロトカルパンA(B1)、STAT3-メリロトカルパンA(C1)、ESR1-メリロトカルパンA(D1)、CASP3-メリロトカルパンA(E1)、SRC-メリロトカルパンA(F1)、EGFR-メリロトカルパンA(G1)、AKT1-アネトロール(H1)、AKT1-ミリスチシン(I1)。(A2)、(B2)、(C2)、(D2)、(E2)、(F2)、(G2)、(H2)はそれぞれ2次元結合モードを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8:MDのRMSD。 (A) AKT1-メリロトカルパンA錯体のRMSD値。(B) HIF-1α-メリロトカルパンA複合体のRMSD値。(C) STAT3-メリロトカルパンA複体のRMSD値。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図9:DMのRMSF。 (A) AKT1-メリロトカルパンA錯体のRMSF値。(B) HIF-1α-メリロトカルパンA錯体のRMSF値。(C) STAT3-メリロトカルパンA複体のRMSF値。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図10:MDのH結合。 (A) AKT1-メリロトカルパンA錯体のH結合値。(B) HIF1A-メリロトカルパンA錯体のH-結合値。(C) AKT1-メリロトカルパンA錯体のH結合値。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図11:CCは大腿骨頭の炎症反応とアポトーシスを抑制し、SONFHを改善する。 (A) 代表的な大腿骨頭切断にABH染色。空のラキュナエは黒い矢じりで示され、ピクノティック核は矢印で示されます。(B–C)空洞核(B)とピクノティック核数(C)の比率の定量的分析。n = 5。(D) 大腿骨頭の代表的な三次元マイクロCT再構築。(E–G)骨容積分数(BV/TV)、小梁分離(Tb.Sp)、小梁厚(Tb.Th)などの微小CTパラメータの定量化。(H) 大腿骨頭部切片におけるHIF-1α、VEGF、ALPの代表的な免疫蛍光染色;核はDAPIでカウンターステインされた。データは平均 ± SD(n = 5)として表されます。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

用語		褶曲増殖	P値	伯爵	ユーザーIDs
膀胱がん		28.44	1.23E-07	7	クレッブ、CXCL8、NOS2、MMP2、STAT3、F2、PTGS2、 HIF1A、ESR1、MMP9、EGFR、MTOR、VEGFA、CASP3、 ERBB2、EP300、PPARG、NFE2L2、BCL2L1
HIF-1シグナル伝達経路		16.66	6.56E-10	11	SRC、MMP2、STAT3、HIF1A、ESR1、MMP9、EGFR、 MTOR、VEGFA、CASP3、ERBB2、KDR、PDCD4、PTPN6
EGFRチロシンキナーゼ阻害剤耐性		16.66	3.84E-07	8	CCR1、CREBBP、CXCL8、SRC、CASP3、STAT3 、EP300、TYK2、PTGS2、HIF1A、MTOR、VEGFA
アディレンス・ジャンクション		12.54	1.64E-05	7	クレッブ、ABCB1、CASP3、ERBB2、STAT3、PDCD4、 EP300、PTGS2、MMP9、EGFR、MTOR、VEGFA
内分泌耐性		11.78	2.35E-05	7	クレブ、NOS2、NOS3、ERBB2、STAT3、 SERPINE1、EP300、HIF1A、EGFR、MTOR、VEGFA
糖尿病合併症におけるエイジレイジ信号伝達経路		11.55	2.63E-05	7	CCR1、CXCL8、SRC、CASP3、STAT3、CXCR2、PTGS2、EGFR、MTOR、VEGFA
がんにおけるプロテオグリカン		11.43	1.19E-10	14	CXCL8、SRC、NOS3、CASP3、STAT3、PPARG、MMP9、BCL2L1、NFE2L2
リラクシンシグナル伝達経路		10.25	1.02E-05	8	OXTR、NOS2、NOS3、ERBB2、PTAFR、KDR、NOS1、EGFR、VEGFA
カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス感染		10.20	1.45E-08	12	SRC、ERBB2、STAT3、KDR、EGFR、MTOR、BCL2L1、VEGFA
甲状腺ホルモンシグナル伝達経路		9.56	7.64E-05	7	NOS2、SRC、NOS3、MMP2、NOS1、MMP9、EGFR、VEGFA
流体せん断応力と動脈硬化		8.21	0.000177	7	クレッブ、CXCL8、SRC、CASP3、STAT3、EP300、TYK2、MMP9
B型肝炎		8.18	4.41E-05	8	クレッブ、STAT3、EP300、PTPN6、TYK2、EGFR、MTOR、BCL2L1
JAK-STAT シグナル伝達経路		7.93	5.35E-05	8	SRC、VDR、STAT3、CYP3A4、ESR1、EGFR、MTOR、VEGFA
ヒトサイトメガロウイルス感染症		7.34	6.2E-06	10	クレブプ、CASP3、EP300、TYK2、PTGS2、EGFR、MTOR、VEGFA
脂質と動脈硬化		6.94	0.000035	9	CXCL8、SRC、MMP2、ERBB2、MMP9、EGFR、VEGFA
がんにおけるマイクロRNA		6.25	2.06E-06	12	クレブ、SRC、ERBB2、EP300、PTPN6、PTPRF、EGFR
化学的発がん - 受容体の活性化		6.14	0.000265	8	SRC、MMP2、ERBB2、ESR1、MMP9、EGFR、MTOR
がんにおける経路		5.94	6.64E-10	19	CXCL8、NOS3、CASP3、MMP2、STAT3、SERPINE1、VEGFA
カルシウムシグナル伝達経路		5.90	0.00011	9	KAT2B、CREBBP、SRC、EP300、HIF1A、ESR1、MTOR
ヒトパピローマウイルス感染		4.00	0.00324	8	SRC、NOS3、MMP2、KDR、MMP9、NFE2L2、VEGFA

表1:上位20の濃縮経路のKEGG濃縮結果。

補足表1:CC中の有効成分の基本情報。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表2:CCにおける85のアクティブコンポーネントの目標。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表3:61のCC-SONFH共通ターゲットに関する情報。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表4:GO濃縮分析による生物学的プロセスカテゴリー用語の結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表5:GO濃縮分析による細胞成分分類項の結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表6:GO濃縮解析による分子機能カテゴリ項の結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表7:KEGG濃縮解析による経路の結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表8:化合物-標的対の分子ドッキング結合エネルギー(kcal/mol)。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表9:分子ドッキングの標的および成分の詳細。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、複数のデータベースを通じてCCから85種類の生物活性化合物を取得し、スクリーニングを行いました。主な化学成分にはアネトール、メリロトカルパンA、ミリスチシンが含まれます。標的を特定するために、著者らは563の薬物CC標的と1116のSONFH関連標的を交差させ、最終的に61標的を得ました。著者らは61の共通標的をSTRINGおよびDAVIDデータベースにインポートし、PPIネットワークを構築し、可能な薬理学的経路を調査しました。その結果、PPIネットワークにおけるHIF-1αやSTAT3を含む10の主要な標的が明らかになりました。虚血と低酸素症はSONFHの主な病原性の特徴の二つであると、以前の研究³⁵は示しています。CCは血管新生や転写調節を含む複数の生物学的プロセスを通じてSONFHに良い効果を発揮する可能性があります。これは、KEGGエンrichment解析によると、HIF-1αシグナル伝達経路、液体せん断ストレスおよび動脈硬化、脂質と動脈硬化、糖尿病合併症におけるAGE-RAGEシグナル伝達経路、その他のシグナル伝達経路を通じて実現可能である。これはCCがこれらの主要な標的および関連する経路を通じてSONFHに作用する可能性を示唆しています。CCの成分が標的と密接に結合しているかどうかをさらに明確にするため、上記のネットワーク薬理学研究結果、すなわち調合剤処方の有効成分のスクリーニング結果およびPPIネットワーク内の標的のスクリーニング結果に基づき、著者らはメリロトカルパンA-AKT1およびメリロトカルパンA-HIF-1αの分子動力学シミュレーションを実施しました。 およびSTAT3-メリロトカルパン複合体です。これはメリロトカルパンAがAKT1、HIF-1α、STAT3に安定して結合していることを示しており、CCがこれらの主要標的に作用することで実際に良い効果を発揮する可能性があることを示しています。総じて、多成分・多標的・多経路機構を通じて、CCはSONFH患者の生活の質に保護効果を発揮する可能性があります。

研究グループは、YGPが骨関連疾患において治療効果を発揮するメカニズムの解明に焦点を当てています。以前の研究では、YGPsがβカテニンを活性化して破骨形成を抑制し、ウサギSONFH³⁶における骨形成を促進し、大腿骨頭の骨形成を促進し、大腿骨の微細構造を改善することが示されています。さらに、研究者たちはYGPが主に炎症の緩和と血管新生の促進を通じてSONFHに治療効果を発揮していることを発見し^ました。YGPはSONFHを改善するだけでなく、骨粗鬆症の改善にもつながります。YGPはIL-17/NF-κBシグナル伝達経路を阻害しTh17免疫応答を減少させることで、卵巣摘出術による骨減少を効果的に停止します³⁷。動物実験を通じて、研究者たちはYGPsの成分の一つであるCornus officinalisが炎症メディエーターの分泌を阻害し、骨細胞アポトーシスを阻害することでSONFHに影響を及ぼすことを確認し^ました。CCは陽を温め、気を潤し経絡を解消する効果があり、YGPの主要なハーブであり、SONFHの改善や患者の苦痛緩和に重要な役割を果たしています。まとめると、これらの研究は長年にわたり骨壊死におけるYGPsのメカニズム解明と、SONFHにおける主要なハーブのメカニズム研究としてのCCの特定に注力してきた成果を反映しています。

予測される有効成分の中には、アネトール、ミリスチシンなどが骨関連疾患に対して生物学的活性を示しています。アネトーレは骨吸収マーカーの上昇を阻害することが示されています。アネトールは最終的に、下流経路や主要な調節因子を阻害することで破骨細胞の分化と吸収機能を減少させます³⁹。研究によると、アネソールは抗炎症作用を示し、ヒト骨髄間葉質幹細胞(hBMSC)における脂肪形成性分化を抑制します⁴⁰。ミリスティシンはPI3K/AktおよびNF-κB経路を抑制することで炎症を抑制し、血管平滑筋細胞を保護します⁴¹。フェロプトーシスはSONFHの病因の主要なメカニズムの一つです。フェロプトーシスは、鉄に依存する脂質過酸化によって引き起こされるプログラム性細胞死の一種です。ミリスチシンはフェロプトーシスを防ぎ、骨芽細胞膜の酸化還元恒常性を保護する⁴²。ボルネオールのもう一つの成分は、細胞の分極を反映する破骨細胞の吸収特性であるアクチン環の形成を30分⁴³秒以内に阻害することが確認されています。これらの発見は、これらの成分がSONFHにおけるCCの保護効果に非常に重要である可能性を示し、さらなる研究に値します。これらすべての成分の中で、メリロトカルパンAはMD解析において複数のコアターゲットに対して最も安定した結合親和性を示したため、代表的なリガンドに選ばれました。上位化合物の中で、メリロトカルパンAはPPIネットワークのいくつかの主要なタンパク質と一貫して強い結合相互作用を示し、CCの主要な生物活性成分である可能性を示唆しています。

さらに、PPIネットワークの結果は、特にHIF-1αとSTAT3が主要な標的である可能性を明らかにしました。HIF-1αは低酸素症に対する細胞応答の中心的な媒介因子です。SONFH実験では、HIF-1αの活性化が血管新生と骨修復を促進し、大腿骨頭壊死を緩和します^。さらに、研究ではHIF-1αが低酸素状態で軟骨組織に保護効果を及ぼすことがわかっています⁴⁵。HIF-1αのアップレギュレーションはフェロトーシスを抑制し、STAT3を活性化して骨髄単球の破骨細胞への分化を加速させます⁴⁶。STAT3はシグナル伝達および転写活性化因子です。HBMSCはSTAT3をp-STAT3に変換し、低酸素条件下での軟骨細胞増殖、移動、抗アポトーシス効果を促進します⁴⁷。STAT3はhBMSCの骨形成分化および抗アポトーシス効果を高め、血管内皮成長因子(VEGF)分泌を増加させて骨の微小血管再生を促進します⁴⁸。AKT1は血管新生シグナル伝達の重要な媒介剤として働くタンパク質キナーゼです。AKT1は骨血管新生-骨形成の結合および小梁骨形成に関与しています⁴⁹。総じて、これらのハブ標的は血管新生、低酸素適応、炎症、骨の再構築に収束しており、CCがこれらの標的および関連するシグナル伝達経路を調節することでSONFHに対して保護効果を発揮する可能性を示唆しています。

SONFHの改善におけるCCのメカニズムを探るため、研究者たちはGO解析およびKEGG濃縮解析を実施しました。GOの結果は、標的遺伝子が主に低酸素症への応答、リポ多糖への細胞応答、血管新生の正の調節などの生物学的機能に豊富であることを示しています。KEGG濃縮解析は、CCのSONFHにおける薬理学的効果が主に糖尿病合併症におけるAGE-RAGEシグナル伝達経路、HIF-1αシグナル伝達経路、脂質および動脈硬化、その他のシグナル伝達経路に関連していることを示唆しました。SONFHは大腿骨頭への血流が途絶え、大腿骨頭への栄養サポートが欠損し、細胞アポトーシスを引き起こすことで^{発生します。}HIF-1はHIF-1αとHIF-1βからなり、低酸素および虚血環境に対する転写応答において重要な役割を果たします⁴⁷。これまでの研究では、VEGF/AKT/mTORシグナル伝達カスケードを通じて、HIF-1αが骨形成と血管形成を調整し、脂肪由来幹細胞の骨形成分化を決定的に促進することが示されています。虚血が起こると組織の低酸素状態が発生し、細胞内のHIF-1αが著しく上昇します。これによりVEGFの発現レベルが上昇し、その結果として血管修復と再生を促進します⁵¹。低酸素症はミトコンドリアのエネルギー産生を妨げ、活性酸素種(ROS)の生成を増加させます。これらの変化は破骨形成を促進し、成骨芽細胞活性を抑制し、最終的には骨細胞のアポトーシスを誘発します。HIF-1αの高発現は細胞のエネルギー代謝を酸化的リン酸化から解糖系へとシフトさせ、ROS産生を減少させ、それによって骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスを減弱します(^52,53)。拐点骨は骨髄の造血機能を支え、カルシウムなどのミネラルを貯蔵します。HIF-1αの活性増加は、カンセロス骨形成を直接的に増加させることができます⁵⁴。さらに、HIF-1αは低酸素状態で軟骨細胞の生存と恒常性を維持します⁴⁵。その結果、HIF-1αシグナル伝達経路はONFHの治療標的となり、ONFHの治療応用の可能性が期待されています。

AGE-RAGEシグナル伝達経路において、先進糖化終産物(AGEs)は、炭水化物とタンパク質、脂肪、またはその他の生物学的高分子との非酵素的共有結合架橋によって生じます⁵⁵。AGEは炎症や酸化による損傷によって細胞や組織を損傷することがあります。4つの経路を通じて、信号はAGE-RAGEの相互作用によって伝達されます。それらは1) JAK-2-STAT1、(2) PI3K-AKT、(3) MAPK-ERK、(4) NADPH オキシダーゼ-ROS⁵⁶です。最終的にリン酸化されたNF-κBは核内に入り、炎症促進サイトカイン、成長因子、前線維化サイトカイン、酸化ストレスの発現を転写します。この研究は、AGE-RAGEがMAPKシグナル伝達経路を介して骨芽細胞アポトーシスを促進し酸化ストレスの活性化を促し、内質網ストレスセンサーのレベルを抑制し、DNAメチル化/Wnt経路を通じて骨形成分化を抑制することが示^{されました。}さらに、研究ではAGEsおよびRAGEsが血管石灰化に関与していることが示^{されています。}

脂質および動脈硬化のシグナル伝達経路において、酸化脂質がPPARγを活性化します。これは脂肪形成の主要な調節因子であり、骨形成分化を阻害します⁵⁹。さらに、いくつかの研究で脂質が破骨細胞や骨芽細胞の分化と成熟に影響を与え、骨の恒常性を乱すことが示^{されています。}複数の基礎研究で、アポトーシスがSONFHの生理学的および病理学的メカニズムに有意に関与していることが示されています。その後の 生体内 動物実験では、CCの活性分がSONFHにおけるアポトーシスと炎症を効果的に抑制し、疾患進行を緩和することがさらに確認されました。

これらの発見と一致して、ネットワーク薬理学および実験解析は、CCが低酸素適応の調整、血管新生の調節、代謝過程の調節を通じてSONFHを改善する可能性を示唆しています。定量的なマイクロCT解析により、CC介入は骨容積分率(BV/TV)を有意に回復させ、トラベキュラム分離を減少させ(Tb.Sp, Tb.Th)、骨の微細構造の回復を促進しました。KEGG濃縮解析は、これらの効果の主要なメカニズムとしてHIF-1αシグナル伝達経路をさらに強調しました。これらの動物実験は、CCが低酸素関連および炎症関連の生物学的プロセスを調節し、血管新生や骨の再構築を促進することでSONFHを緩和する可能性があることを示しています。これはHIF-1αシグナル伝達経路などの主要な経路を通じて可能である可能性があります。

いくつかの重要な予備的発見が得られたものの、本研究には依然としていくつかの限界があります。著者らはネットワーク薬理学やMDを含む現代のバイオインフォマティクス手法、さらにいくつかの動物実験のみを用いて、SONFHにおけるCCの役割を探りました。したがって、予測の信頼性と正確性は、 in vivo および in vitro 実験でさらに検証される必要があります。本研究は、CCがSONFHを改善させるメカニズムに関する予備的な手がかりを提供し、さらなる実験的検証が必要です。ネットワーク薬理学とMDを統合することで、著者らはSONFHにおけるCCの候補バイオアクティブ成分、主要標的、および濃縮経路を体系的にマッピングしました。結論として、本研究は統合ネットワーク薬理学および in vivo 検証を通じて、SONFHにおけるCCの潜在的な保護効果を調査しました。結果は、これらのメカニズムが主にHIF-1シグナル伝達経路の調節および骨生成再生の促進に関連していたことを示しています。対応する図に示されているように、CCの改善はHIF-1α、VEGF、ALPなどの主要タンパク質の発現を線量依存的に有意に調節し、低酸素適応、血管新生、骨生成活性の調整における役割をさらに支持しました。これらの結果は顕微CT解析によって裏付けられ、CC介入が骨容積分率の回復と小梁微細構造の改善を効果的に示しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4% PFA	バイオシャープ	BL539A
絶対エテノール	シノファーム・グループ Co.Ltd	10009218
アルシアンブルーステインキット	ソーラービオ	G1563
ALP	ごめんなさい	ARG57422
オートドック・ヴィナ	スクリップスリサーチ		バージョン 1.2.7
AutoDockTools	スクリップスリサーチ		バージョン 1.5.7
バイオインフォマティクスオンラインプラットフォーム			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36力場			MDパラメータ化に使用
CTD			https://ctdbase.org
サイトスケープ	サイトスケープ・コンソーシアム		バージョン3.10.3;プラグイン:CytoHubba、CytoNCA
DAPI染色ソリューション	ビヨタイム・バイオテック株式会社	C1006-50mL
デイビッド	NCI		https://david.ncifcrf.gov
ディスカバリースタジオビジュアライザー	バイオビア		BIOVIA Discovery Studio 2020;ドッキングの可視化
DisGeNET			https://disgenet.com
EDTA脱石化	ビヨタイム・バイオテック株式会社	C0167-3L
内因性ペルオキシダーゼ遮断溶液	ビヨタイム・バイオテック株式会社	P0100A
GeneCards(遺伝子カード)			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Goat anti-rabbit IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
ヤギ血清	ビヨタイム・バイオテック株式会社	C0265
GraphPad プリズム	GraphPad(Dotmatics)		バージョン10;統計解析とグラフ作成
グロマックス	グロマックス		2022年版;CHARMM36力場
ハーブ2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1&α;	杭州・フアン	HA721997
高分解能マイクロCT装置	ブルーカー	スカイスキャン
リピンスキールールフィルター			Mw & le;500;miLogP ≤5;HBD ≤5;HBA &10
リポ多糖	シグマ・オルドリッチ	L4516
メチルプレドニゾロン	シノファーム・グループ Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
中性バルサム	バイオシャープ	BL704A
オミム			https://www.omim.org
パラフィン	シノファーム・グループ Co.Ltd	C416770020
粒子メッシュ・エワルド(PME)			長距離静電気
パブケム	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	シュルドゥムル;ディンガー		タンパク質の可視化と調製
R	クラン		バージョン 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
ストリング			https://string-db.org
スイスADME	スイス研究所		http://www.swissadme.ch
スイスターゲット予測	スイス研究所		http://www.swisstargetprediction.ch
TIP3P水モデル			溶媒化に使用
ユニプロット			https://www.uniprot.org
VEGF	杭州・フアン	ET1604-28
魏生心			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	マイクロソフト		データ処理、分子ドッキング、MDシミュレーションに使用
キシレン	シノファーム・グループ Co.Ltd	10023418