CD47およびインテグリンα4/β1修飾マクロファージ膜被覆ポリ(乳酸共グリコール酸)ナノ粒子の単離、合成、および特性解析

Summary

このプロトコルにより、CD47およびインテグリンα4/β1共修飾マクロファージ膜被覆ポリ(乳酸共グリコール酸)ナノ粒子の製剤と特性評価が可能となり、標的薬物送達用途に用いられます。

Abstract

動脈硬化は慢性炎症性疾患であり、心血管の罹患率と死亡率に大きく寄与しています。抗炎症薬を動脈硬化部位に標的的に投与することは依然として大きな課題です。本件では、CD47およびインテグリンα4/β1共修飾マクロファージ膜被覆コルヒチン充填ポリ(乳酸共グリコール酸)ナノ粒子(MMM/COL NPs)の調製および特性解析に関する詳細なプロトコルを提示します。プロトコルには、プラスミドトランスフェクションおよびエンドテリン1刺激によるマクロファージ修飾、膜分離、NP製造、膜コーティングが含まれます。得られたMMM/COL非天然体は、物理化学的特徴付け、タンパク質発現解析、in vitroおよび in vivo アッセイを用いて評価されます。機能的検証には、活性化された内皮細胞との細胞関連の評価、マクロファージの取り込み、泡細胞の抗炎症効果、マウス動脈硬化モデルにおける生体分布の評価が含まれます。さらに、実験室間の再現性と一貫性を確保するために、主要な実験パラメータや品質管理ステップも強調されています。このプロトコルは、動脈硬化研究における標的薬物送達アプリケーションのための生体模倣NP生成のための堅牢かつスケーラブルなアプローチを提供します。

Introduction

動脈硬化は慢性炎症性疾患であり、動脈腔狭窄および不安定なプラーク破裂による致命的な心血管イベントや脳卒中を引き起こし、世界的な健康負担の大きな要因となっています^1,2,3。動脈硬化部位における炎症反応のダウンレギュレーションは主要な^{治療標的です。}強力な抗炎症薬であるコルヒチンは、心血管の有害事象を軽減する可能性を示しています^6,7。しかし、臨床的には治療期間が狭く全身的な副作用があるため、毒性を最小限に抑えつつプラーク部位での蓄積を促進するための標的的な投与システム^{が必要です。}

細胞膜被覆ナノ粒子(NP)は、^源細胞の自然な生物学的機能を活用し、標的薬物送達の強力なプラットフォームとして登場

Protocol

本プロトコルで記載されたすべての動物処置は、南京ドラムタワー病院の動物ケア・利用委員会によって承認され、国立衛生研究所が定めた実験動物のケアおよび利用に関するガイドラインに従っています。

1. RAW 264.7マクロファージの修飾

1. RAW 264.7細胞を準備し、10%胎児用牛血清(FBS)と1%ペニシリン・ストレプトマイシンを補足したDulbecco's Modified Eagle培地を完成させ、CD47過剰発現プラスミド、リポフェクタミン3000型トランスフェクション試薬、エンドテリン-1(ET-1)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、および滅菌組織培養用品を補充します。
2. RAWで264.7細胞を37°Cの加湿インキュベーターで5%のCO₂で培養し、6ウェルプレートで1ウェルあたり約4〜5個×10個⁵ セルに達するまで細胞を保持します。
3. CD47修正を実行してください
   1. プラスミドDNA溶液を、2.5μgのプラスミドDNAと5μLのP3000試薬を125μLのOpti-MEM血清フリー培地で混合して調製します。
   2. トランスフェクション試薬溶液を3.75μLのトランスフェクション試薬を125μLの血清フリー培地に希釈して準備します。
   <....

Results

DLS測定はZetasizer Nano ZSシステムを用いて25°C、後方散乱角173°で行われました。サンプルは脱イオン水で20倍に希釈され(最終濃度は約0.1 mg/mL)、測定前に2分間平衡状態にされました。各試料は三重に測定され、結果は平均±標準差として示されています。DLSおよびTEMは膜コーティング後のNPサイズの増加を示し、コア・シェル構造の形成を確認しました(図1)。COL非点数は流体力学的直径180.8±5.2 nm、PDIは0.12±0.03、ゼータポテンシャルは−17.2±0.67 mV(n = 3)です。膜コーティング後、MMM/COL非点検は6.1 nm±202.0、PDIは0.15 ± 0.04、ゼータ電位は−27.4±1.84 mV(n = 3)を示します。典型的な質量回収は、10 mgのPLGA(収率87%)から8.7 ± 0.4 mgです。最適でない結果としては、多分散指数(PDI > 0.3)の増加、サイズ均一性の低さ、またはコーティング後.......

Discussion

本プロトコルは、標的型動脈硬化治療のためにCD47およびインテグリンα4/β1共修飾マクロファージ膜被覆NPを構築・適用するための包括的な方法を提供します。このシステムの主な利点は、インサイトロ取り込みアッセイ(図3)および 生体内 バイオ分布結果(図4)によって支持されているように、インテグリンα4/β1–VCAM-1相互作用による能動的ターゲティングとCD47介護シグナル伝達に関連するマクロファージの取り込み減少です。単純なネイティブ膜ではなく、改造された膜を使用することで、特定の治療的に関連する特性が強化されます。二重修飾戦略は、NP薬物送達における2つの主要な障壁に同時に対処しつつ、免疫原性を引き起こす合成標的リガンドを導入しない点で独特です。

プロトコル内の重要なステップには、マクロファージ修飾の効率性、膜分離の完全性、押出時の膜コーティングの均一性が含まれます。膜分離.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	A1310	フローサイトメトリーの生死判別のための生存性染料
Alexa fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	A-11008	CD68免疫蛍光染色のための二次抗体
抗マウスCD47抗体	アブカム(アメリカ)	AB214453	CD47発現を検証するためのウェスタンブロット解析に使用
抗マウスインテグリン&アルファ;4抗体(B-2)	サンタクルーズ・バイオテクノロジー(アメリカ)	SC-376334	ウェスタンブロット解析でインテグリンとアルファの検証に使用され、4 式
抗マウスインテグリン&ベータ;抗体1個(A-4)	サンタクルーズ・バイオテクノロジー(アメリカ)	SC-374429	ウェスタンブロット解析でインテグリンとベータを検証するために使用されます。1 式
ApoE-/-ネズミ	ジャクソン研究所(アメリカ)	該当なし	in vivo動脈硬化モデルに使用
BCAアッセイキット	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	23225	タンパク質濃度の測定に用いられます
黒いシリコーンプレート	該当なし	該当なし	体外画像検査のために大動脈を取り付けるために使われていました
CD47プラスミド(pcDNA3.1(+))	ジェネレイ・バイオテック(中国)	G0177361-1	マウスのCd47遺伝子を含み、過剰発現を起こす
コルヒチン	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	C9754	ナノ粒子における治療ペイロード
共焦点レーザー走査顕微鏡	ライカ・マイクロシステムズ	TCS SP8	蛍光イメージングおよび共局在解析に使用
クエン酸バッファー(pH 6.0)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	該当なし	免疫蛍光染色における抗原回収に使用
透析チューブ(MWCO 3,500 Da)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	PURD35030	ナノ粒子精製に使用
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	D2447	ナノ粒子製剤用溶媒
DiI(1,1′-ジオクタデシル-3,3,3&プライム;,3′-テトラメチルリンドカルボシアニン過塩素酸塩)	ビヨタイム(中国)	C1036	ナノ粒子コアの蛍光標識
DiO(3,3′-ジオクタデキロキサカルボシアニン過塩素酸塩)	ビヨタイム(中国)	C1038	マクロファージ膜の蛍光標識
ディレクター	ビヨタイム(中国)	Y239280	生体内蛍光イメージングに使用
ダピ	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	D3571	蛍光イメージングのための核式カウンターステイン
ダルベッコ改良型イーグル中型(DMEM)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	11965092	細胞培養培地
動的光散乱アナライザー(ゼタサイザー・ナノZS)	マルバーン・パナリティカル(イギリス)	該当なし	ナノ粒子サイズ、PDI、ゼータポテンシャルの動的散乱(DLS)測定に使用されます
ELISAキット	R&Dシステムズ(アメリカ)	ターゲットサイトカインによります	炎症性サイトカインの定量に使用されました
エンドセリン-1(ET-1)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	E7764	インテグリンとアルファを刺激するために使用されました。4/&β;1 式
胎児用牛血清(FBS)	Gibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ)	10091148	細胞培養培地のサプリメント
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス(アメリカ)	FACSCalibur	蛍光信号取得に使用
フローサイトメトリー解析ソフトウェア(FlowJo v10.8.1)	BDバイオサイエンス(アメリカ)	該当なし	フローサイトメトリーデータ解析に使用
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)	福恒バイオテクノロジーズ(中国)	FH1122	in vitro targeting アッセイに使用
画像解析ソフトウェア(ImageJ)	米国国立衛生研究所(NIH)	該当なし	定量的画像解析に使用
生体内イメージングシステム	パーキンエルマー(アメリカ)	IVIS ルミナIII	全身蛍光イメージングに使用
イソプロパノール(60%)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	34863	オイルレッドO染色時の差別化に使用されます
リポフェクタミン3000	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	L3000001	トランスフェクション試薬
磁気攪拌棒と攪拌棒	該当なし	該当なし	ナノ粒子製製に使用
マッソントリクロムステインキット	アブカム(アメリカ)	ab150686	コラーゲン染色に使用
ミニエクストルーダー	アヴァンティ・ポーラー・リピッズ(アメリカ)	610000	膜押出に使用
マウスRAW 264.7細胞株	福恒バイオテクノロジーズ(中国)	FH0328	マクロファージの供給源
マウス平滑筋細胞株	福恒バイオテクノロジーズ(中国)	FH-Y063	安全性評価に使用
オイルレッドO	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	O0625	脂質染色に使用
オプティMEM	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	31985062	トランスフェクション用の還元血清培地
酸化低密度リポタンパク質(Ox-LDL)	益元バイオテクノロジーズ(中国)	YB-002	泡細胞形成誘導に使用されます
ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシン	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	15140122	細胞培養用の抗生物質サプリメント
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	78830	プロテアーゼ阻害剤
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	10010023	洗浄および希釈バッファー
ポリ(乳酸コグリコール酸)(PLGA、50:50;MW 90,000)	大連美倫バイオテクノロジー(中国)	MB5649-1	ナノ粒子製造のためのポリマー
ポリカーボネート膜フィルター(200 nm、400 nm)	ワットマン(イギリス)	800282	押出作業に使用
塩化カリウム(KCl)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	P9333	溶解バッファーの成分
P3000試薬	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	L3000001	トランスフェクションエンハンサー
ロータリーミクロトーム	ライカ・バイオシステムズ(ドイツ)	RM2235	パラフィン切断に使用
シリンジポンプ	ハーバード・アパラタス(アメリカ)	70-3007	制御されたナノ粒子形成に使用
透過電子顕微鏡(TEM)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	タロス F200S	ナノ粒子イメージングに使用
トリスHCl	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	T2663	バッファ成分
腫瘍壊死因子α(TNF-&α;)	R&Dシステムズ(アメリカ)	410 MT	内皮細胞の活性化に用いられます
超純水	ミリQ(メルク、アメリカ)	ZMQSV0T01	ナノ粒子の製剤および透析に使用