CD47およびインテグリンα4/β1修飾マクロファージ膜被覆ポリ(乳酸共グリコール酸)ナノ粒子の単離、合成、および特性解析

Summary

このプロトコルにより、CD47およびインテグリンα4/β1共修飾マクロファージ膜被覆ポリ(乳酸共グリコール酸)ナノ粒子の製剤と特性評価が可能となり、標的薬物送達用途に用いられます。

Abstract

動脈硬化は慢性炎症性疾患であり、心血管の罹患率と死亡率に大きく寄与しています。抗炎症薬を動脈硬化部位に標的的に投与することは依然として大きな課題です。本件では、CD47およびインテグリンα4/β1共修飾マクロファージ膜被覆コルヒチン充填ポリ(乳酸共グリコール酸)ナノ粒子(MMM/COL NPs)の調製および特性解析に関する詳細なプロトコルを提示します。プロトコルには、プラスミドトランスフェクションおよびエンドテリン1刺激によるマクロファージ修飾、膜分離、NP製造、膜コーティングが含まれます。得られたMMM/COL非天然体は、物理化学的特徴付け、タンパク質発現解析、in vitroおよび in vivo アッセイを用いて評価されます。機能的検証には、活性化された内皮細胞との細胞関連の評価、マクロファージの取り込み、泡細胞の抗炎症効果、マウス動脈硬化モデルにおける生体分布の評価が含まれます。さらに、実験室間の再現性と一貫性を確保するために、主要な実験パラメータや品質管理ステップも強調されています。このプロトコルは、動脈硬化研究における標的薬物送達アプリケーションのための生体模倣NP生成のための堅牢かつスケーラブルなアプローチを提供します。

Introduction

動脈硬化は慢性炎症性疾患であり、動脈腔狭窄および不安定なプラーク破裂による致命的な心血管イベントや脳卒中を引き起こし、世界的な健康負担の大きな要因となっています^1,2,3。動脈硬化部位における炎症反応のダウンレギュレーションは主要な^{治療標的です。}強力な抗炎症薬であるコルヒチンは、心血管の有害事象を軽減する可能性を示しています^6,7。しかし、臨床的には治療期間が狭く全身的な副作用があるため、毒性を最小限に抑えつつプラーク部位での蓄積を促進するための標的的な投与システム^{が必要です。}

細胞膜被覆ナノ粒子(NP)は、^源細胞の自然な生物学的機能を活用し、標的薬物送達の強力なプラットフォームとして登場^{しています。}動脈硬化に関与する細胞タイプの中で、マクロファージは重要な役割を果たします 12,13,14。マクロファージ上で発現するインテグリンα4/β1は、活性化された内皮細胞(ECs)に発現する血管細胞接着分子-1(VCAM-1)に結合することで、動脈硬化性プラークへのリクルートを媒介します。CD47は「食べないで」という信号で、単核食細胞システムによる食細胞回避を可能にします^15,16。マクロファージ膜を自然のマクロファージ膜と比べて過剰発現させるように工学的に設計することで、インテグリンα4/β1–VCAM-1の相互作用による標的強化とCD47介在シ^{グナル伝達}による食細胞作用の低減を持つNPを作製できます。二重修飾戦略は、活性化されたECへの標的強化と食細胞クリアランスの低減を同時に行うことで、ネイティブの膜被覆NPおよびリガンドベースの標的システムを改良します。これらのタンパク質のベースラインレベルのみを発現するネイティブマクロファージ膜とは異なり、私たちの遺伝子設計膜は免疫原性を引き起こす可能性のある合成標的リガンドを導入することなく、機能性を高めます。

本プロトコルは、CD47およびインテグリンα4/β1共修飾マクロファージ膜でコーティングされたコルヒチン充填ポリ(乳酸共グリコール酸)NP(COL NPs)の製剤と特性解析を詳細に説明し、修飾マクロファージ膜被覆NP(MMM/COL NPs)を生成します。RAW 264.7マクロファージの遺伝的および薬理学的修飾方法、修飾膜の単離、PLGA非点滴剤の調製とコーティング、包括的な in vitro および in vivo 機能アッセイの方法を述べます。この方法は、動脈硬化研究における標的薬物送達用途のためのバイオミメティックNPの準備と評価のための再現性のある枠組みを提供します。

Protocol

本プロトコルで記載されたすべての動物処置は、南京ドラムタワー病院の動物ケア・利用委員会によって承認され、国立衛生研究所が定めた実験動物のケアおよび利用に関するガイドラインに従っています。

1. RAW 264.7マクロファージの修飾

1. RAW 264.7細胞を準備し、10%胎児用牛血清(FBS)と1%ペニシリン・ストレプトマイシンを補足したDulbecco's Modified Eagle培地を完成させ、CD47過剰発現プラスミド、リポフェクタミン3000型トランスフェクション試薬、エンドテリン-1(ET-1)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、および滅菌組織培養用品を補充します。
2. RAWで264.7細胞を37°Cの加湿インキュベーターで5%のCO₂で培養し、6ウェルプレートで1ウェルあたり約4〜5個×10個⁵ セルに達するまで細胞を保持します。
3. CD47修正を実行してください
   1. プラスミドDNA溶液を、2.5μgのプラスミドDNAと5μLのP3000試薬を125μLのOpti-MEM血清フリー培地で混合して調製します。
   2. トランスフェクション試薬溶液を3.75μLのトランスフェクション試薬を125μLの血清フリー培地に希釈して準備します。
   3. これらのボリュームは6ウェルプレート形式に使います。他のフォーマットに対してすべての成分を比例的にスケールしつつ、DNA:P3000比を1:2(μg:μL)とDNA:トランスフェクション試薬比を1:1.5(μg:μL)に保ちます。
      注意:例えば、10cmの皿にはDNA10μg、P3000220L20μL、トランスフェクション試薬15μLを使用します。
   4. DNA溶液とトランスフェクション試薬溶液を混ぜ、25°Cで15分間培養します。
   5. トランスフェクション複合体を抗生物質フリーDMEMに10%FBSを補足し、約2〜2.5個×10個^6細胞/ 10cm皿に添加します。
   6. 移植から6時間後に抗生物質を含む新しい完全培地に交換してください。
4. インテキシンα4/β1修飾を行う
   1. 100 nM ET-1を血清フリー培地で24時間刺激し、インテグリンα4/β1の発現をアップレギュレーションします。
      注:CD47、インテグリンα4、インテグリンβ1の定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)およびウェスタンブロット解析による修飾効率を検証してください。

2. 修飾マクロファージ膜(MMM)の単離

1. 改造されたRAW 264.7細胞をセルスクレーパーで採取します。
2. 細胞を900× gで4°Cで5分間遠心分離します。
3. セルペレットは冷たい1×PBSで3回洗います。
4. 細胞ペレットを2 mLの予冷却低トニック溶解バッファー(トリスHCl10 mM、pH 8.0、KCl1 mM、MgCl₂ 1.5 mM、フェニルメチルスルフォニルフッ化物1 mM)に再懸浮させ、氷上で15分間インキュベートします。
5. 懸濁液を液体窒素で2分間凍結し、その後37°Cの水浴で5分間解凍します。凍結融解サイクルを5回繰り返して細胞を完全に溶除します。
   注意:液体窒素は重度の低温火傷を引き起こす可能性があります。適切な断熱手袋と顔保護具の使用を心がけてください。
6. 溶解液を850×gで4°Cで10分間遠心分離し、核と未破壊細胞を除去します。
7. 収集した上清液を15,000 × gで4°Cで30分間遠心分離します。 膜純度を高めるためには、15,000 × g遠心分離後に得られた上清液を超遠心分離機に移し、100,000 × gで4°Cで1時間遠心分離機を用いて遠心分離します。
   注意:超遠心分離管は適切にバランスを取り、高速遠心分離に対応していることを確認してください。これによりローターの不均衡や故障を防ぎましょう。
   注:超遠心分離は細胞内小器官の汚染が減少した精製された形質膜を得ます。
8. MMM断片を含むペレットを採取し、300μLの1×PBSまたは溶解バッファーに再懸濁させ、約1–2 mg/mLのタンパク質濃度を得ます。
9. BCAタンパク質定量アッセイキットを用いて膜タンパク質濃度を測定します。
   注:分離膜は後で使用するために−80°Cで保存可能です。

3. コルヒチン負荷PLGA非中性物質(COL NP)の製剤

1. PLGA10mg(50:50、MW 90,000)とコルヒチン1mgをジメチルスルホキシド(DMSO)1mLに溶かします。
   注意:DMSOは皮膚に浸透し、他の物質の吸収を促進する可能性があります。取り扱い時には適切な個人用保護具(ニトリル手袋、白衣、安全ゴーグル)を着用してください。DMSO含有溶液を有機溶媒廃棄物として収集し、認可された有害廃棄物処理サービスを通じて処分します。コルヒチンは有毒で、潜在的に催奇形を引き起こす可能性があります。コルヒチン汚染物質(溶液、手袋、チューブ)を有害医薬品廃棄物として収集し、機関および地域の規制に従い認可された有害廃棄物処理サービスを通じて処分してください。
2. 10mmテフロンコーティングされた攪拌棒を使った磁気攪拌器を使い、25°Cで500rpmで溶液をかき混ぜます。
3. 5 mLの注射器と26Gの針を装着したシリンジポンプを使い、25°Cで超純水4 mLを約1 mL/分の速度で滴り加えます。
4. NPの形成を待つために3時間ほど混ぜ続けてください。
5. NP懸濁液を透析バッグ(MWCO 3,500 Da)に移します。
6. 蒸留水2リットルで4°Cで200rpmの優しくかき混ぜて透析します。
7. 透析を24時間続け、6時間、12時間、24時間ごとに透析バッファーを完全に交換して遊離コルヒチンとDMSOを除去します。
   注意:透析に含まれるすべての有機溶剤や試薬は、有機化学廃棄物として回収してください。排水口に捨てないでください。機関の有害廃棄物処理プロトコルを遵守してください。
8. 透析されたCOLのNP懸濁液を採取し、4°Cで保存します。
   注:COL非物質は短期間(最大3日間)4°Cで保存可能です。蛍光標識では、Step 3.1中に1,1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′-テトラメチルリンドカルボシアニン過塩素酸塩(DiI)染料を0.1%(w/w)混入します。
9. DMSOと遊離コルヒチンの除去を確認しましょう
   1. 最終的な透析液(24時間後の最後の変化後のバッファー)を採取し、紫外線・可視光(UV–vis)分光光度法で分析します。
   2. 透析液を200〜400nmの距離でスキャンし、対照サンプル(新鮮な透析バッファー)と比較します。
   3. 約210 nm(DMSO特徴)および345 nm(コルヒチン特徴)に吸収ピークが存在しないことを確認し、残留溶媒および遊離薬物の除去が成功したことを示します。
   4. または、製造元の指示に従ってDMSOアッセイキットを使って残留DMSO濃度を測定する方法もあります。残留DMSOが0.1%(v/v)未満であることを確認し、下流アッセイでの細胞毒性を防いでいます。

4. 膜被覆NP(MMM/COL NP)の製造

1. ステップ2.7の分離MMM懸濁液を40kHz、110Wの水浴ソニックケーターで20分間ソニック処理します。サンプルの容量を1.5mLチューブ内に維持し、必要に応じて氷浴で25°C以下に温度を保ちます。
2. ミニエクストルーダーを用いて、400nmの孔径を持つポリカーボネート膜フィルターを通して超音波膜懸濁液を押し出し、膜小胞を形成します。
3. ステップ3.5のCOL NPsとMMM小胞を膜タンパク質対PLGA質量比1:1で混合します。
   1. タンパク質定量アッセイで測定された10 mgのPLGAに対して、10 mgのタンパク質を含む膜懸濁液を使用します。
   2. 1mLピペットで、COL非点滴とMMM小胞を上下に15回優しく混合します。
4. 混合液を200nmの孔径のポリカーボネート膜フィルターに共押出し、15回の打ち出しを繰り返します。
5. MMM/COL非物質を含む懸濁液を回収し、4°Cで保存してすぐに使用します。

5. NPの特徴付け

1. 動的光散乱(DLS)を用いて流体力学的直径、多分散指数(PDI)、ゼータポテンシャルを以下の条件下で測定します:温度25°C;後方散乱角173°;平衡時間は2分;サンプルごとに3回の重複測定が行われます。
2. サンプルを脱イオン水(最終濃度約0.1 mg/mL)で20倍に希釈します。
   注:希釈は複数の散乱効果を最小限に抑えます。
3. 透過電子顕微鏡(TEM)を用いてMMM/COL非核のコア–シェル構造を可視化します。
   1. 5μLのNP懸濁液(約0.1 mg/mL)を、発光放電の炭素コーティング銅グリッド(300メッシュ)に置きます。
   2. サンプルを25°Cで2分間吸着させます。
   3. 余分な液体は、フィルターペーパーでグリッドの縁に優しく触れて拭き取ります。
   4. グリッドに1%ウラニル酢酸塩溶液5μLを塗布し、25°Cで1分間培養します。
   5. 余分なシミはろ紙で落とします。
   6. 画像撮影前にグリッドを完全に自然乾燥させてから少なくとも10分間待ちます。
      注意:ウラニル酢酸は有毒で放射性があります。適切な個人用防護具(手袋、白衣、目の保護具)を着用し、廃棄物は機関の有害物質ガイドラインに従って処分してください。
4. ステップ2の段階で膜を3,3′ジオクタデキロキサカルボシアニン過塩素酸塩(DiO)染料で標識し、膜分離前に完全な細胞を標識し、PLGAコアにはDiIで標識します。
5. 共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて、DiO(緑)とDiI(赤)信号の共局在を解析します。
   1. 励起/放出パラメータを以下のように設定します:DiO(緑)、励起488 nm、放出550 nm;DiI(赤色)、励起561 nm、放出620 nm。
   2. 60×のオイルイマージョン対物レンズ(数値絞り1.4)を使いましょう。
   3. ピンホールを1エアリー単位に設定してください。
   4. ピクセル飽和を避けるように検出器ゲインを調整してください。
   5. 解像度1024×1024ピクセルで2×ライン平均で画像を取得します。
   6. 光漂白を最小限に抑えるためにレーザー出力を5%未満に保ちましょう。
6. ウェスタンブロット解析を用いて、MMM/COL NP表面上のCD47、インテグリンα4、インテグリンβ1の存在を解析します。
7. 薬物の負荷と放出を決定
   1. DMSO中に100μLのNPを溶除し、345nmでコルヒチン吸収を測定して薬物負荷と封入効率を測定します。
   2. 約100μgのコルヒチンを含むMMM/COL非依存性懸濁液1 mLを透析バッグ(MWCO、3,500 Da)に入れます。
   3. 袋を密封し、20%のFBSを含むPBS50mLに100mLのガラスビーカーに浸します。
   4. 20mmテフロンコーティングされた攪拌棒を備えた磁気攪拌器を使い、100rpmで一定に攪拌しながら放出媒体を37°Cに保ちます。
   5. 実験中はシンクの状態を維持してください。
      注:20% FBSを使ったPBSにおけるコルヒチン溶解度は> mg/mLです。放出培地中の最大コルヒチン濃度は飽和度の<10%です。
   6. あらかじめ決められた時刻(0、1、2、4、8、12、24、36、48、62h)に500μLの放出媒体を取り出します。
   7. 抽出した体積を、同じ量の新鮮な予温されたPBS(37°C)で、FBS20%を含むものに置き換えます。
   8. 採取したサンプルのコルヒチン濃度を345 nmのUV–Vis分光光度法で測定します。
   9. すべての測定は三重に行ってください。

6. in vitro 機能的アッセイ

1. 種子ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)。10 ng/mLの腫瘍壊死因子α(TNF-α)で細胞を24時間刺激し、VCAM-1をアップレギュレートします。
2. MMM/DiI非ナッツとHUVECsの細胞関連
   1. 細胞をDiI標識MMM/COL非自然体(MMM/DiI NPs)を、5% CO₂の大気中、37°Cで4時間培養します(PLGAコア質量に基づく)。
   2. セルを事前に冷やしたPBSで3回洗います。洗った後、セルを300× gで4°Cで5分間遠心分離します。
   3. 洗浄された細胞を0.5%の牛血清アルブミン(BSA)を含むPBSに再懸浮させます。最終的な細胞濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。
   4. フローサイトメトリーまたはCLSMの器具パラメータを設定します。549 nmの励起と565 nmの発光(PEチャネル)を用いてDiI蛍光を検出します。
   5. サンプルからデータを取得してください。フローサイトメトリーのために1サンプルあたり少なくとも10,000件のイベントを取得し、CLSMの代表フィールドを捕捉してください。
   6. 60×のオイル浸漬レンズを用いて、エッジを除く異なる領域から各サンプルに5つの代表的なフィールドを選びます。セルが無傷で重なっていないことを確認してください。
   7. 画像取得前にサンプルをブラインドします。特定のエリアを手動で選ぶのではなく、ステージをランダムに動かしてフィールドを選択します。
   8. 盲検条件下ですべてのサンプルに同一の閾値および分析パラメータを適用します。
   9. FSC-A/SSC-Aゲーティングでセルのデブリを除外します。FSC-A/FSC-Hゲーティングでシングルレットセルを選択します。
   10. 生存染料染色で生細胞を選択します。7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)を1 μg/mLで加え、暗い場所で4°Cで5分間インキュベートし、生細胞ゲーティングに使用します。
   11. 蛍光強度を解析して細胞関連を定量化する。定量指標として平均蛍光強度を用いましょう。FlowJo(v10.8.1)フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータ解析を行います。
3. RAW 264.7マクロファージによるMMM/DiI非点着剤の細胞取り込み
   1. 未修飾のRAW 264.7マクロファージを50 μg/mL濃度(PLGAコア質量に基づく)で、5% CO₂大気中で37°Cで4時間培養します。
   2. ステップ6.2.2–6.2.3に記載された解析のためにセルを準備してください。
   3. 549 nmの励起と565 nmの発光(PEチャネル)を用いたDiI検出の装置パラメータを設定します。
   4. サンプルからデータを取得してください。サンプルごとに少なくとも10,000件のイベントを取得してください。
   5. FSC-A/SSC-Aゲーティングでセルのデブリを除外します。FSC-A/FSC-Hゲーティングでシングルレットセルを選択します。
   6. 生存染料染色で生細胞を選択します。7-AADを1 μg/mLで加え、暗い環境で4°Cで5分間インキュベートし、ライブセルゲーティングに使用します。
   7. 細胞の取り込みを定量化するために蛍光強度を解析します。定量指標として平均蛍光強度を用いましょう。フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータ解析を行います。
4. フォームセルアッセイ
   1. RAW 264.7細胞を発泡細胞に分化させ、酸化低密度リポタンパク質(oxLDL)と50 μg/mLで48時間培養します。細胞内脂質蓄積によって示されるオイルレッドO染色による泡細胞形成を確認します。
   2. 泡細胞を遊離コルヒチン、COL NPs、またはMMM/COL NPsで、同等のコルヒチン濃度1μMで処理します。細胞を37°Cで5%のCO₂を含む加湿大気で24時間培養します。
      注意:この濃度は、細胞の生存率および抗炎症効果を評価する予備的投与反応実験に基づいて選択してください。
   3. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて炎症性サイトカインレベルを測定します。
      1. 治療直後(24時間後)に細胞培養上清液を採取してください。
      2. 300 × gで4°Cで5分間遠心分離し、細胞の残骸を除去します。
      3. 精製された上清液を洗浄管に移し、−80°Cで保存して分析します。
      4. 製造元の指示に従い、ELISAキットを使用してTNF-αおよびインターロイキン6レベルを測定してください。
      5. すべての測定は三重井戸で行い、実験を独立して3回繰り返します。
      6. 細胞シーディング密度と処理条件がすべてのグループで一貫しているため、追加の正規化なしにサイトカイン濃度を絶対値(pg/mL)として報告してください。

7. 動脈硬化モデルにおけるin vivo治療的応用

注:すべての動物処置は、関連する施設動物ケア・利用委員会の承認が必要です。

1. 動物モデルの確立
   1. 8週間齢のオスアポリポプロテインEノックアウト(ApoE⁻/⁻)マウス(C57BL/6背景)において脆弱な動脈硬化プラークモデルを確立します。
   2. マウスには手術前1週間、脂肪15%、コレステロール0.25%を含む高脂肪食を自由に与え、手術後4週間続けます。
   3. マウスにはイソフルラン(誘導時に2%–3%、維持時に1.5–2%)を麻酔し、頸動脈収縮手術中に鎮痛のためにブプレノルフィン(0.1 mg/kg、皮下投与)を投与します。
   4. 左総頸動脈を動脈横に置いた直径0.3mmの針で収縮させます。動脈と針の両方に6-0のシルク結帯を結び、その後針を抜いて部分的な収縮を作ります。
   5. 手術後4週間で組織学的評価により脆弱なプラーク形成を確認します。
   6. ヘマトキシリンとイオシン(H&E)、オイルレッドO、マッソンの三色染色を行い、プラークの形態、脂質沈着、コラーゲン含有量を評価します。
   7. 脆弱なプラークは、血管断面積>40%、線維状キャップ<厚120μm、脂質コア面積>全プラーク面積の40%、そして十分なCD68陽性マクロファージ浸潤で定義します。
2. 尾静脈から2 mg/kg(PLGAコア質量に基づく)でDiI標識済みMMM/COL非ナショナルナショナルノッツ100 μLを静脈内注射します。
   1. 注射後1日目のマウスを生 体内 イメージングシステムを用いて全身の生物分布を評価します。
      1. マウスにはイソフルランで麻酔します(誘導時は3%、維持時は1.5%〜2%で、酸素流量は1/分と0.5 L/min)。呼吸数と足の指をつまむ反射で麻酔の深さをモニタリングしてください。
      2. 画像診断時にはマウスを37°Cの加熱台に仰向けに置き、体温を保ちます。
      3. DiI設定(励起549 nm、放出565 nm)を用いて蛍光画像を取得し、CY3またはTRITCフィルターセットを使用します。自動露光モード(通常50〜200ms)とエピ蛍光取得を用いてください。
      4. 対応するブライトフィールド画像を同時に、1024ピクセル×1024ピクセルの解像度で解剖学的参照のために撮影します。
   2. 主要臓器や頸動脈を採取し、体外蛍光画像撮影を行います。
      1. マウスにはイソフルランで麻酔を行います(誘導時は3%、維持時は2.5〜3%)。
      2. 左心室穿刺で20mLの氷冷PBS(pH7.4)を5 mL/分の流量で灌流し、残留血液と結合していないNPを除去します。
      3. 注射後24時間経過後、灌流直後に心臓、大動脈、肝臓、脾臓、腎臓、肺などの臓器を採取します。
      4. 採取した臓器を氷のように冷たいPBSで洗い流し、表層の血液を除去します。
      5. 大動脈を縦方向に開き、ステンレス製のピンで黒いシリコーンプレートに平らに(内皮面が上)にピンで固定します。
      6. 組織は氷のように冷たいPBSで保管し、収穫後30分以内に体外蛍光画像診断を行います。画像検査直前に組織表面の過剰なPBSを除去してください。
3. 投与と治療を行う
   1. 初期用量反応研究(0.01–0.45 mg/kg、n = 7/グループ)からコルヒチンの用量を決定します。治療用量として0.05 mg/kgのコルヒチンを選択してください。
   2. 尾部静脈注射で100μLを投与し、NP用量2 mg/kg(PLGAコア質量)とコルヒチン用量0.05 mg/kgに対応します。1日1回、14日間連続で注射してください。
   3. マウスをランダム番号生成器を用いて、PBS、遊離コルヒチン、MMM/COLNP群にランダム化します。処理群を盲検した2人の観察者によるすべての定量化を行います。
   4. >20%の体重減少、移動障害、苦痛の兆候など、人道的な評価を適用してください。
4. エンドポイント解析を実施
   1. 最終注射から24時間後にネズミを安楽死させてください。頸動脈と大動脈を採取してください。大動脈のオイルレッドO染色によるプラーク負荷の評価。
   2. プラーク面積を定量化する
      1. 画像解析ソフトを用いて、画像解析ソフトを用いて、オイルレッドO陽性面積を大動脈腔総面積に占める割合(マウス1匹あたり5節)で定量化します。
      2. 画像をImageJ画像解析ソフトで開いてください。
      3. 画像をクリックして→ → 8ビットと入力して画像をグレースケールに変換してください。
      4. 画像をクリックして→しきい値を調整→。Otsu法を選択し、しきい値を適用してオイルレッドO陽性領域を特定します。
      5. すべてのサンプル画像に同じしきい値パラメータを適用し、検証のためにしきい値設定を記録します。
      6. 「分析」→「測定値セット」をクリックし、「エリア」を選択してください。
      7. 選択された領域を定量化するには「分析→測定」をクリックしてください。
      8. 定量化されたデータをエクスポートします。
   3. プラークの安定性を評価する
      1. H&E、Oil Red O、Masson's Trichrome染色を用いて頸動脈断面の組織学的染色によるプラーク安定性を評価する。コラーゲンをマッソンの三色陽性青色面のプラーク面積の割合として定量化します。
      2. 5μm厚のパラフィン埋め込み切片と、8μm厚さの最適切断温度埋め込み凍結切片を準備します。
      3. H&E染色は脱パラフィン化と再水和断片を行い、その後室温(RT;23°C±2°C)でヘマトキシリン染色5分、エオシン染色2分を行います。
      4. 凍結切片に対してオイルレッドO染色を行う際、オイルレッドOの作業液をRTで15分間培養します。切片を60%イソプロパノールで2秒間分離し、蒸留水で洗い流します。
      5. キットの説明に従って、ワイガートの鉄ヘマトキシリンを10分、ポンソー酸フクシンを5分、ホスホモリブジック酸を5分、アニリンブルーをRTで5分間培養してマソンのトリクロム染色を行います。
      6. 画像解析ソフトウェアで組織学的画像を開いてください。
      7. カラー閾値を適用してコラーゲン陽性領域を特定します。自動しきい値測定を行い、すべてのサンプル画像に同じパラメータを適用します。
      8. 検証のために閾値設定を記録してください。
      9. 総プラーク面積を血管内膜内のすべてのプラーク面積の合計と定義します。
      10. プラーク面積を手作業で測定するか、自動閾値セグメンテーションを用いてすべてのプラーク領域を特定します。
      11. コラーゲン陽性の部位を測定してください。
      12. コラーゲン含有量をコラーゲン陽性面積で総プラーク面積で割ったもの×100%と計算します。
   4. マクロファージ含有量の評価
      1. マクロファージ含有量を評価するためにCD68免疫蛍光染色を行います。マクロファージ含有量をプラーク面積のCD68陽性面積の割合として定量化します。
      2. 組織切片(パラフィン埋め込み切片は厚さ5μm)を準備します。高圧下でシトレートバッファー(pH 6.0)を用いて抗原回収を行います。
      3. RTで5%BSAを30分間ブロックします。
      4. ウサギ抗マウスCD68モノクローナル一次抗体(クローンD4B9C、1%BSAで希釈1:200)を4°Cで一晩培養します。
      5. Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG二次抗体(希釈1:500)を1時間RTでインキュベートします。
      6. 4′6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)で核を5分間カウンター染色します。
      7. 画像解析ソフトウェアで蛍光画像を開いてください。
      8. 閾値測定を用いてCD68陽性領域を特定します。自動しきい値測定を行い、すべてのサンプル画像に同じパラメータを適用します。
      9. 検証のために閾値設定を記録してください。
      10. CD68陽性の領域を測定してください。
      11. マクロファージ含有量はCD68陽性面積を総プラーク面積で割ったもの×100%で計算します。

Results

DLS測定はZetasizer Nano ZSシステムを用いて25°C、後方散乱角173°で行われました。サンプルは脱イオン水で20倍に希釈され(最終濃度は約0.1 mg/mL)、測定前に2分間平衡状態にされました。各試料は三重に測定され、結果は平均±標準差として示されています。DLSおよびTEMは膜コーティング後のNPサイズの増加を示し、コア・シェル構造の形成を確認しました(図1)。COL非点数は流体力学的直径180.8±5.2 nm、PDIは0.12±0.03、ゼータポテンシャルは−17.2±0.67 mV(n = 3)です。膜コーティング後、MMM/COL非点検は6.1 nm±202.0、PDIは0.15 ± 0.04、ゼータ電位は−27.4±1.84 mV(n = 3)を示します。典型的な質量回収は、10 mgのPLGA(収率87%)から8.7 ± 0.4 mgです。最適でない結果としては、多分散指数(PDI > 0.3)の増加、サイズ均一性の低さ、またはコーティング後...

Discussion

本プロトコルは、標的型動脈硬化治療のためにCD47およびインテグリンα4/β1共修飾マクロファージ膜被覆NPを構築・適用するための包括的な方法を提供します。このシステムの主な利点は、インサイトロ取り込みアッセイ(図3)および 生体内 バイオ分布結果(図4)によって支持されているように、インテグリンα4/β1–VCAM-1相互作用による能動的ターゲティングとCD47介護シグナル伝達に関連するマクロファージの取り込み減少です。単純なネイティブ膜ではなく、改造された膜を使用することで、特定の治療的に関連する特性が強化されます。二重修飾戦略は、NP薬物送達における2つの主要な障壁に同時に対処しつつ、免疫原性を引き起こす合成標的リガンドを導入しない点で独特です。

プロトコル内の重要なステップには、マクロファージ修飾の効率性、膜分離の完全性、押出時の膜コーティングの均一性が含まれます。膜分離...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	A1310	フローサイトメトリーの生死判別のための生存性染料
Alexa fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	A-11008	CD68免疫蛍光染色のための二次抗体
抗マウスCD47抗体	アブカム(アメリカ)	AB214453	CD47発現を検証するためのウェスタンブロット解析に使用
抗マウスインテグリン&アルファ;4抗体(B-2)	サンタクルーズ・バイオテクノロジー(アメリカ)	SC-376334	ウェスタンブロット解析でインテグリンとアルファの検証に使用され、4 式
抗マウスインテグリン&ベータ;抗体1個(A-4)	サンタクルーズ・バイオテクノロジー(アメリカ)	SC-374429	ウェスタンブロット解析でインテグリンとベータを検証するために使用されます。1 式
ApoE-/-ネズミ	ジャクソン研究所(アメリカ)	該当なし	in vivo動脈硬化モデルに使用
BCAアッセイキット	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	23225	タンパク質濃度の測定に用いられます
黒いシリコーンプレート	該当なし	該当なし	体外画像検査のために大動脈を取り付けるために使われていました
CD47プラスミド(pcDNA3.1(+))	ジェネレイ・バイオテック(中国)	G0177361-1	マウスのCd47遺伝子を含み、過剰発現を起こす
コルヒチン	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	C9754	ナノ粒子における治療ペイロード
共焦点レーザー走査顕微鏡	ライカ・マイクロシステムズ	TCS SP8	蛍光イメージングおよび共局在解析に使用
クエン酸バッファー(pH 6.0)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	該当なし	免疫蛍光染色における抗原回収に使用
透析チューブ(MWCO 3,500 Da)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	PURD35030	ナノ粒子精製に使用
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	D2447	ナノ粒子製剤用溶媒
DiI(1,1′-ジオクタデシル-3,3,3&プライム;,3′-テトラメチルリンドカルボシアニン過塩素酸塩)	ビヨタイム(中国)	C1036	ナノ粒子コアの蛍光標識
DiO(3,3′-ジオクタデキロキサカルボシアニン過塩素酸塩)	ビヨタイム(中国)	C1038	マクロファージ膜の蛍光標識
ディレクター	ビヨタイム(中国)	Y239280	生体内蛍光イメージングに使用
ダピ	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	D3571	蛍光イメージングのための核式カウンターステイン
ダルベッコ改良型イーグル中型(DMEM)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	11965092	細胞培養培地
動的光散乱アナライザー(ゼタサイザー・ナノZS)	マルバーン・パナリティカル(イギリス)	該当なし	ナノ粒子サイズ、PDI、ゼータポテンシャルの動的散乱(DLS)測定に使用されます
ELISAキット	R&Dシステムズ(アメリカ)	ターゲットサイトカインによります	炎症性サイトカインの定量に使用されました
エンドセリン-1(ET-1)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	E7764	インテグリンとアルファを刺激するために使用されました。4/&β;1 式
胎児用牛血清(FBS)	Gibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ)	10091148	細胞培養培地のサプリメント
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス(アメリカ)	FACSCalibur	蛍光信号取得に使用
フローサイトメトリー解析ソフトウェア(FlowJo v10.8.1)	BDバイオサイエンス(アメリカ)	該当なし	フローサイトメトリーデータ解析に使用
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)	福恒バイオテクノロジーズ(中国)	FH1122	in vitro targeting アッセイに使用
画像解析ソフトウェア(ImageJ)	米国国立衛生研究所(NIH)	該当なし	定量的画像解析に使用
生体内イメージングシステム	パーキンエルマー(アメリカ)	IVIS ルミナIII	全身蛍光イメージングに使用
イソプロパノール(60%)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	34863	オイルレッドO染色時の差別化に使用されます
リポフェクタミン3000	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	L3000001	トランスフェクション試薬
磁気攪拌棒と攪拌棒	該当なし	該当なし	ナノ粒子製製に使用
マッソントリクロムステインキット	アブカム(アメリカ)	ab150686	コラーゲン染色に使用
ミニエクストルーダー	アヴァンティ・ポーラー・リピッズ(アメリカ)	610000	膜押出に使用
マウスRAW 264.7細胞株	福恒バイオテクノロジーズ(中国)	FH0328	マクロファージの供給源
マウス平滑筋細胞株	福恒バイオテクノロジーズ(中国)	FH-Y063	安全性評価に使用
オイルレッドO	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	O0625	脂質染色に使用
オプティMEM	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	31985062	トランスフェクション用の還元血清培地
酸化低密度リポタンパク質(Ox-LDL)	益元バイオテクノロジーズ(中国)	YB-002	泡細胞形成誘導に使用されます
ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシン	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	15140122	細胞培養用の抗生物質サプリメント
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	78830	プロテアーゼ阻害剤
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	10010023	洗浄および希釈バッファー
ポリ(乳酸コグリコール酸)(PLGA、50:50;MW 90,000)	大連美倫バイオテクノロジー(中国)	MB5649-1	ナノ粒子製造のためのポリマー
ポリカーボネート膜フィルター(200 nm、400 nm)	ワットマン(イギリス)	800282	押出作業に使用
塩化カリウム(KCl)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	P9333	溶解バッファーの成分
P3000試薬	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	L3000001	トランスフェクションエンハンサー
ロータリーミクロトーム	ライカ・バイオシステムズ(ドイツ)	RM2235	パラフィン切断に使用
シリンジポンプ	ハーバード・アパラタス(アメリカ)	70-3007	制御されたナノ粒子形成に使用
透過電子顕微鏡(TEM)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ)	タロス F200S	ナノ粒子イメージングに使用
トリスHCl	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	T2663	バッファ成分
腫瘍壊死因子α(TNF-&α;)	R&Dシステムズ(アメリカ)	410 MT	内皮細胞の活性化に用いられます
超純水	ミリQ(メルク、アメリカ)	ZMQSV0T01	ナノ粒子の製剤および透析に使用