環境研究のための効率的な幹細胞由来マウス胚盤胞モデルの構築

Summary

このプロトコルは、iGATA4-ブラストイドの生成と解析を説明しています。iGATA4-ブラストイドは、マウス胚盤胞の系統組織やキャビテーションなどの主要特徴を再現し、初期胚発生に影響を与える環境的および分子的撹乱の再現可能かつ高スループットの評価を可能にします。

Abstract

幹細胞ベースの胚モデルは、初期哺乳類の発生と環境的変動に対する感受性を調査するための強力なプラットフォームを提供します。ここでは、胚性幹細胞(ESC)、栄養圏幹細胞(TSC)、および誘導性GATA4発現用に設計された胚性幹細胞(iGATA4-ESC)を用いて高忠実度マウス胚盤体を生成するための堅牢でアクセスしやすいプロトコルを提示します。このシステムは、自然なE4.5胚盤胞の形態、系統比率、転写署名を正確に再現するiGATA4-ブラストイドを生成し、原始内胚葉(PE)、エピブラスト(EPI)、栄養胚葉(TE)区画の信頼性の高い in vitro モデルを提供します。このプロトコルはまず、胚盤形成に必要な3つの幹細胞集団を維持・準備する方法を示します。次に、着床前培養条件下でのiGATA4ブラストイドの段階的な組み立て方法を概説し、重要な実験パラメータを強調します。厳密な特性評価を可能にするため、ブラストイド固定、染色、画像診断のための検証済みワークフローが提供されています。最後に、iGATA4ブラストイドがハイスループットアッセイにどのように利用できるかを示す例を示します。大規模なブラストイド集団を特定の環境要因にさらすことで、形態、系統の割り当て、発生進行の変化を迅速かつ再現性に定量化できます。このプロトコルは、着床前の発生モデリング、初期系統決定の解析、環境や分子による胚盤形成への影響を評価するマルチパラメトリックスクリーニングの実施のためのスケーラブルなプラットフォームを確立します。

Introduction

初期哺乳類胚がどのように自己組み立てを行い、一般的な環境要因がその形成に悪影響を及ぼすかを理解するには、再現可能で実験的にアクセス可能かつ拡張可能なモデルシステムが必要です。胚性幹細胞と胚外幹細胞を組み合わせて生成される統合胚様モデルが、^{そのようなプラットフォームを提供します1,2}。このプロトコルは、胚性幹細胞(ESC)、栄養圏芽細胞(TSC)、誘導性GATA4発現用に設計されたESC(iGATA4-ESC)を、着床前条件下で組み立てて、強靭で適切に比例した原始内胚葉(PE)、エピブラスト(EPI)、栄養胚葉(TE)系統を持つ胚盤菌を生成する方法を説明しています。最近の研究では、これらの構造(iGATA4-胚盤3)が系統比率、転写署名、機能マーカー発現においてE4.5胚盤胞に類似していることが示されています。in vitro培養時には、これらの構造のうち12.5%が着床後の形態に移行します。重要なのは、毒物検査や環境検査に適合していることです。

この技術の開発は、既存のブラストイド系の制限に動機づけられました ^2,4,5。多くのプロトコルは6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 初期胚盤胞に似たキャビテーション構造を生成しますが、ほとんどは効率が比較的低いか、PE形成が不完全、細胞同定が不明確、または系統比率が誤った構造を生み出します。これらの不整合は、機構解析や高スループット摂動スクリーニングへの適性を低下させます。PEの生体内仕様はGATA6、SOX17、GATA4、SOX7²²の活性化に続き、PEまたはその誘導体である内臓内胚葉(VE)の欠陥が着床周の発達を妨げるため^{、23,24,25,26,27}がこの転写プログラムをin vitroで強制しますブラストイドの忠実度を向上させる。条件付きGATA4トランスジーンを持つESCは強健にVEへと転分化し、着床後条件下でESCやTSCと組み合わせることで、ガストレーションと器官形成を開始する統合胚モデルを生成^します。ここではこの原理を着床前の条件に適用し、iGATA4-ESCが安定してPEを生成し、自然な胚盤嚢胞に非常に似た胚盤を生成することが示されています³。

この方法は、幹細胞を用いた胚盤胞モデリングの従来の限界を克服し、高い胚盤形成効率(形成される構造の80%がブラストイドで、そのうち75%が適切な系統組織と比例を示します)と高い胚類似性を提供します。さらに、各胚盤胞系統が独立培養された幹細胞集団から派生するiGATA4-ブラストイドのモジュール式組み立てにより、各胚区画への直接的な実験的アクセスが可能となります。これらの特性により、システムはマルチパラメトリックスクリーニング用途に特に適しています。形態学的に一貫した構造の大規模なコホートと正確に比例されたTE、EPI、PE系統を生成するため、自然胚では達成できない統計的検出力で系統特異的応答の並行的な摂動と定量化を可能にします。

原理証明として、生理的範囲^{32、33、34、35、36、37、38} で提示された一般的な環境要因が胚盤の発生に与える影響を測定しました。カフェイン、ニコチン、エタノール、アミノ酸修飾がキャビテーション速度、形態、適応度、系統比率に与える影響を、濃度範囲と時間的処理期間で評価しました。ほとんどの条件(カフェイン、エタノール、ニコチン、低タンパク食を模倣するもの)は異常な胚盤形成と構造品質の低下をもたらしました。一方、高タンパク食に似た分岐鎖アミノ酸の濃度を上げることで、ブラストイド形成の効率と質が向上しました。これらの結果は、 in vitro培養された自然マウス胚盤胞³で観察された効果と一致し、このシステムが微妙で線量依存的な表現型を捉え、自然胚では実現できない拡張可能で多次元的なスクリーニングパイプラインを支持していることを示しました。

胚モデリングのより広い文脈において、この手法は、統合された着床後発生をモデル化するために用いられる同じ細胞が、着床前モデルとしても活用できることを示しています。この手法は、正確なPE形成と堅牢な系統統合を伴う胚盤胞様構造のスケーラブルなモデリングを必要とする応用に特に適しています。しかし、他の幹細胞ベースのマウス胚盤胞モデルと同様に、iGATA4胚盤胞は宿主マウスに移植後、着床やさらなる発育に失敗し、胚と母体の相互作用の研究には適していません。全体として、このプロトコルは哺乳類胚の初期細胞型決定をモデル化する高精度胚盤状の生成に信頼性が高くアクセスしやすいアプローチを提供します。

Protocol

このプロトコルで記載されているすべての手技は確立された細胞株を対象とし、カリフォルニア工科大学の機関的バイオセーフティガイドラインに従って実施されました。生きた動物や人間の被験者実験は行われませんでした。

複数のESCおよびTSC系統が検査され、iGATA4-ブラストイド形成を支持することが認められています。過去の研究で²⁸ のESC、iGATA4-ESC、TSCsが用いられ、このプロトコルで記述されたすべての手順を成功裏に完了しています。同じ著者らは、既に確立されたCD1(ICR)マウスESC系統からiGATA4-ESCの生成について説明しています。

TSCは市販のマウス胚性線維芽細胞(MEF)の上に培養されます。このプロトコルで使用されるすべての化学物質、試薬、キット、機器、ソフトウェアは材料 表に一覧化されています。

1. 胚盤形成のためのマウス幹細胞の培養

1. MEFフィーダープレートの準備
   1. 6ウェルの培養プレートに、1井戸あたり0.2%(w/v)ゼラチン1.5mLを脱イオン水(DI)に塗布します。ノールモキシアで37°Cで少なくとも45分間孵育します。
   2. インキュベーション中は、15mLの遠心分離機チューブに4mLのFC培地(表1)を37°Cに預熱して準備します。
   3. MEFバイアルを水浴で解凍し、フィギュアエイトの動きで小さな氷の球だけが残るまで続けます。内容物を準備済みのチューブに移し、ピペットを上下に動かして十分に混ぜます。遠心分離機で500 ×g で4分間加熱します。
   4. 上澄液を吸引し、ペレットを1 mLのFC培地に再懸濁させます。1.5mLで1ウェルあたり約160,000個の細胞をプレートにできる十分な体積に調整します。
   5. ゼラチンを吸引し、1ウェルあたり1.5mLのMEFをプレートします。ノールモキシアで一晩、乱されずに潜伏します。
   6. 翌日、培地を新鮮な1.5mLの1ウェルFC培地に置き換えます。培地は48時間ごとに交換してください。メッキから2〜7日後にMEFを使用してください。MEFはより長く健康を保つ可能性がありますが、TSCの成長を支える能力は損なわれる可能性があります。

注意: BSL-2技術を用いて、すべてのマウス細胞培養をバイオセーフティレベル(BSL)1層流キャビネットで実施します。

2. マウス胚性幹細胞(WT ESCおよびiGATA4-ESC)の解凍および通過
   1. 解凍WT ESCまたはiGATA4-ESCは 、手順1.1.1–1.1.3に従って設置されます。遠心分離後、細胞を1 mLのN2B27/2i/LIF培地に再懸濁させ(表1)、ゲラチン被覆の6ウェルプレートに1ウェルあたり約50,000個の細胞をシードし、1ウェルあたり約1.5 mLのシードを行います。ノールモキシアで37°Cで培養し、培地を48時間ごとに交換します。
   2. 通過前にコロニーがぎゅっと詰まり、丸く、突起が最小限であることを確認しましょう。2〜3日ごとに通過します。
      注: WT ESCとiGATA4-ESCは、ドキシサイクリン(DOX)による誘導まで形態的に区別できません。
   3. 6ウェルプレートに1井戸あたり1.5mLの0.2%ゼラチンをDI水に塗布します。37°Cで少なくとも45分間孵育します。
   4. 1ウェルあたり500μLの細胞解離試薬を加え、3分間インキュベーションします。FC培地2mLを加えながら、縁を優しくピペットで動かします。顕微鏡で>90%剥離を確認しろ。細胞がまだ付着している場合は、再懸濁を助けるために優しくピペットを使います。
   5. 細胞懸濁液を15mLの遠心分離機チューブに移し、500 ×g で4分間遠心分離機に入れます。
   6. 上澄液を吸引し、ペレットを1 mLのN2B27/2i/LIF培地に再懸浮させます。ヘモサイトメーターで10μLを用いて細胞濃度を測定します。1井戸あたり50,000セルのシード量を調整してください。
   7. ゼラチンを吸引して細胞に種をまきましょう。ノールキシアで培養します。翌日から48時間ごとに培地を変えてください。
3. マウス栄養芽細胞(TSC)の解凍と通過
   1. TSCは 手順1.1.1–1.1.3に従って解凍します。遠心分離後、細胞を1mLのTSF4H培地に再懸浮させ(表1)、MEF被覆された6ウェルプレートに1ウェルあたり約20,000個の細胞をシードします。37°C、5% CO₂、5% O₂(低酸素状態)で培養し、24時間ごとに培地を交換します。
   2. 群落は大きく(直径>75μm)、通過前に平らにしてください。1ウェルあたり500μLの細胞解離試薬を加え、5分間インキュベートします。優しくピペッティングしながらFC培地2mLを加えます。>90%の分離を確認しろ。
   3. セルを遠心分離機のチューブに移し、500 × g で4分間回転させます。
   4. 1 mLのTSF4H培地に再懸浮します。濃度を決定し、1井戸あたり約20,000セルに調整します。
   5. MEFにプレートを貼り付け、低酸素状態で培養します。コロニー融合前は24時間ごとに培地を交換し、2〜3日ごとに通過します。

2. iGATA4-ブラストイドの形成

1. 細胞凝集のためのマイクロウェル集積プレートの準備
   1. マイクロウェル集体プレートの各ウェルに500μLの付着防止洗浄液を加えます。2,000 × g で5分間遠心分離機にし、適切なバランスを取ってマイクロウェルから閉じ込められた空気を除去します。ノールモキシアで37°Cで少なくとも1時間または一晩孵育します。
2. ブラストイド準備、0日目 — WTおよびiGATA4-ESCの準備と板付け
   1. 前温めたN2B27/2i/LIF、FC、FCYL培地(FC + 10 ng/mLマウス組換えLIF(mLIF)+2 μM ROCK阻害剤Y27632)を37°Cまで。 0.2%ゼラチンをDI水に準備し、細胞解離試薬を用意してください。
   2. 井戸の底に触れずに粘着防止液を吸引してください。1 mLのPBSで2回、1 mLのFCYL培地で1回洗ってください。壁に沿ってピペットを動かしてマイクロウェルを傷つけないようにしてください。
   3. 細胞の通過用にゼラチンコーティングされた6ウェルプレート(≥45分の培養)を準備します。
   4. WTおよびiGATA4-ESCは、培地を吸引し、1ウェルあたり500μLの細胞解離試薬を加えて収穫します。37°Cで3分間培養します。 2mLのFC培地を加え、優しくピペットを使います。顕微鏡で完全に剥離を確認してください。15mLのチューブに移し、500 ×g で遠心分離機で4分間浸します。
   5. 1 mLのFCYL培地に再懸濁します。ヘモサイトメーターで10μLを用いて細胞濃度を測定します。50万〜70万細胞/mLに調整します。1マイクロウェルあたり5WTのESCと5つのiGATA4-ESCに必要な体積(1ウェルあたり6,000セル)を計算します。
      注: 必要に応じて他のESC回線にも最適化してください。開始範囲は1マイクロウェルあたり4〜7個のESC、ESCとiGATA4-ESCの比率は1:1です。
   6. 1ウェルあたり500μLのセル懸濁液を準備します。1000μLピペットを使ってマイクロウェル集体プレートにドロップワイズで添加します。100 × g で遠心分離機を3分間かけて均等分布を確認しましょう。6時間培養し、集合体が形成されるまで待つ。
   7. セクション1.2に記載された残存ESCの通路。
3. 胚盤調製、0日目 — TX培地の準備
   1. DMEM/F12を用いて~20 mL TX基礎培地を製製します(表2参照)。各実験のために新鮮な準備をしましょう。
      1. 200μL、200mL、L-アラニル-L-グルタミンサプリメント(最終2mM)を追加。在庫は4°Cで保管してください。
      2. ペニシリン/ストレプトマイシン200 μL(10,000 U/mL)を加えます(最終100 U/mLずつ)。−20°Cで保存します。
      3. 40 μL 32 mg/mL L-アスコルビン酸(最終64 μg/mL)を加えます。DI水で準備し、ろ過して滅菌し、−20°Cで保存します。
      4. 20μLのセレナイトナトリウム(最終14 ng/mL)を加えます。−20°Cで準備・保存します。
      5. 240μLのNaHCO₃(最終543μg/mL)を加えます。解凍後はよく混ぜます。
      6. ホロトランスフェリン20μL(最終10.7 μg/mL)を加えます。解凍後に混ぜてください。
      7. インスリンを~37.5μL(最終19.4μg/mL;バッチ依存)を加えます。保存温度は4°Cです。
   2. 使用直前に、Y27632を最終濃度20μMに加え、3μMにCHIR99021、IL-11から30 ng/mL、FGF4を25 ng/mL、ヘパリンを1 μg/mL、mLIFを10 ng/mL、TGFβを15 ng/mL、8Br-cAMPを25 μMに加えます。
4. ブラストイド調製、0日目 — TSCの準備と盛り付け
   1. TSF4H、FC(表1)、TXメディア(セクション2.3)を予備して行う。MEF枯渇のためにゼラチンコーティングプレート(≥45分)を準備します。
   2. TSCは1ウェルあたり500μLの細胞解離試薬を加え、低酸素状態で5分間培養します。2mLのFC培地を加え、優しくピペットを使います。分離を確認。チューブに移し、遠心分離機で500 ×g で4分間加熱します。
      注: TSCは>4日間培養した場合、最大10分間の細胞解離試薬処理が必要になることがあります。
   3. 1 mLのTSF4H培地に再懸浮し、適切な容量に1:2の分割でメッキを調整します。
   4. MEFの枯渇のためにゼラチン被覆されたウェルにプレートを付けます。低酸素状態で潜伏~45分。MEFはほぼ未接続のまま、MEFは必ずアタッチメントされるようにしてください。
   5. マイクロウェル集約プレートウェルの900μL培地を500μLのTX培地に置き換えます。低酸素状態に戻れ。
   6. TSC含有上清液を、結合したMEFを乱さずにチューブに移送します。濃度(目標500,000〜700,000細胞/mL)を決定します。
   7. 1マイクロウェルあたり12TSCの体積(14,400セル)を計算します。さらに濃縮が必要な場合は遠心分離機を使います。
      注: 他のTSC系統(1マイクロウェルあたり10〜15セル推奨)にも最適化してください。
   8. 1ウェルあたり500μLのセル懸濁液をドロップごとに加えます。遠心分離機で100 ×g で3分間加熱します。分布を確認し、24時間低酸素状態で潜伏してください。
   9. 必要に応じて残りのTSCを通過(セクション1.3)。
5. ブラストイドの準備、1日目 — 誘導
   1. TSC添加後約24時間後、1ウェルあたり5 mM 8Br-cAMPを20 μL、1 μg/mLのDOXを1 μL加えます。低酸素状態で48〜72時間潜伏。
6. ブラストイド準備、3日目 — 固執
   1. 切断した1000μLピペットチップを使って骨材を再懸濁します。2 mLのチューブに移し、5分間沈殿させます。
   2. 上清液を取り除き、4%パラホルマルデヒド(PFA)250μLを加えます。優しく再懸吊してください。
      注意: PFAは適切なPPEを用いて排気フードで取り扱いましょう。
   3. 15分間孵化し、5分ごとに弾きます。
   4. PFAを除去し、300μL PBST(PBS + 0.1% Tween-20)を加えます。優しく混ぜてください。4°Cで保存してから<1週間保存してください。
7. 胚盤の免疫蛍光
   1. 1サンプルあたり150μLを96ウェルのU型底板に転送します。
   2. 100μLの透過バッファーを加え、20分間インキュベーションします。一次抗体溶液に置き換え、4°Cで一晩培養します。
   3. 3回×PBSTで洗い(1回5分)。二次抗体を加えます。
   4. 暗闇の中、室温で2時間孵化します。
   5. 洗う3×からイメージングディッシュに移します。
   6. 共焦点顕微鏡による画像(≥25×対物レンズ、NA ≥0.8)。

3. iGATA4ブラストイドモデルを用いた高スループットスクリーン

1. iGATA4ブラストイド製剤および環境要因の試験
   1. セクション 2.1 で説明されたマイクロウェル集積プレートを準備し、 セクション2.2–2.4に従ってiGATA4ブラストイドを生成する。適切な管理を含む十分な井戸を準備してください。ブランクコントロール(標準プロトコルで製製されたブラストイド)、キャリアコントロール、そして1つ以上の実験条件を含めること。
   2. 低酸素状態で一晩培養します。TSCシーディングから約24時間後に、8Br-cAMP、ドキシサイクリン(DOX)、および目的化合物(またはキャリア制御)を補足したTX培地を準備します。以下の条件が試験されています。
      1. カフェイン:3.5 mg/L、超純水のストックから希釈されています。
      2. ニコチン:330 ng/L、100%エタノール(EtOH)ストックから希釈。
      3. エタノール:17 mM、絶対EtOHから希釈。
      4. 高分枝鎖アミノ酸(BCAA):基準濃度に対して+5%、+25%、+50%(0.45 mM L-ロイシン、0.45 mM L-バリン、0.42 mM L-イソロイシン)は、超純水の濃縮ストックから調製されます。
      5. 低メチオニンおよびロイシン:基準濃度に対して−5%、−25%、−50%、−100%(0.12 mM L-メチオニン、0.45 mM L-ルイシン)、Met/LeuフリーDMEM/F12を用いて調製。Met/LeuフリーのDMEM(LM-DMEM)は使用前にHam's F-12栄養ミックスを1回補給します。
         注意: 濃縮されたカフェインとニコチンのストックを、適切な個人用防護具(PPE、手袋、白衣、目の保護具)を用いて、排気フードで準備・取り扱いしてください。エタノールは可燃性であり、熱源から遠ざけなければなりません。
   3. 各ウェルから培地を吸引し、1mLの化合物を含むTX培地を加えます。乾燥を避けるために、一度に一口ずつ処理してください。プレートを低酸素インキュベーターに戻し、3日目まで培養してください。
   4. 2日目には透過式光学顕微鏡を用いて代表的な明視野画像を撮影します。構造を固定し、セクション 2.6 および 2.7に記載された免疫蛍光検査を行います。
      注: 実験目的に応じて処理ウィンドウを調整してください。治療は初期の凝集(1日目)から後期段階(例:空洞拡大)に適用されます。例としては、1日目から3日目、1日目から2日目(その後メディア交換)、2日目から3日目が含まれます。
2. マルチパラメトリックiGATA4-ブラストイド解析
   1. ブライトフィールド画像を用いて、キャビテーション構造(すなわち明確に定義された中央空洞を持つ構造)を含む井戸の割合を定量化し、ブラストイド直径を測定します。
      1. 画像解析ソフトで画像を開きます。
      2. 直線ツールを使って各構造物に線を引いてください。
      3. Analyze > Measureを使って直径を測定してください。
   2. 代表的な免疫染色サンプル(1個の生物学的複製につき20〜40個の構造、各条件につき少なくとも3つの生物学的複製)と、 セクション2.7に記載された画像を選択します。
   3. 免疫蛍光マーカー(TE(CDX2陽性)、EPI(SOX2陽性およびSOX17陰性)、PE(SOX17陽性)を用いて、総細胞数と系統組成を定量化します。
   4. PE細胞が内側の細胞塊(ICM)内でEPI細胞と空間的に分離されているかどうかを判定することで、構造組織と形態を評価します(二項分類:はい/いいえ)。
   5. 形態を良好(明確な胚盤嚢胞状構造で空洞があり、適切に組織されたTE、EPI、PE区画)、平凡(不規則な形状や部分形成された空洞などの軽微な異常)、または悪い(空洞の欠如や系統の未整理・未分類などの重大な異常)に分類します。
   6. 該当する場合は、空洞の大きさや体積などの追加パラメータを定量化します。プロットや統計解析にはバイオインフォマティクスツールやその他のツール、セルカウントや表示用の画像準備には3D画像解析ソフトウェアを活用しましょう。

Results

ESCおよびiGATA4-ESC(ノルマキシア)、TSCs(低酸素症)を適切な培養条件下で維持することは、成功した胚盤生成に不可欠です。前述の培養で、ESCとiGATA4-ESCはほとんど区別がつかず、3日後には中型で丸く、明確なコロニーを形成します。平坦な群落や突き出た縁の出現は分化の初期段階を示しており、これらの培養は胚盤形成に使用すべきではありません。TSCは、やや盛り上がった縁と平らな中心を持つ平らな上皮コロニーを形成するべきです。TSCコロニーが過剰に成長したり融合したりすると(通常は培養で3日後>)、胚盤状の結果が悪化することが多いです(図1)。

iGATA4-ブラストイドの組み立て過程で、いくつかの初期の特徴がプロトコル成功を示す(図2A、B)。ESCおよびiGATA4-ESCの凝集から約6時間後には、マイクロウェルの底部に密密な細胞集合体が確認されるはずです。緩い凝集体は細胞解離試薬の過剰曝露を示唆しており、細胞間接着が減少しています。次のステップへの進捗(TSC追加;セクション2.4)は、タイトな集合体が観測された場合にのみ発生するべきです(図2B、D0.5の時刻点)。この段階の免疫染色では均一なSOX2⁺およびGATA4⁻集合体が示されるはずです(図2B、D0.5時点)。

TSCの追加と一晩の培養後、CDX2⁺細胞に囲まれた単一の凝集した集合体が明らかになるはずです(図2B)。集合体の表面に大きくて未集体な細胞が存在することは、残留MEFを示すことが多いです。MEF汚染はブラストイド生成効率を低下させる可能性があります。したがって、集合前に主にTSC集団を得るためには、十分なMEF枯渇が不可欠です。残留MEFを除去するために40μmの細胞ストレーナーを使用することもありますが、TSC収率は低下する可能性があります。不完全または過剰なCDX2⁺カバレッジは、1マイクロウェルあたりの追加TSC数(推奨範囲:10〜15)を調整することで修正できます。

DOXと8Br-cAMPを追加した後、虫歯は通常2日目までに観察され、3日目まで続くことがあります。明視野顕微鏡下では、空洞はブラストイド内の明確で空洞の空間として現れます(図2B、C;白い破線)。GATA4⁺細胞はDOX誘導直後に現れ、徐々にICM様区画の表面に分類されます(図2B)。成功したブラストイド形成は、高いキャビテーション効率(通常、マイクロウェル集積板あたり構造の約80%、 図2D)は、単層のCDX2⁺ TE様外上皮、胞盤腔様空洞、そしてGATA4⁺ PE様細胞が重なるSOX2⁺ EPI様細胞を含む丸みを帯びたICM様区画(図2C–E)です。

一般的な最適でない結果には、キャビテーションされていない構造、複数の空洞やICMのような区画を持つ不規則な形状のブラストイド、構造や細胞破片が少ない井戸などがあります。約20%の異常構造が予想されます(図2C)が、より高い割合は誤ったTX製備、初期細胞品質の低さ、初日のDOXまたは8Br-cAMPの添加失敗、培地交換時の構造置換などの問題を示す可能性があります。

高スループットスクリーニング用途では、未処理および車両制御井戸から、ポジティブコントロール条件と同等のブラストイドが得られるべきです(図3A,B)。実験的処理は、ブラストイドサイズ(図3C)、キャビテーション効率、全細胞数および系統特異的細胞数(図3D)、PEの選別、全体的な形態(図3E)など、複数の品質指標に影響を与える可能性があります。例えば、ブラストイド形成時にカフェイン、ニコチン、エタノールを投与すると、キャビテーション効率が低下し、全細胞数やICM細胞数が減少し、PEの分類が障害され、形態が悪化しました。対照的に、分岐鎖アミノ酸の濃度が増加すると、より大きくキャビット化した胚盤が生成され、細胞数が増加し形態も改善されました(図3C–E)。実験間での生物学的変動が期待されており、各実験にブランクコントロールとキャリアコントロールの両方を含めることの重要性が強調されています。

図1:良質および低品質のWT ESC、iGATA4-ESC、TSCの例。 W2B27/2i/LIF(ESC)またはTSF4H培地(TSCs)で培養2–3日後に期待されるコロニー形態を示すWT ESC、iGATA4-ESC、TSCのブライトフィールド顕微鏡写真。「WT ESCs – 悪い品質」と題されたパネルは、突出した縁を持つ平坦なコロニー(赤い矢じり)を含む、最適でない形態を持つ細胞を示しています。「TSC overgrown」というパネルには、4日間の培養後に統合・拡大したTSCコロニーが示されています。スケールバー:全パネルで100μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:iGATA4-ブラストイドの回路図および予想される形態。 Developmental Cell, Vol. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent Sら, 環境研究のための効率的な幹細胞由来マウス胚モデル、pp. 193–207.e6、著作権(2025)³、Elsevierの許可を得て。(A) 自然マウス胚盤胞発生の概略的表現(上)およびWT ESC、iGATA4-ESC、TSCを用いた幹細胞ベースの胚盤胞モデリング。
(B) プロトコルの異なる段階で期待される形態やマーカー発現を示す顕微鏡写真。最大強度投影(MIP);破線で空洞を区切っています。スケールバー:20μm。(C) iGATA4ブラストイドの3日目の明視野画像。スケールバー:100μm。
(D) 常常性または低酸素状態で事前培養されたTSCを用いて生成されるiGATA4-ブラストイドのキャビテーション率;集合体は低酸素条件下で培養されました。n ≥ 4;誤差棒は平均の標準誤差を表します。(E) 系統マーカー(CDX2、シアン;10月4日、赤;GATA4、緑色)です。最大強度投影(MIP);示されたところに単一のZ平面。スケールバー:25μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3。環境要因が胚盤形成および品質に与える影響。(A) 環境要因(カフェイン、ニコチン、エタノール、高タンパク・低タンパク食を模倣する条件)で処理したiGATA4ブラストイドの代表的な免疫蛍光3D画像(上)およびIMARIS表面再構築(下)。スケールバー:全画像で25μm。(B) 実験ワークフローの回路図。(C) 異なる処理条件下でのブラストイド直径。この範囲は10パーセンタイルから90パーセンタイルを表しています。ボックスは四分位差範囲を示し、線は中央値を示しています。統計解析は一方向ANOVAを用いて複数比較を行いました。(D) 対照および処理された胚盤の全(灰色)、栄養胚葉(シアン)、エピブラスト(赤)、原始内胚葉(緑)細胞数の定量化。棒は平均を表し、誤差バーは標準偏差を表します。統計解析は一方向ANOVAを用いて複数比較を行いました。(E) 制御および治療条件下で、「良好」(形態異常が最小限の適切な系統分類)、「平凡」(形態がほぼ正しいが軽微な異常、EPI–PEの未完全な分類を含む)、「悪い」(系統組織が乱れた重度の異常形態)と分類されるブラストイドの割合を定量化すること。統計解析は対照条件に対して二因子ANOVAを用いて実施されました。すべてのパネルについて、n ≥ 3.統計的有意は *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001 と示されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

メディア	試薬	最終集中
FC
	DMEM	N.A.
	熱不活性化FBS(iFBS)	15%
	グルタマックス	2 mM
	2-メルカプトエタノール(2-ME)	0.1 mM
	非必須アミノ酸(NEAA)	1回
	ナ・ピルバート	1回
	ペニシリン–ストレプトマイシン	1回
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	神経基底A	50%
	B27サプリメント	1回
	N2サプリメント	0.5倍
	2-ME	100μM
	ペニシリン–ストレプトマイシン	1%
	グルタマックス	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	マウス組換えLIFの	10 ng/mL
TSF4H
	メガセル RPMI-1640 メディウム	N.A.
	iFBS	20%
	グルタマックス	2 mM
	ナ・ピルバート	1回
	ペニシリン–ストレプトマイシン	1回
	FGF4	25 ng/mL
	ヘパリン	1 μg/mL

表1:FC、N2B27/2i/LIF、TSF4Hのメディアレシピ。 FCメディア、N2B27/2i/LIF培地、TSF4H培地の最終濃度を準備するレシピ。

構成要素	最終集中	家畜の集中度	溶剤と貯蔵	体積は~20 mLまで
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS、-20°Cで保存	100μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO、-20°Cで保存	6 μL
DMEM/F12	該当なし	該当なし	4°Cで保存	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	PBSに0.1%のBSA、-20°Cで保存	5 μL
L-アラニル-L-グルタミンサプリメント	2 mM	200 mM	4°Cで保存	200 μL
ヘパリン	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS、-20°Cで保存	20 μL
ホロトランスフェリン	10.7 μg/mL	10.7 mg/mL	DI水、-20°Cで保存	20 μL
ヒトTGF-β1	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0.1% BSA、-20°Cで保存	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	PBSに0.1%のBSA、-20°Cで保存	24 μL
インスリン	19.4 μg/mL	9.5 - 11.5 mg/mL	濃度はバッチごとに異なり、4°Cで保存します	33.7〜40.8 μL、ストック濃度に応じて体積を調整してください。
L-アスコルビン酸-2-リン酸マグネシウム	64 μg/mL	32 mg/mL	DI水、-20°Cで保存	40 μL
マウス組換えLIFの	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0.1% BSA、-20°Cで保存	20 μL
NaHCO3	543 μg/mL	45.25 mg/mL	DI水、-20°Cで保存	240 μL
ペニシリン/ストレプトマイシン	1回	100倍	-20°Cで保存	200 μL
セレナイトナトリウム	14 ng/mL	14 μg/mL	DI水、-20°Cで保存	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO、-20°Cで保存	20 μL

表2:TX用メディアレシピ。 TX媒体の調製方法、小分子やその他の試薬の調製・保存方法、最終濃度の詳細。

Discussion

iGATA4-ブラストイドは、ESC、誘導性GATA4-ESC(iGATA4-ESC)、および低酸素培養TSCの3つの細胞型を自己組織化することで、マウス胚盤胞の非常に効率的な胚様幹細胞ベースのモデルを提供します。これらの構造は、適切な系統比率や転写同一性などE4.5胚盤胞の主要特徴を再現し、多パラメータ環境スクリーニングに利用可能で、胚盤胞の発達段階の欠陥を確実に反映します³。最近の研究では、基礎胚盤培地におけるESC、iGATA4-ESC、TSCの集合も高効率な胚盤形成をもたらすことが示されており、このアプローチが実験室^{や培養条件下}で強靭かつ適応性が高いことが示されています。iGATA4-ESCは、移植後幹細胞ベースの胚モデル28,29,30,31においてVE細胞の機能を再現することが既に示されています。これらの結果を総合すると、iGATA4-ESCがPE/VE細胞の発生段階を越えた胚モデリングにおいて、柔軟かつ信頼性の高い代替手段として機能できることが示されています。

高品質なブラストイドを達成するためには、プロトコルのいくつかのステップが重要です。これには、特に低酸素培養TSCs(図1)を含む、初期細胞集団の質が含まれます。TX培地の準備は、0日目に新鮮に準備されるべきです(表2;第2.3節);そして集積後のプレートの慎重な取り扱い。プロトコル成功の主な指標には、キャビテーション効率(通常~80%)、適切な形態(直径約100μm、ブラストコール様空洞、CDX2⁺ TE様外層、SOX2⁺およびGATA4⁺の内側細胞質量(約3 TE:1 EPI:1 PE比)の有無、そして適切に選別されたGATA4⁺ PE様層の存在が含まれます。これらは^{1、2、4、5}の分野で一般的に使われる指標です。キャビテーションしたブラストイドでは、約75%の構造がこれらすべての特徴を示しています。これらの指標はトラブルシューティングの初期指標として利用できます。細胞質が最適でない状態は通常、異常なコロニー形態に反映され、構造の集積が不十分またはキャビテーションがなくなることがあります。不適切な培地調製は不完全な凝集や系譜欠陥を引き起こす可能性があり、粗い取り扱いでは1マイクロウェルや空井戸あたり複数の骨材が発生することがあります。

さらなる最適化には、シードセル数の調整(推奨開始範囲:4〜7個のESCおよびiGATA4-ESC、1マイクロウェルあたり10〜15個のTSC)、MEF除去法の改良(例:40μmセルストレーナーによるろ過)、TX培地組成の修正が含まれます。例えば、FGF4とヘパリンの除去は効率的なブラストイド形成を支持しつつ、より壁状のTE様の同一性を促進することができます。iGATA4-ブラストイドは培養中最大6日間維持可能です。しかし、4日目から6日目までの構造は、系統の胚盤胞のような割合を保持しながらも大きくなることが多いです。プロトコルは生物学的複製間で一貫した結果をもたらしますが、各実験には適切なコントロールを含めるべきです。

他のマウス胚盤系と比較して、初期細胞群や^{培養条件が}異なる6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 iGATA4-ブラストイドは高い形成効率と正確な系統表現の両方を実現しています。多くの既存のプロトコルはキャビテージ構造を生成し、特定の生物学的応用に有用ですが、PE形成が不完全であったり、細胞同様が不均一または不明確だったり、系統比率が誤っていることがよくあります。3つの系統指向幹細胞集団を段階的に組み合わせることで、iGATA4ブラストイドはこれらの制限を克服し、再現性が高くモジュール化され、実験的にアクセス可能なシステムを提供します。

これらの利点にもかかわらず、いくつかの制約が残っています。TX培地 での4〜 6日以上の長期培養は、系統割合が胚盤胞のようなままであっても過剰増殖を引き起こします。iGATA4ブラストイドの約12.5%は、 in vitroで着床周着床様形態に移行し、これは前羊膜腔を囲むカップ状の擬層化エピブラスト、近位エピブラストに隣接する拡大した胚外外胚葉様コンパートメント、そして外側の内臓内胚層様層を特徴とします。しかし、iGATA4ブラストイドは移植後、着床せず、さらに発育しません。したがって、iGATA4胚盤類およびより広い意味での胚盤類は、着床や胚と母体の相互作用の研究には適していません。

胚盤が着床できない分子的基盤は依然として不明ですが、現在の証拠は不完全な栄養胚葉モデリングが一因である可能性を示唆しています。iGATA4ブラストイド中のTE様細胞は、分子同性が非常に明確です。将来的に、壁状TE細胞により近いTSCの設計や、着床能力のあるTEをよりよく再現する代替細胞株の導入は、これらの制限を克服するための有望な方向性を示しています。iGATA4ブラストイドのモジュール性により、TE特有の修飾をEPIやPE形成に依存しずに実装できるため、このシステムはこのような開発に特に適しています。

これらを総合すると、iGATA4-ブラストイドプロトコルは哺乳類胚における系統指定および初期発生過程の研究に向けた堅牢かつ拡張可能なプラットフォームを提供します。その再現性と適応性により、環境、薬理学、遺伝子スクリーニングの高スループット用途に適しています。このように、iGATA4ブラストイドは初期発生メカニズムの調査や、多様な摂動が着床前発達に与える影響を評価する強力なシステムです。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	一般培養液の調製に使用
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	TX培養液の調製とブラストイドの腔化に使用
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	マイクロウェル凝集プレート; ブラストイドの調製に使用
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	ブラストイドの調製に使用
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	免疫染色中のブラストイドの移動用ワイドボアピペットチップ
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	培養液の調製に使用
Caffeine	Sigma	58-08-2	iGATA4-ブラストイドで試験する環境要因として使用
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	間接免疫蛍光に使用、1:200で使用
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	他のブランド/モデルでも動作する可能性があります。
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	培養液の調製に使用
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	一般的な組織培養目的で使用
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	間接免疫蛍光に使用、1:500-1:1,000で使用
DMEM	Gibco	11995040	FC培養液の調製に使用
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	N2B27およびTX培養液の調製に使用
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Ham's F-12栄養混合物をDMEM-LMに補足し、最終濃度1xに調整して、Met-およびLeu-フリーのDMEM/F12を取得
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	間接免疫蛍光に使用、1:500-1:1,000で使用
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	間接免疫蛍光に使用、1:500-1:1,000で使用
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	間接免疫蛍光に使用、1:500-1:1,000で使用
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	間接免疫蛍光に使用、1:500-1:1,000で使用
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	間接免疫蛍光に使用。4°Cで解凍し、-20°Cでアライコット保存する。
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	ブラストイド調製中のiGATA4誘導用
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	当社ラボで使用。他も使用可能。チューブとプレートアダプターが必要。
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	間接免疫蛍光に使用
FGF4	R&D Systems	5846-F4	培養液の調製に使用
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	画像分析に使用
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	間接免疫蛍光に使用、1:500で使用
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	一般的な組織培養目的で使用
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	間接免疫蛍光とイメージングに
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-alanyl-L-glutamine 補足; 培養液の調製に使用
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	低タンパク質食条件のためのDMEM-LMの補足として使用。
Heparin	Sigma	H3149	培養液の調製に使用
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	他のブランド/モデルでも動作する可能性があります。
Holo-transferrin	Sigma	T4132	TX培養液の調製に使用。
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	TX培養液の調製に使用。
IL-11	PeproTech	200-11	TX培養液の調製に使用。
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	画像分析と画像準備に使用。
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	培養液の調製に使用
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Zernicka-Goetzラボからリクエスト時に利用可能
Insulin	Sigma	I9278	TX培養液の調製に使用。
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	TSC培養のフィーダー層として使用。プロトコルで示されたように解凍し、1週間以内に使用。
L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium	Sigma	A8960	TX培養液の調製に使用。
L-isoleucine	Thermo Fisher Scientific	73-32-5	TX培養液の補足に使用。
L-leucine	Thermo Fisher Scientific	61-90-5	TX培養液の補足に使用。
L-valine	Thermo Fisher Scientific	72-18-4	TX培養液の補足に使用。
Megacell RPMI-1640 Medium	Sigma	M3817	培養液の調製に使用
Miscellaneous pipette tips	Multiple providers	NA	一般的な液体処理用
Mouse recombinant LIF	STEMCELL Technologies	78056	培養液の調製に