DSS誘発性潰瘍性大腸炎マウスにおける梁雪滴煎の統合ネットワーク薬理学、代謝組学、および in vivo での検証

サマリー

本プロトコルは、ネットワーク薬理学、非標的代謝学、in vivo での検証を統合した再現可能なワークフローを説明し、デキストラン硫酸ナトリウム誘発マウスモデルの潰瘍性大腸炎における梁雪滴皇煮込みの多成分メカニズムを明らかにします。

要約

潰瘍性大腸炎(UC)は、持続的な腸の炎症と代謝調節障害を特徴とする慢性炎症性腸疾患です。伝統中国医学(TCM)の処方は炎症性疾患の臨床実践で広く使われています。しかし、これらの多成分・多標的メカニズムを体系的に解明する実験的アプローチは依然として限られています。本論文は、ネットワーク薬理学、非標的代謝学、 in vivo での検証を統合した再現可能な実験プロトコルを提示し、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導マウスモデルUCにおける梁雪滴黄煎じ(LXDHD)の抗炎症効果を調査します。ワークフローには、ハーブ煮込みの調製、DSS誘発性大腸炎モデリング、疾患活動性評価、組織病理学的および血液学的評価、血清サイトカイン測定、LC–MSベースのメタボロミクスプロファイリング、計算ネットワーク解析が含まれます。この統合的アプローチによりDSS誘発性大腸炎が確立され、LXDHD治療により疾患活動指数、結腸長、組織病理学的損傷、炎症性サイトカインレベル、代謝プロファイルにおいて測定可能な改善が見られました。ネットワーク薬理学および代謝学解析により、このプロトコルが治療介入に関連する主要な標的、経路、代謝物の同定を可能にすることがさらに示されました。この可視化・標準化されたワークフローは、炎症性腸疾患における多成分TCM処方の薬理学的メカニズムを研究するための実践的な方法論的枠組みを提供し、他のハーブ処方や疾患モデルにも応用可能です。

概要

潰瘍性大腸炎(UC)は、慢性炎症性腸疾患で、大腸¹の粘膜炎症が継続的に起こり、腹痛、下痢、直腸出血、^{体重減少などの}症状を引き起こします。UCの発症率は世界的に増加しており、医療システムに大きな負担をかけ、患者の生活の質を著しく損なっています³.潰瘍性大腸炎の病因は完全には解明されていませんが、蓄積される証拠は免疫反応の調節不全、炎症性サイトカインの過剰産生、酸化ストレス、代謝障害が疾患の病因に中心的な役割を果たしていることを示しています。

現在のUC治療法には主にアミノサリチル酸、コルチコステロイド、免疫抑制剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的製剤が含まれます^。これらの治療は症状を緩和し寛解をもたらすことがありますが、長期使用は副作用、高額な費用、そして変動する治療反応と関連していることが多い^7,8,9。さらに、かなりの割合の患者が持続的な寛解を達成できず、安全性と多標的有効性が向上した代替または補完的治療法の必要性が浮き彫りになっています。

伝統中国医学(TCM)は何世紀にもわたり消化器系疾患の治療に広く用いられており、^UC10のような複雑な炎症性疾患における潜在的な利益がますます認識されています。単一標的治療とは異なり、TCMの処方は通常、複数の成分が複数の標的や経路に作用することで治療効果を発揮するため、^UC-11の多因子的性質によりよく対応できる可能性があります。臨床および実験的研究により、特定の中医学処方薬は免疫反応を調節し、炎症を抑制し、腸の関門の健全性を保護し、代謝恒常性を調節することが示唆されています。

両雪滴黄煎湯(LXDHD)は、伝統的に「血を冷やし熱を浄化する」ために用いられる古典的な中医の方であり、炎症性疾患や出血性疾患に臨床的に適用されています¹⁶。処方薬には、Scutellaria baicalensis、Phellodendron chinense、Rehmannia glutinosa、Paeonia suffruticosa、Paeonia lactiflora、Sanguisorba officinalis、Platycladus orientalis、Saposhnikovia divaricata、Citrus aurantium、Angelica sinensis、Glycyrrhiza uralensisなどが含まれています.現代の薬理学的研究では、いくつかの成分ハーブおよびその有効成分が抗炎症、抗酸化、免疫調節の特性を持つことが示されています(17,18,19)。しかし、UCにおけるLXDHDの全体的な治療効果や根本的なメカニズムはまだ体系的に解明されていません。

ネットワーク薬理学は、多成分ハーブ処方と疾患関連分子標的との複雑な相互作用を探る効果的なアプローチとして浮上^{しています。}複数のデータベースからの情報を統合することで、ネットワーク薬理学は潜在的な有効化合物、治療標的、シグナル伝達経路を予測し、TCMメカニズムのシステムレベルの理解を提供します²¹。それにもかかわらず、ネットワーク薬理学は主にデータベースの予測に依存しており、 生体内 での代謝変化を直接反映するものではありません。

メタボロミクスは、全般的な代謝変化をプロファイリングする強力なツールとして、疾患の病態生理学や治療的反応に関する補完的な洞察を提供します²²。潰瘍性大腸炎では、メタボロム解析により脂質およびアミノ酸代謝、ならびに酸化ストレス関連^経路に有意な異常が認められ^{ています。}メタボロミクスとネットワーク薬理学を統合することで、予測される分子標的と実際の代謝表現型のギャップを埋め、メカニズム的解釈の信頼性を高めることができます。

本研究では、ネットワーク薬理学、非標的代謝学、実験的検証を組み合わせた統合戦略を用いて、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導マウスモデルのUC(図1A)におけるLXDHDの抗炎症効果および潜在的なメカニズムを調査しました。この全体的な方法論的設計は、in silico予測と in vivo の代謝および表現型検証を統合し、確立された厳密な研究枠組みに適合^{しています。}ネットワーク薬理学解析を用いて、LXDHD治療によって活性化合物、潜在的な治療標的、シグナル伝達経路を特定しました。UCによる代謝変化とLXHDDによる調節を特徴づけるために、非標的メタボロミクスが実施されました。さらに、疾患活動性、組織病理学的変化、血液学的パラメータ、炎症性サイトカインレベルの評価を含むin vivo 実験を通じて主要な発見が検証されました。

計算予測、代謝プロファイリング、生物学的検証を統合することで、本研究はUCにおけるLXDHDの治療効果の基盤となる多成分・多標的・多経路メカニズムを包括的に理解することを目指します。本研究は、LXDHDをUCの補完療法として利用することを支持する実験的証拠を提供するだけでなく、他の複雑なTCM処方のメカニズムを調査するための方法論的枠組みも提供します。

プロトコル

すべての動物実験手順は、実験動物のケアおよび使用に関するガイドラインに従って実施され、南京中国医薬大学付属病院動物倫理委員会(承認番号 #2025DW-034-01)によって承認されました。承認日:2025年3月24日)。両雪滴黄煎湯の調合は、中国薬典^第27巻に記載された手順に従って行われました。プロトコルで使用される試薬、化学物質、ソフトウェアは 材料表に記載されています。

1. 梁雪滴黄煎(LXDHD)の調製

1. 乾燥したハーブ素材はLXDHDの標準的な配合に従って準備してください。11種類の成分ハーブの正確な成分、植物名、そして正確な処方用量は 表1に記載されています。
   注: 使用前にすべてのハーブ材料を、資格のある薬理学者によって認証し、植物の同一性と品質の一貫性を確保してください。再現性のために認証記録を保持してください。
2. 火薬の調合
   1. すべてのハーブ素材は、清潔で換気の良い環境で室温で自然乾燥させてください。
   2. 機械式グラインダーで各ハーブを個別に粉砕し、細かい粉末を得るまで行います。
   3. パウダーは所定の比率に従って混ぜます。
   4. 混合粉末を80メッシュのふるい(内径180μm±7.6μm)に通し、均一な粒子大きさを確保します。
   5. ふるいにかけた粉末を徹底的に均質化します。
      注: 均一な粒子サイズは、一貫した抽出効率のために不可欠です。不完全な挽きや不均一な混合は化学組成のばらつきを引き起こすことがあります。
3. LXDHD水抽出物の調製
   1. 混合したハーブパウダーを正確に計量し、蒸留水を1:10(w/v)の比率で加えます。
   2. 混合物を沸騰させて20分間煮詰めます。
   3. 抽出物をろ過し、ろ過液を回収します。
   4. 残留物に新鮮な蒸留水を加え、さらに20分間繰り返し煮込みます。
   5. 2つのろ過液を組み合わせて最終的なLXDHD水抽出物を得ます。
      注: 二重煮込みは、水溶性および中程度に溶ける成分の両方を効率的に抽出するために不可欠です。
4. 濃縮と貯蔵
   1. 混合した煎じ液を低圧またはやさしい加熱で濃縮し、望む濃度に達するまで続けます。
   2. 抽出物を室温まで冷まします。
   3. 準備済みLXDHD抽出物は4°Cで保存し、48時間以内に使用してください。
      注: 繰り返しの凍結解凍サイクルは避けてください。これらは生体活性化合物を分解し、実験的な再現性を低下させる恐れがあります。
5. 行政
   1. 投与前に抽出物を室温に移してください。
   2. 実験グループ分けに従い、マウスに指定された用量でLXDHDの濃縮水溶液を経口ガベージ投与します。

2. 動物実験設計

1. 動物と飼育環境
   1. 認定実験動物の供給者から、雄のC57BL/6マウス(生後6〜8週、20〜25g)を取得してください。
   2. 標準的な実験室環境下で、12時間の明暗サイクル、温度(22–25°C)、相対湿度(50%–60%)の環境で飼育します。
   3. 実験中はマウスに標準的な食事と水を自由に提供してください。
   4. 実験の少なくとも7日前はマウスが順応するのを待ちましょう。
      注: その後の実験では、正常な活動と体重を持つ健康なマウスのみを取り入れてください。
2. グルーピングと投与量計算
   1. LXDHDのマウス用量は、標準成人体重70kgおよび1日臨床用量8.4g28に基づき、薬理学実験の方法論に記載されたヒト-動物用量変換原理に基づいて計算します。
   2. マウスをランダムに以下のグループに分けます(1群あたりn=6匹):正常対照群、DSS誘発UCモデル群、低用量LXDHD群(1.09g/kg)、高用量LXDHD群(2.18g/kg)、5ASA陽性対照群(100 mg/kg)²⁹。
      注: 選択バイアスを最小限に抑えるために乱数表を用いてランダム化を行います。
   3. 潰瘍性大腸炎の誘発と薬剤投与
      1. 飲料水中で2.5%(w/v)のDSS溶液を準備します。
      2. モデル群、LXDHD処理群、5ASA群のマウスに、7日間連続³⁰分間、自由にDSS溶液を投与します。
      3. 正常対照群のマウスに浄化された飲料水を提供してください。
      4. 実験期間中、治療群に対して1日1回、経口ガベージで対応用量のLXDHDおよび5ASAを投与します。
      5. 通常の制御グループとDSSモデルグループに等量の車両解を投与します。
         注: DSS溶液は新しく準備し、2日ごとに交換してください。DSSのバッチは大腸炎を引き起こす効果に異なる場合があります。新しいバッチを使用した際にはパイロットテストを実施してください。DSS誘発性潰瘍性結腸炎モデルの成功裏の確立は、進行的な体重減少、血便、DAIスコアの上昇、そして著しい結腸短縮が特徴です。これらの基準およびマウス実験の方法論的設計は、確立されたリファレンス基準³¹と整合しています。
3. 外因性代謝学のためのブランクおよび薬物含有血清の調製
   1. 健康なオスのC57BL/6マウスの別コホートを使いましょう。
   2. マウスをランダムに2つのグループに分けます:ブランクグループとLXDHDグループです。
   3. LXDHD群には、2.18 g/kgの経口ガベージでLXDHDを1日1回、7日間連続投与します。
   4. 空きグループに同量の蒸留水を与えます。
   5. 最終投与から1時間後に血液サンプルを採取してください。
   6. 第 3.5節で説明した通り、血液サンプルを処理して血清を取得します。

3. 病害活動の評価

1. 実験中は毎日体重、便の濃度、便出血を監視してください。
2. 体重減少、便の濃度、便出血に基づいて疾患活動指数(DAI)を計算します。具体的なスコアリング枠組みは 表3に詳述されています。次のことを計算します。
   これら3つのパラメータの平均(または合計)としての最終DAIスコア³²。
3. 8日目の終わりに、各グループのマウスに1%のペントバルビタールナトリウム(30 mg/kg)で麻酔します。各マウスの後眼窩静脈神経叢から約400μLの血液を採取します。その後、米国獣医師会(AVMA)の動物安楽死ガイドライン(図1B)に厳密に従い、子宮頸部脱臼によって安楽死させて死亡を確実にします。
   注: 後足のつま先と足底面を優しくつまんで十分な麻酔を確認し、離脱反応がない場合は、十分な麻酔深度を示しています。
4. 結腸組織を採取し、結腸の長さを測定して病症の重症度を判断してください。
   注:結腸長の短縮は、DSS誘発性大腸炎の重症度を示す特徴と^{されています。}
5. 血清の取得
   1. 採取した血液サンプルの一部を室温で1時間凝固させます。
   2. 遠心分離機で1,000 × g 、4°Cで15分間サンプルを取って血清を得ます。
   3. インターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-17、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、およびIL-10の血清レベルを定量化します。
   4. 組織病理学的解析のために大腸組織サンプルを採取してください。
   5. 残った血液サンプルを末梢血液分析に使用してください。
   6. 代謝分析のために追加の血清サンプルを取っておけ。

4. ヘマトキシリン・イオシン(H&E)染色

1. 大腸組織を4%パラホルマルデヒドで少なくとも24時間固定してください。
2. エタノールの段階的な系列を通じて組織を脱水します。
3. キシレンで透明な組織を使い、パラフィンに埋め込む。
4. ミクロトームを使って3〜5μm厚の組織切片を切断します。
5. キシレンで切面を脱脂します。
6. 区画はグラデッドエタノールで再水和します。
7. 核の可視化のためのヘマトキシリンによる染色切片。
8. 細胞質染色のためにエオシンでカウンターステインを施します。
9. 光学顕微鏡で組織病理学的変化を観察し、関連する画像ソフトウェアを使って代表的な画像を撮影します。
10. 炎症の重症度、損傷の深さ、下骨の損傷に基づいて組織学的スコア(HCS)を評価します。
11. 詳細な組織学的スコアリング基準については 表4 を参照してください。
    注: 組織の埋め込み、切片、染色の代表的な画像を撮影し、プロトコルの可視化を強化します。

5. 末梢血液分析

1. 末梢血液サンプルをEDTA-K2抗凝固チューブ(血液1mlあたり1.5 mg EDTA)に採取します。
2. 適切な混合を確保するために、チューブを8〜10回優しく反らせます。
3. 3部構成の獣医血液学分析装置(Mindray BC-2600vet)を用いて、種特異的な校正を用いて血液細胞数を解析します。
4. サンプルは4°Cで輸送。
5. 採取後4時間以内にサンプルを分析してください。
   注: 溶血または凝固を示すサンプルは分析から除外します。

6. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)

注: IL-6、IL-17、IL-1β、TNF-αが主要な炎症促進サイトカインであり、IL-10は主要な抗炎症サイトカインです。これらのサイトカインは炎症反応の存在と重症度を反映しています。³⁴。
これらのサイトカインの測定は、炎症過程の理解や抗炎症治療の有効性を評価する上で極めて重要です。

1. 後眼窩静脈叢から血液サンプルを採取してください。
2. サンプルを室温で1時間凝固させます。
3. 1,000 × g で4°Cで15分間遠心分離機でサンプルを採取します。
4. 市販のELISAキットを用いてIL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10の血清レベルを測定します。
5. 標準のデータ取得ソフトウェアを搭載したマイクロプレートリーダーを使って吸光度を測定します。
6. 標準的な曲線に基づいてサイトカイン濃度を計算します。
   注: すべてのサンプルと標準物質を二重に分析し、技術的なばらつきを減らすこと。

7. 梁雪滴黄煎湯のLC–MS分析

1. 試料の調製
   1. 正確に10gのLXDHD混合生のハーブパウダーを計量しました。
   2. 粉末を30mLの熱湯に溶かします。
   3. 超音波抽出を30分間行ってください。
   4. 抽出物100μLとメタノール400μLを混ぜます。
   5. 10分間のボルテックス。
   6. 遠心分離機で14,000 gで10分間10分間 × 。
   7. 上澄液を試験溶液として採取します。
2. LC–MS条件
   1. Q質量分析計と組み合わせたLCシステムを用いてクロマトグラフィー分離を行います。
   2. C18カラム(150 × 2.1 mm、1.8 μm)を使用してください。
   3. 移動相は以下の通りに設定します:溶媒A、水中の0.1%の蟻酸;溶剤B、メタノール。
   4. 流量を0.30 mL/minに設定してください。
   5. カラム温度を35°Cに設定します。
   6. 注入量を5μLに設定します。
   7. 以下の勾配洗脱プログラムを適用します:
      0–2分、5% B;
      2〜15分、5〜95%のB;
      15〜18分、95%B;
      18〜18.1分、95〜5%B;
      18.1–22分、5% B。
   8. 質量分析パラメータを以下のように設定します:シースガス流量35 arb;補助ガス流量10 Arb;噴霧電圧は3.5 kV(正)、2.8 kV(負)、毛細血管温度は320°C;補助ガスヒーターの温度は350°C。
   9. 正・負イオンモードの両方でMSデータを取得し、m/z100–1500(解像度:70,000)の全MSスキャン範囲で取得できます。
   10. データ依存のMS2(dd-MS2)スキャンを17,500の解像度で実行します。
   11. mzCloudデータベースを使って生データを処理し、化合物を同定します。

8. 血清非標的メタボロミクス解析

1. 血清サンプルの調製および品質管理(QC)
   1. 血清サンプルを氷で解凍する。
   2. 50μLの血清を1.5mLの遠心分離機チューブに移します。
   3. 200μLの冷水メタノール/アセトニトリル(1:1、v/v)を加えます。
   4. タンパク質を沈殿させるために1分間渦を巻きます。
   5. 氷で15分間孵卵します。
   6. 遠心分離機で 14,000 × g 、4°Cで15分間。
   7. 上清液を新しいチューブに移します。
   8. 抽出物を真空濃縮器で乾燥させます。
   9. 100μLのアセトニトリル/水(1:1、v/v)で再構成します。
   10. ボルテックスを徹底的に。
   11. 再び14,000 × gで4°Cで15分間遠心分離機を使います。
   12. LC-MS分析のために上清液を採取してください。
   13. 各サンプルから10μLのアリコットをプールしてQC試料を準備します。
   14. 8〜10個の実験サンプルごとに1つのQCサンプルを注入し、機器の安定性と再現性を監視します。
2. LC-MS取得設定
   1. C18カラム(150 × 2.1 mm、1.8 μm)を用いたLCシステムを用いてクロマトグラフィー分離を行います。
   2. カラム温度を35°Cに設定します。
   3. 流量を0.30 mL/minに設定してください。
   4. 注入容量を2μL(正モード)または5μL(負モード)に設定します。
   5. 溶媒A(水に0.1%の蟻酸)と溶媒B(アセトニトリル、0.1%の蟻酸)を使いましょう。
   6. 線形勾配洗脱プログラムを適用してください。
   7. 質量分析計を正および負のHESIモードで操作してください。
   8. 質量スキャン範囲をm/z100–1500に設定してください。
   9. スプレー電圧を3.5 kV(正)と2.8 kV(負極)に設定します。
   10. 毛細管温度を320°Cに設定してください。
3. データ処理および差別代謝物同定
   1. 生のLC-MSデータ(.rawファイル)をソフトウェアにインポートします。
   2. ピークアライメント、ピークピッキング、ベースライン補正を行います。
   3. 抽出したピーク面積の特徴を全イオン強度に正規化します。
   4. mzCloudおよびChemSpiderデータベースに対して正確な質量(質量許容<5 ppm)およびMS/MS断片化パターンを照合して代謝物を特定します。
   5. 多変量統計解析(PCAおよびOPLS-DA/PLS-DA)を実施します。
   6. 以下の閾値に基づいて差別代謝物を定義します:VIP > 1.0およびp < 0.05(学生のt検定)。

9. ネットワーク薬理学解析

注:ネットワーク薬理学を用いてUC^35,36におけるLXDHDの活性成分および主要標的を予測しました。この方法論には、データベースマイニング、化学情報処理、生物活性データ取得、タンパク質標的回帰、遺伝子発現プロファイリング、相互作用ネットワーク構築、経路富集解析が含まれます^37,38。

1. アクティブ化合物スクリーニング
   1. OB ≥ 30%およびDL ≥ 0.18を用いて、中医学システム薬理学データベース(TCMSP)データベース(2025年12月10日アクセス)から有効化合物を取得できます。
   2. PubMedおよびWeb of Science(2025年12月10日〜15日)での文献検索による補足化合物。
   3. UniProtデータベース(2025年12月15日アクセス)を使用してターゲットを標準化してください。
2. 病害標的の特定
   1. GeneCards、OMIM、TTD、DrugBankのデータベースからUC関連ターゲットを収集してください(2025年12月15日アクセス)。
3. ネットワーク構築と解析
   1. RソフトウェアのVennDiagramパッケージを使って交差するターゲットを特定します。
   2. Cytoscapeソフトウェアを使ってネットワークを構築します。
   3. NetworkAnalyzerプラグインとCytoNCAプラグインを使ってトポロジーを解析します。
4. PPIネットワークとコアターゲット同定
   1. 交差するターゲットをSTRINGデータベースにインポートします。
   2. 種は ホモ・サピエンスに限定しましょう。
   3. 孤立したノードは削除しましょう。
   4. PPIスコアの閾値を0.9>適用してください。
   5. データをエクスポートしてソフトウェアで解析します。
   6. DC、BC、EC、CC、NC、LACを計算してください。
   7. 中央値ベースのフィルタリングを行い、サブネットワークを生成しコアターゲットを特定する³⁹。
5. GOおよびKEGG濃縮分析
   1. Rおよびバイオコンダクターパッケージを用いてGOおよびKEGG濃縮を行います。
   2. orgを含むRパッケージを使ってください。Hs.eg.db、clusterProfiler、DOSE、enrichplot、stringi、ggplot2です。
   3. 有意の閾値をp = 0.05およびq = 0.05に設定します。
   4. MF、BP、CCカテゴリーのGO分析を行います。
   5. KEGG経路の濃縮および分類⁴⁰を実施します。
6. 分子ドッキング
   1. TCMSPからSDF形式の化合物構造をダウンロードしてください。
   2. AlphaFoldからPDB形式のタンパク質構造をダウンロードしてください。
   3. CB-DOCK2ウェブサーバー(四川大学CADDラボ、成都)を使ってドッキングを行います。
   4. 受容体とリガンドファイルを適切に定義してください。
   5. 最適な結合ポーズと結合エネルギーを記録してください。
      注:ドッキングは遺伝的アルゴリズム⁴¹を用いて行われました。結果は結合エネルギーでランク付けされました。

10. 統計解析

1. GraphPad Prismソフトウェアを使って統計解析を行います。
2. 定量的データを平均±標準偏差(SD)として表現します。
3. シャピロ–ウィルク検定を用いて正規性を検証します。
4. 分散の均質性をブラウン–フォーサイス検定を用いて検定します。
5. 正規分布データに対してTukeyの事後検定で一方向ANOVAを実施します。
6. ノンパラメトリックデータに対してダン検定を用いてクルスカル–ウォリス検定を行います。
7. p < 0.05を統計的に有意なものと考えてください。
   注: p値が小さいほど、グループ間の統計的差異が大きいことを示します。

結果

UCにおけるLXDHDのネットワーク薬理学解析

ネットワーク薬理学を用いて、UCにおけるLXDHDの潜在的な治療標的および分子メカニズムの予測を行いました。TCMSPデータベースから、良好な薬理動態特性を持つ化合物は合計211種をスクリーニングしました。うち、 Scutellaria baicalensisから36種、 Phellodendron chinenseから37種、 Rehmannia glutinosaから10種、 Paeonia suffruticosaから11種、 Paeonia veitchiiから29種、炭化した Sanguisorba officinalisから5種、炭化 Platycladus orientalisから22種、 Saposhnikovia divaricataから18種、 Citrus aur...

ディスカッション

この手法は、ネットワーク薬理学、非標的代謝学、 in vivo での検証を統合した可視化かつ再現可能な実験ワークフローを提供し、DSS誘導のUCマウスモデルにおけるTCM処方の抗炎症効果を調査します。従来の薬理学的研究が主に孤立したメカニズム的結論に焦点を当てるのに対し、このプロトコルは方法論的枠組み自体の堅牢性を強調しつつ、重要な生物学的洞察を明らかにします。この統合ワークフローの大きな利点は、孤立した分析手法の本質的な制約を克服できることにあります。従来のネットワーク薬理学は静的で純粋にインシリコデータベースに大きく依存しており、これらのデータベースはしばしば高い偽陽性率を生み出し、 生体内 での生体形質転換を考慮できません。計算予測と外因性メタボロミクスおよび in vivo 表現型検証を体系的に結びつけることで、このプロトコルは予測された分子標的を確定した薬物由来の循環代謝物と直接結びつけ、生物アクセス困難な化合物を除去し、多成分^{薬物評価のための}堅牢な枠組みを提...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-アミノサリチル酸(5-ASA)	シグマ・オルドリッチ	A3537	潰瘍性大腸炎に対するポジティブコントロール薬;経口ガベージで100 mg/kgで投与されました。
アセトニトリル(LC-MSグレード)	メルク	100030	メタボロミクスのサンプル調製およびLC-MS移動相に使用されます。
アルファフォールドタンパク質構造データベース	EMBL–ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所	https://alphafold.ebi.ac.uk/	ターゲットタンパク質の予測された三次元構造を取得するために使われるデータベース。
アンジェリカ・シネンシス(ダン・グイ)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:1.6 g)。
CB-Dock2	CADDラボ	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	分子ドッキングおよびリガンド&ndashの予測に用いられるウェブベースのプラットフォーム;タンパク質結合モード。
シトラス・アウランティウム(Zhi Ke)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.5 g)。
化合物発見者ソフトウェア	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	バージョン3.3	LC&ndashのデータ処理および化合物識別に使用されます。
CTAnソフトウェア	ブルーカー	バージョン1.17	マイクロCTの3D画像再構築および骨侵食解析に使用されます。
サイトスケープ	サイトスケープ・コンソーシアム	バージョン 3.8.0	ネットワーク構築や可視化に使われるソフトウェア。
デクトレン硫酸ナトリウム(DSS)	MPバイオメディカル	160110	分子量36,000–50,000 Da;マウスの潰瘍性大腸炎を誘発するために使われました。
EDTA-K2抗凝固チューブ	シノファーム化学試薬株式会社	該当なし	末梢血液採取に使用されます。
イオシン染色溶液	バイオシャープ	該当なし	H&細胞質のカウンターステインに使用E染色。
エタノール	成都ケルン化学株式会社	64-17-5	組織脱水に使われます。
蟻酸(LC-MSグレード)	メルク	5.33002	LC-MSの移動相準備に使用されます。
グリキュリザ・ウラレンシス(ガンカオ)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.5 g)。
GraphPad プリズム	GraphPadソフトウェア	バージョン9.0	統計分析およびグラフィカル表示に使用されます。
血液学分析装置	マインドレイ	BC-2600vet	血液ルーチン分析用の3部構成獣医血液分析装置。
ヘマトキシリン染色液	バイオシャープ	BL700B	H&で使用大腸組織切片のE染色。
高速遠心分離機	日立	CT15E/CT15RE	血清やサンプルの調製に使用されます。
IL-10 ELISAキット(マウス)	メイミアン	MM-0176M2	血清IL-10レベルの評価に使用されました。
IL-17 ELISAキット(マウス)	アブクローナル	RK00039	血清IL-17の測定に使用されました。
IL-1とベータ;ELISAキット(マウス)	アブクローナル	RK00006	血清IL-1およびβの検出に使用されます。レベル。
IL-6 ELISAキット(マウス)	アブクローナル	RK00008	血清IL-6レベルの定量に使用。
ImageJ(フィジー)ソフトウェア	国立衛生研究所(NIH)	バージョン 1.53c	画像処理および定量化に使用されるオープンソースソフトウェア。
ライカ アプリケーションスイートX(LAS X)	ライカ・マイクロシステムズ	バージョン3.7	組織病理学的スライドの撮影に使用される画像診断ソフトウェア。
メタノール(LC-MSグレード)	メルク	106035	メタボロミクスのサンプル調製およびLC-MS移動相に使用されます。
マウス(オス C57BL/6)	安諾康バイオテクノロジー株式会社	該当なし	実験動物(6歳およびndash;8週間、20〜ndash;25g)DSS誘発性潰瘍性結腸炎モデルに使用。
mzCloud データベース	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	https://www.mzcloud.org/	MS/MSスペクトルマッチングに使用されるデータベース。
光学顕微鏡	ライカ	DM500	組織病理学的観察に使用されます。
パエオニア・ラクティフローラ(チーシャオ)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.6 g)。
パエオニア・サフルティコサ皮質(Mu Dan Pi)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.5 g)。
パラホルムアルデヒド(4%)	シノファーム化学試薬株式会社	該当なし	結腸組織の固定に使用されます。
病理学的ミクトーム	ライカ	RM2016	パラフィン組織切片の準備に使用されます。
チネンセ(黄波)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.5 g)。
オリエンタリ(Ce Bai Ye Tan)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.7 g)。
Qアクティブ高分解能質量分析計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	Q エクスアクティブ	LC–MS分析のためのOrbitrapベースの質量分析計。
R ソフトウェア	R統計計算財団	バージョン 4.2.1(https://www.r-project.org/)	GOおよびKEGG濃縮解析に使用されるソフトウェア。
レフマニア・グルティノーサ(シェン・ディ・ホアン)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:2.1g)。
サンギソルバ・オフィシナリス(ディ・ユー・タン)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.6 g)。
サポシュニコビア・ディバリカタ(ファン・フェン)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.3g)。
スキューテラリア・バイカレンシス(黄秦)	江蘇省中医病院	バッチ:2409001	LXDHDの成分ハーブ(用量:0.5 g)。
ペントバルビタールナトリウム(1%)	シグマ・オルドリッチ	P3761	サンプル採取前の動物麻酔に使用されます。
SoftMax Proソフトウェア	分子デバイス	バージョン7.1	ELISA用のマイクロプレートリーダーと併用されたデータ取得および解析ソフトウェア。
STRINGデータベース	STRINGコンソーシアム	https://string-db.org/	タンパク質&ndash用データベース;タンパク質相互作用解析。
TCMSPデータベース	TCMSPプラットフォーム	https://tcmsp-e.com/	有効成分のスクリーニングや薬物標的の予測に使われるデータベース。
TNF-およびα;ELISAキット(マウス)	アブクローナル	RK00027	血清TNF-およびαの測定に用いられます。濃度。
アルティメット3000 RS LCシステム	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	アルティメット3000 RS	UHPLCシステムと質量分析法の組み合わせです。
超音波クリーナー	昆山超音波計測株式会社	KQ3200E	LXDHDの超音波抽出に使用されました。
UniProtデータベース	UniProtコンソーシアム	https://www.uniprot.org/	遺伝子名およびタンパク質名の標準化に使用されるデータベース。
ボルテックスミキサー	北京パワースターテクノロジー有限公司	LC-ボルテックス-P1	サンプルミキシングに使用されます。
ウェルチAQ-C18コラム(150×××2.1mm、1.8×1×1、1.8×1、1000、1000、1000、10000、1000、1000、1000、1000、1000、1000、1000、1000、1000、1000、10m)	ウェルチ・マテリアルズ	AQ-18-15021	代謝物およびハーブ成分の分離に使用されるカラム。
キシレン	成都ケルン化学株式会社	1330-20-7	組織学的処理中の組織クリアリングに使用されます。