方法論記事

分子刻印ポリマー（MIP）を用いたマイクロ・ナノポリスチレンの電気化学センシング

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DOI:

10.3791/70811

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2026年10月6日

 ,  ,  , 
1NanoBioTech Laboratory, Department of Chemistry, Florida Polytechnic University

この記事について

サマリー

この記事では、分子刻印ポリマー（MIP）ベースのセンシング手法を用いた、電解化学的なポリスチレン（マイクロおよびナノサイズ）センシングの方法について解説します。

要約

本記事では、マイクロおよび/またはナノサイズのポリスチレン（m/n-PS）の電気化学的センシングについて解説します。本記事では、サイズ 100 nm および 500 nm のナノポリスチレン（nPS）を対象とした、分子刻印ポリマー（MIP）ベースの電気化学的センシングを実演します。MIP材料としてポリ-o-フェニレンジアミン（PoPD）を採用し、o-フェニレンジアミン（oPD）をモノマーとして用いて、スクリーン印刷カーボン電極（SPCE）の表面に電気化学的に作製（すなわち電解重合）します。m/n-PSに選択的なMIPを作製するため、100 nm および 500 nm の PS をテンプレート材料として利用しました。m/n-PSを標的とした PoPD@MIP@SPCE システムの作製について、電気化学的特性および電気化学的センシングを理解するために、電気化学的手法を用いて特性評価を行いました。最終的に、このように最適化された MIPs@PoPD/SPCE センシングチップを用いて、水中の 4.2 x 10-9 から 2.1 x 10-4 g/L の範囲の濃度を持つ nPS 溶液（100 nm および 500 nm サイズの PS）の電気化学的センシングを実演しました。開発したセンシングチップで検出された最低濃度は 4.2 x 10-9 g/L と極めて低く、関連する操作時間は 11 min でした。また、これらのセンサーを用いて、フロリダポリテクニック大学の湖から採取した水試料中の nPS を検出しました。提案されたこのようなセンシング法は、環境監視アプリケーションにおいて非常に重要であるポイント-オブ-ケア（POC）センシングにおける nPS 検出に利用可能です。

概要

マイクロ・ナノプラスチック（すなわち、分解または腐食したプラスチック）の生成および人体サイクルへのさらなる取り込みは、日々増加しています。同時に、マイクロ・ナノプラスチックが環境、水、および人の健康に及ぼす影響は深刻であり、生態系に影響を与えています1。そのため、それに伴う深刻な結果を管理する必要性は、世界的に各機関から注目を集めています1。経済成長への需要（2023年の市場規模は7,000億ドル）を満たし、また、さまざまな動作条件（熱、湿度、および他の化学物質との相互作用）の下で用途を拡大させるため、プラスチック生産が増加している（2023年だけで3億9,000万メトリックトン）ため、この状況は深刻です。さらに、一貫した世界的な規制が不足しているため、使用済みプラスチックの不適切な廃棄によって状況が悪化しています。これらのあらゆる状況が、マイクロおよび／またはナノプラスチックの生産量増加の原因となっており、それらが人体サイクルに取り込まれ、健康に悪影響を及ぼしています。このような状況において、マイクロ・ナノプラスチックの捕捉、センシング、および分解のための戦略が必要とされています1,2,3。

数あるマイクロ/ナノプラスチック（サイズはµmからnmの範囲）の中で、マイクロおよび/またはナノサイズのポリスチレン（m/n-PS）は懸念される汚染物質の一つである。これは、包装、フードサービス、家電、断熱材、その他の製品開発など、さまざまな用途に使用されるポリスチレンの分解産物である。これらのm/n-PSが完全に分解されるには数千年の時間を要するが、その過程でm/n-PSは食物、水、空気と相互作用して人間のサイクルに入り込み、人体に侵入する可能性がある。近年、ppbレベルのm/n-PSが、(1) 細胞毒性1,2、(2) 甲状腺機能不全、(3) 血液脳関門（BBB）の通過2、(4) 脳細胞の機能変化2、(5) 神経毒性2、および (6) 神経変性疾患1,4に関連していることがさまざまな報告で確認されている。したがって、極めて低濃度のm/n-PSを選択的に検知するための手法を研究することが極めて重要である。m/n-PSが環境および健康要因に関連していることを考慮すると、ポイントオブケア（PoC）およびポイントオブユース（PoU）の設定で検知を実現することが推奨される3。このようなアプローチは、監視アプリケーションへの探索および採用が可能である。同時に、これらのPoCおよびPoU検知アプローチは、迅速な分析と意思決定のために人工知能（AI）アプローチと統合することができる4。これらのタスクを達成するために、m/n-PSを選択的に検知するための小型化センサーを開発することが技術的に提案されている。m/n-PSは、ペルおよびポリフルオロアルキル物質（PFAS）や天然有機廃棄物などの他の水質汚染物質と親和性を持つ可能性があるため、選択性は極めて重要なパラメータとなる4

現在、m/n-PSの検出には、フーリエ変換赤外（FTIR）分光法、走査型電子顕微鏡（SEM）、および高解像度蛍光顕微鏡法を含む多くの手法が存在します。3これらの手法は有効であるものの、費用対効果に欠け、ppbおよびpptレベルでのセンシングの実施において限界がある。熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析法（Py-GC/MS）などの他の手法も非常に効率的ではあるが、高コストであること、高度な装置を必要とすること、そして専門知識に基づいた労力のかかる操作が必要であるという限界がある。1,3PS（ポリスチレン）の検出には、標的となる粒子サイズおよび構造的特性に適した分析方法を選択する必要があります。従来のベンチトップ法は比類なき分析深度を提供しますが、電気化学的ポリスチレンセンシングは、液体マトリックス中のサブミクロンおよびナノスケールのプラスチック粒子を迅速、低コストかつフィールドポータブルにモニタリングできるという、明確なパラダイムシフトをもたらします。FTIRやラマン分光法を含む標準的なラボ手法は、正確な同定のために固有のフィンガープリント（化学的または振動的特性）に依存しており、未知の粒子の形状やサイズを、おおよそまで可視化します。 1 µmしかしながら、これらの分光学的ツールは高価であり、スキャン速度が遅く、集中的な試料乾燥を必要とします。3法規制または規制遵守の観点から、Py-GC/MSは、土壌や汚泥のような極めて複雑なマトリックス中のPSの総質量分率を算出するためのゴールドスタンダードと見なされているが、この手法は試料を破壊し、すべての形態学的データを消失させる。3対照的に、分子刻印ポリマー（MIP）やペプチド機能化グラフェンなど、特異的に修飾された電極界面を利用する電気化学的センシング手法では、PSを捕捉することが可能です。 ～経由で 物理吸着または静電的親和力により、電流または電気抵抗に瞬間的な変動が生じる1,3ポリスチレン検出に採用されている他の手法と比較した、電気化学的ポリスチレンセンシングの比較センシング性能を以下にまとめる。 表 1.

同時に、これらのセンシングアプローチは、やや高濃度（mM）におけるマイクロおよびサブマイクロサイズのPSに対してより選択性が高い。しかし、これらの手法はナノサイズのPS（100 nm以下）および低濃度のnPSには適していない。この制限は、(1) 応答信号を増幅できない選択材料の特性と性質、および (2) 低い応答信号を処理できない可能性のあるマイクロエレクトロニクスに関連している。さらに、ほとんどのPSセンシングツールは、m/n-PSのPoCおよびPoUセンシングには適していない。最近では、センシングを行うためのセンシング材料を必要とする、m/n-PSの電気化学的センシングの開発に取り組んでいる4,5,6,7,8,9。電気化学センサーは、サブナノモーラーの検出限界を迅速に（数分以内に）検出できる低コストのハンドヘルドデバイスシステムであることが知られている。これらのシステムは、従来の分析ツールや実験室のインフラが利用できない環境における、ハイスループットなポイント・オブ・ニード（PoN）環境スクリーニングのための理想的なソリューションとなり得る。したがって、適切なトランスデューサー、センシング材料、およびデータ処理・分析アプローチを選択することで、PSセンシング用のポータブル電気化学システムを開発することができる1,2,3。このような高感度に最適化されたセンサーは、電気信号を測定することでPoUおよびPoNの設定でm/n-PSを検出でき、精巧な計器や実験室の必要性を排除することができる。

このようなセンサーは数種類存在し、実証されたセンシング技術は監視アプリケーションの需要を満たしています1,4。しかし、選択的認識または親和性要素が不足しているため、センシングメカニズムや選択性の根拠については十分に議論されていません。したがって、m/n-PSを選択的に検出するための小型電気化学センサーを探索することが急務となっています。この点において、本報告ではm/n-PSを選択的に検出可能なMIPベースの電気化学センサーを提案します。MIPは、テンプレート材料として利用される標的分析物を選択的に捕捉することで知られています10,11,12,13。このテンプレートは分析物のサイズ、配向、形状によって定義され、これにより標的分析物がセンシング電極表面に選択的に結合できるキャビティが形成されます。これらの特異性により、MIPは高度な生物医学的アプリケーションに必要な人工抗体と見なされており、さまざまな種類の選択的センシングアプリケーションに採用されてきました。量産が可能であること、電気的特性を制御できること、そして表面修飾が容易であることから、MIPベースのアプローチは実用的な側面を有しています1,14。

MIPベースのセンシング能力と電気化学的センシングの特徴を統合するため、本記事ではポリ-o-フェニレンジアミン（PoPD）ベースのMIPを用いたm/n-PSセンシングの手法を提示します。センシングアプリケーションにおけるMIPとしてのPoPDの特徴については、 previous research publicationsで議論されています。PoPDのMIPは、電気化学測定に適したカスタム3電極システムであるスクリーン印刷カーボン電極（SPCE）上に電気化学的に作製されました。MIPの作製プロセスでは、テンプレート材料として100 nmおよび500 nmのm/n-PS粒子（2つの別々のチップ）の両方を使用しました。MIP@PoPD (100 nm-sized template)@SPCEおよびMIP@PoPD (500 nm-sized template)@SPCEチップは、いずれもクロノアンペロメトリー（CA）および微分パルスボルタンメトリー（DPV）を用いて、4.2 x 10-9から2.1 x 10-4 g/Lの濃度範囲でm/n-PSを検出可能です。本研究の結果は、水試料中において、500 nmのテンプレートを用いて作製されたMIP-PoPDが、100 nmのnPSと比較して、nPS (500 nm)センシングに関連するより優れた数学的モデルを示すことを示唆しています。本手法に関する詳細な記述はSanchez-Almirolaらによって発表され1、米国特許を取得しています15。

プロトコル

著者らは、本研究が規制基準および機関の監視に従って実施されたことを宣言します。本研究に伴う廃棄物は、大学の環境・健康安全（EHS）部門のガイドラインに従って保管されました。その後、廃棄物は専門家によって定期的に回収および処分されました。著者らは、大学のEHS部門が推奨するすべてのラボ安全トレーニングを完了し、提案された研究を実施する際にすべての規制を遵守しました。使用した試薬および装置は、材料表に記載されています。

1. 材料

  1. MIP作製に使用するスクリーン印刷カーボン電極（SPCE）を市販の供給元から入手します。
    注：SPCEは、作用電極（WE）、対極（CE）、参照電極（RE）の3つの電極で構成される電気化学システムです。SPCEのWE（直径3 mm）はグラファイト、CEはカーボン、REは銀で構成されています。
  2. 脱イオン（DI）水を溶媒として、PS（100 nmおよび500 nmの両方）のストックソリューションを調製します。

2. 電気化学および特性評価

  1. PS粒子（100 nmおよび500 nmサイズのnPS粒子をそれぞれ個別に）とo-フェニレンジアミンをDI waterに懸濁させた重合溶液を調製する。
  2. 電解重合後、SPCEをDI waterとメタノールの等量混合溶液に浸漬して溶出を行う。
    注：すべての電気化学実験および特性評価は、ポテンショスタットを用いて実施した。
  3. 5 mMのフェリシアン化カリウム K3[Fe(CN)6]およびフェロシアン化カリウム K4[Fe(CN)6]を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を還元電解質として用い、電気化学的検討を行う。PBS溶液は、1錠の緩衝剤タブレット（pH = 7用）を200 mLのDI waterに溶解させ、タブレットが完全に溶けるまで混ぜ合わせて調製する。サイクリックボルタメトリー（CV）の動作パラメータについては後述する。
  4. CVおよび微分パルスボルタメトリー（DPV）などの電気化学的手法を用いて、MIP@PoPDの作製、特性評価、およびセンシング特性を検討する。CVおよびDPVの動作パラメータについては後述する。
  5. 電気化学分析装置を用いて電気化学測定を行い、PSTrace 5.9ソフトウェアで装置を操作する。
    注：MIP@PoPDの作製の詳細は、関連する先行文献1,13で述べられている。

3. 電極の洗浄

  1. 重合に向けて表面を洗浄するため、SPCEを1 Mの塩酸（HCl）溶液に浸します。HClはガイドライン1に従って保存および取り扱いを行いました。
  2. 電極を洗浄するため、SPCEをポテンショスタットに接続し、電位範囲-1 Vから1 V、走査速度100 mV/sでCVを10サイクル実行します。
  3. その後、SPCE表面を超純水（DI water）で洗浄し、風乾させます。
  4. -1 Vから1 Vまで、走査速度50 mV/sでCVを3サイクル実行し、さらに-1 Vから1 Vまで、パルス電位0.01 V、パルス時間0.01 sでDPVを実行して、SPCEシステムの特性評価を行います。

4. MIP@PoPDの作製

  1. 重合溶液を作成するために、1 mM o-phenylenediamine (oPD) と、15 mLのDI waterに10 µLの標的分析物 [500 nm (2.1 × 10-4 g/L) または 100 nm (2.1 × 10-4 g/L)] サイズのnPS粒子を混合します。ここでは、2種類の異なる重合溶液について述べています。
  2. マイクロピペットを使用して、重合溶液100 µLをSPCEシステムの作用電極に添加します。
  3. PoPDベースのMIPを作製するため、SPCEをポテンショスタットに接続し、電位範囲0 Vから1 V、走査速度50 mV/sでCVを30サイクル行います。ここでは、100 nmサイズのテンプレートに特異的なMIPと、500 nmサイズのテンプレートに特異的なMIPの2種類の異なるMIPの作製を検討しています。
  4. 前述と同様に、DI waterを用いてSPCEを洗浄し、風乾させます。
  5. 前述と同様に、-1 Vから1 Vまで走査速度50 mV/sで3サイクルのCVを、および-1 Vから1 Vまでパルス電位0.01 V、パルス時間0.01 sでDPVを行うことで、SPCEシステムを特性評価します。
  6. 電極をメタノールとDI waterの50/50混合溶液に30分間浸漬させ、PoPD@SPCEシステムを溶出（25 °C）させます。
  7. 再度、溶出したSPCEをDI waterですすぎ、風乾させます。
  8. 前述と同様に、-1 Vから1 Vまで走査速度50 mV/sで3サイクルのCVを、および-1 Vから1 Vまでパルス電位0.01 V、パルス時間0.01 sでDPVを行うことで、SPCEシステムを特性評価します。

5. 電気化学的nPSセンシング

  1. マイクロピペットを用いて、目的のアナライト溶液（100 nmサイズおよび500 nmサイズのnPS）100 µLを作用電極に滴下し、アナライトがMIP層に結合するまで10分間（25 °Cで）インキュベートする。
    注：センシングに使用した溶液は、2.1 × 10-4 g/L、4.2 × 10-6 g/L、2.1 × 10-7 g/L、4.2 × 10-8 g/L、4.2 × 10-9 g/L、および0 g/Lとした。
  2. インキュベーション時間が経過した後、SPCEシステムをDI水で洗浄し、MIP層から未結合のnPSを除去する。
  3. SPCEシステムをポテンショスタットに再接続し、-1 Vから1 Vまで50 mV/sで3サイクルのCV、パルス電位0.01 Vおよびパルス時間0.01 sで-1 Vから1 Vまで3サイクルのDPVを行い、電極の特性評価を行う。さらに、10 Vで30分間のクロノアンペロメトリー（CA）を3サイクル実施する。CAの検討はさまざまな電圧で行われたが、10 Vで増幅信号が得られた。
    注：すべての電気化学的測定は3回繰り返し（n=3）行い、同等の大きさを示すグラフを分析に使用した。

6. データ解析

  1. MATLAB（バージョン R2022b）を用いて、生成されたすべてのデータを解析します。
    注：DPVでは、電極によって電気化学信号のベースラインが異なります。そのため、電気化学的挙動の解析および検量線のプロットにはプロミネンス（prominence）が選択されます。プロミネンスの算出はPSTrace 5.9ソフトウェアを用いて直接行われ、これは自動的なプロセスです。PSTrace 5.9ソフトウェアで収集したDPVデータは、さらにMATLABを用いてプロットされました。PSTrace 5.9は、CVやDPV研究を含む電気化学実験を行うために電気化学ポテンショスタットを操作するユーザーフレンドリーなソフトウェアです。CVおよびDPV研究を実施するためのパラメータは、前述の適切な箇所に記載しています。PSTrace 5.9を用いて生成されたデータは、より適切なプレゼンテーションのためにMATLABを用いてグラフ化されました。

結果

MIP@PoPD@SPCEは本論文で述べるセンシング電極システムであり、SPCE上にポリオルトフェニレンジアミン（PoPD）の2種類の分子シャペロン（MIP）を、100 nmおよび500 nmのナノポリスチレン（nPS）をテンプレート材料として作製している。本研究では、テンプレート材料として100 nmのnPSを用いて作製したMIP@PoPD@SPCEセンシングチップと、500 nmのnPSをテンプレートとして用いたMIP@PoPD@SPCEセンシングチップの2種類を開発した。これらのMIP@PoPD@SPCEシステムは、提案手法を用いて代表的な水試料中に含まれる特定サイズのnPS（例えば、それぞれ100 nmおよび500 nmのnPS）を検出するために使用された。

センシング過程において、センシング電極、電解質、およびnPSのさまざまな段階や条件下での電気化学的挙動を把握することは重要である。したがって、SPCEおよびnPSの性質を調べるために、CVおよびDPVを含む電気化学的測定が行われた。nPSが電気化学的結果に与える影響を理解するため、PBSを電解質として用いたSPCEのCVおよびDPVに加え、PBSとnPSの混合系における測定も行った。また、SPCEおよびMIP@SPCEの表面特性の理解も極めて重要であり、これはラマン分光法を用いて評価された。

清浄化および最適化されたSPCEを用いて、100 nmおよび500 nmのnPSをテンプレート材料として、MIP@PoPD@SPCE系を両方とも作製した。SPCEの表面機能特性を詳細に検討した結果、すべてのSPCEを電気化学的手法を用いてMIP@PoPDの作製に供した。すべてのMIP@PoPD/SPCEセンシングチップは、同一の重合溶液、希釈試料、洗浄溶液および電解液を用いて作製した。SPCE電極の電気化学的洗浄にはCV法を用いた。これは以下に示すとおりである。 図1A. 清浄化後、これらのSPCE電極はSPCEの作業電極（WE）上にMIPを形成するために使用された。 を介して CV法を用いたPoPDの電気的重合 図1B. CV（図1C) およびDPV（図1D) さまざまな段階（洗浄後、重合後、溶出後など）におけるSPCEの電気化学的挙動を理解するために、電気化学的技術も用いられた。

MIP@PoPD@SPCEチップは、500 nmサイズのnPSをテンプレート材料として用い、nPS（500 nmサイズのnPS）濃度（4.2 × 10-9 2.1 x 10 へ-4 g/L)。このアプローチでは、DPV（微分脈動ボルタンメトリー）を含む電気化学的技術が用いられる。図2）およびCA（図3), nPSの選択的センシングに使用された。このプロセスでは、500 nmサイズのnPSに特異的な複数のMIP@PoPD@SPCEセンシングチップが一度限りの使用に供された。すなわち、DPV法を用いてnPS（500 nmサイズ）の各濃度を測定する際には、新しいセンシング電極を使用する必要があることを意味する（図2A）。予想通り、DPVに基づく電気化学的信号は、nPS濃度の関数として増加することが示された。各濃度における電気化学的信号の大きさを用いて、nPS濃度とピーク電流応答との間の検量線をプロットした。これは、卓越性（プロミネンス）という観点から示された。図2B）。したがって、プロットされた検量線は数学的に妥当であり、感度は0.037169であった µA/log(g/L)、回帰係数（R）20.902の相関係数、検出限界4.2 × 10-9 g/L、および有意性 p-値 < 0.015

500 nmのnPSの多モード電気化学センシングを検討するために、これらのMIP@PoPD@SPCEセンシングチップを用いて、4.2 × 10から始まる500 nmのnPSの検出を行った。-9 2.1 x 10 へ-4 g/L）をCA法を用いて測定した図3), 一定の10 Vで30分間。各センサーの電流応答の大きさは、約3分後に安定した。したがって、各記録の最初の180秒をプロットし、センシングデータ解析に用いた。したがって、センシングデータ解析には最初の180秒のみをプロットし選択した（図3A). CA研究の結果は、各センシングチップを通過する電流が最初の70秒間は着実に減少し、その後電流が急激に低下してから変化が停滞することを示した。電流の変化率（図3B）はローパスフィルター処理を行った。さらに、各濃度において測定された電流変化率を平均化し、それぞれの濃度の対数に対してプロットした。これらの結果を用いて、検量線を描画した（図3C）。CAに基づく電気化学的信号の結果はnPS濃度に対して非常に有望な方法を示した。これは、R値が非常に良好に適合した較正曲線によって示されている2 0.994であり、平均電流変化率とnPS濃度との間には非常に高い相関が認められた。さらに、4.2 × 10からの広い検出範囲を有する-9 2.1 x 10 へ-4 g/L、検出された最低濃度は4.2 × 10-9 g/L、および統計的に有意な結果が得られた p < 0.001 レベルでも同様の結果が観察された。

同様のプロセスに従い、100 nmのナノプラスチック粒子（nPS）をテンプレート材料として用いて作製したMIP@PoPD@SPCEセンシング電極を用いて、ナノプラスチック粒子（サイズ100 nm）のDPVによる電気化学的検出を行った。図4）およびCA（図5）技術を用いて、4.2 × 10の濃度範囲で-9 2.1 x 10 へ-4 g/L。100 nmサイズのnPSの濃度が増加するにつれて、MIP@PoPD@SPCEチップの応答値が増大することが示された（図参照）。 図4A. この研究の結果（図4A）を用いて検量線を描いた（図4B）、特定の濃度を基準とした電気信号の大きさである。したがって、作成された検量線は線形回帰R2 0.738、感度0.0533 µA/log(g/L)、広い検出範囲（4.2 × 10-9 2.1 x 10 へ-4 g/L）、検出限界は4.2 × 10-9 g/L、および統計的有意性（p < 0.05）。また、MIP@PoPD@SPCEセンシング電極チップを用いたnPS（100 nmサイズ）のマルチモード電気化学センシングにおいて、CAに基づく電気化学的アプローチも検討された。図に示すように、 図5CA法を用いたnPS（500 nmサイズのnPS粒子）検出において適用されたのと同一のパラメーターを、本研究におけるCA実験に採用した。

図5A、B MIP@PoPD@SPCEセンシング電極を用いた直径100 nmのnPS粒子に対するCAベースのセンシングに関連する測定結果を示す。さらに、これらの実験結果は検量線の作成に用いられた。図5C) 電流の変化率とnPS（100 nm）の濃度変化との間において。このキャリブレーションプロットは、CAに基づくキャリブレーション曲線の良好な適合性（すなわち、R）を示した。2 = 0.746）および相関（pp値 < 0.05）。この検量線はまた、5.09の感度を示した。 × 10-4 dA/dt /log(g/L)、検出範囲は4.2 × 10-9 2.1 x 10 へ-4 g/L、検出限界は4.2 × 10-9 g/L。100 nmサイズのnPSの検出に関するDPVおよびCAの研究は、再現性が不良であるため、いずれも許容できない。2 ただし、100 nmのnPSをテンプレート材料として用いて作製したMIP@PoPD@SPCEチップは、水試料中の100 nmのnPSのスクリーニングに利用可能である。

感応電極の選択性を評価するため、100 nmおよび500 nmのnPS粒子を参照物質として用い、特定のMIP@PoPD@SPCEセンシングチップを用いてDPV測定を実施した。このプロセスでは、100 nmおよび500 nmのnPS粒子を鋳型材料として用いて、2種類のMIP@PoPDマトリックスを作製し、これにより特異的な空隙を形成した。これらのチップを用いて、nPS（2.1 × 10-4 g/L）の水中における100 nmおよび500 nmのPS（データは示していない）。 本交差反応性研究において、500 nm PSを用いて作製したMIP@PoPDは、100 nmおよび500 nmのnPSとインキュベートした際に、ピークの顕著さに差が見られた。500 nmのテンプレートを用いて作製したMIP@PoPD@SPCEは500 nmに応答性を示し、この場合、センシング電極と標的試料を用いたセンシング電極との間のピークの顕著さの差である信号変化が、有意に高い値を示した。同時に、PoPDの非インプリントポリマー（NIP）をセンシングチップとして選択した場合における、MIP@PoPDベースのセンシングチップの選択性についても評価した。NIP@PoPD@SPCE電極は、MIP@PoPD@SPCEセンシング電極の作製に最適化されたのと同じ実験条件で作製した。DPV法を用いたセンシング実験では、2.1 × 10-4 500 nmサイズのnPSのg/L濃度が選択され、NIP@PoPD@SPCEおよびMIP@PoPD@SPCEセンシング電極系でのインキュベートが行われた（データなし）。本研究の結果、500 nmサイズのnPS粒子の低濃度において、NIP@PoPD@SPCE系は電気化学的変化（顕著性の面で）を示さなかった。一方、MIP@PoPD@SPCEに基づくセンシング電極は、応答電流に顕著な変化を示した（顕著性の面で、4.155から）–4.492 µA）。

実際の応用に関する検討を行うため、nPSの100 nmサイズ粒子に特異的な提案されたMIP@PoPD@SPCEセンシング電極を用いて、人工的に調製した水試料中の100 nmサイズnPS粒子の検出を行った。試料の調製には、米国フロリダ州レイクランドのフロリダ理工科大学内の湖水を使用した。この試験はCVおよびDPV法を用いて実施し、2.1を含む湖水試料に対して行った × 10-4 100 nmサイズのnPSのg/Lおよび100 nmサイズのnPS粒子に特異的なセンシングチップ（データ未掲載） これらの実験は、PBS（pH = 7）中、および5 mMのフェリシアニド/フェロシアニド混合物（Fe（II）/Fe（III））を含むPBS中で行った（データは示していない）。 このような性能、 メディエーターフリーおよびメディエーターを用いた検出において、提案されたセンサーの広範な適用可能性が示された。nPSを添加した場合にのみ観察された特異的な信号の急上昇は、センシングチップの選択性を示唆している。PBSおよびFe(II)/Fe(III)溶液における電流増加の大きさはほぼ同等であり、どちらの溶液もセンシング用途に使用可能であることを示している。まとめると、提案されたMIP@PoPD@SPCEチップは、POC設定下における水試料中のnPS検出に応用可能である。

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図1MIP@PoPD@SPCEセンシング電極チップの電気化学的作製。 (A）CV法による洗浄プロセス、（B）SPCE上へのnPS存在下におけるoPDのCV法による電気重合反応によるPoPDの形成、（C）清浄化後、重合後、および溶出後のさまざまな段階におけるPoPD@SPCEのCVによる特性評価、および（D) チップのDPV法に基づく特性評価。これには、溶出後、重合、および洗浄の各段階が含まれる。すべての測定は3回繰り返し（n = 3）行った。解析には、同一の信号を示したグラフを用いた。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

この図はSanchez-Almirolaらの研究から改変したものである。1.

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図2: 500 nmサイズのテンプレートを参照したDPV法によるナノプラスチックの電気化学的検出. (APBS中5 mMの酸化還元種（すなわち、Fe(II)/Fe(III)）を含む条件下において、500 nmの濃度変化に対するDPVに基づく電気化学的検討。Bピーク応答電流（突出部）とnPS濃度の対数との間に作成された検量線。すべての測定は3回繰り返し行い（n = 3）、同一の信号を示したグラフを解析に用いた。DPVスキャンのピーク突出部を濃度の対数に対してプロットし、線形回帰フィッティング（R2 = 0.902, p-value = 0.0135、RMSE = 0.0596）。データは感度0.037169を示している µA/log(g/L)、検出範囲は4.2 × 10-9 から 2.1 × 10-4 g/L、誤差範囲5％、検出限界4.2 × 10-9 g/L。この図はSanchez-Almirolaらの研究から改変して作成した。1. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図3: CA法を用いたナノプラスチック粒子（nPS）の電気化学的検出に関する研究（粒子サイズは500 nmのnPSを参照）。 (A）PBS中で5 mMのレドックス種[Fe(II)/Fe(III)]を含有する条件下において、nPS（500 nmサイズ）の濃度と10 V、180秒の条件におけるCAパターンの関係、（B) 各濃度における電流応答の変化率、および（C）各濃度のnPS（500 nmサイズ）に対する電流変化の平均値を用いて作成したキャリブレーション曲線。すべての測定は3回繰り返し（n = 3）行った。解析には、同一の信号を示すグラフを用いた。試験した各濃度の500 nmサイズnPSに対する電流変化率の平均値と、それに対する線形回帰フィッティング（R2 = 0.994, p-value = 0.000177、RSME = 9.05 × 10-5）感度は – 5.09 × 10-4 dA/dt /log(g/L)、検出範囲は4.2から広範囲にわたります × 10-9 - 2.1 × 10-4 g/L、および検出限界は4.2 × 10-9 g/L。この図はSanchez-Almirolaらの研究から改変したものである。1. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図4: DPV法を用いたnPSの電気化学的検出（粒子サイズ100 nmのnPSを参照）. (APBS中5 mMの酸化還元種（すなわち、Fe(II)/Fe(III)）を含む条件下において、100 nmサイズのnPS濃度の関数として行った、DPVに基づく電気化学的検討。Bピーク応答電流（プロミネンス）とnPS濃度の対数との間に作成した検量線。すべての測定は3回繰り返し行い（n = 3）、同一の信号から得られたグラフを解析に用いた。検量線：DPVスキャンのプロミネンスを濃度の対数に対してプロットし、線形回帰フィッティング（R2 = 0.738, p-value = 0.0284、RMSE = 0.081）を100 nmサイズのテンプレートMIPを用いて得た。したがって、プロットされた検量線は感度0.0533を示している µA/log(g/L)、検出範囲は4.2から広範囲 × 10-9 から 2.1 × 10-4 g/L、誤差範囲5％、検出限界4.2 × 10-9 g/L。この図はSanchez-Almirolaらの研究から改変したものである。1. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図5: CA法に基づくnPS（直径100 nmのnPS粒子を参照）の電気化学的センシングに関する研究。 (A）CAパターンは、PBS中で5 mMのレドックス種[Fe(II)/Fe(III)]を含む条件下において、nPS（100 nmサイズのnPS粒子）濃度に対する関数として（10 Vで180秒間記録）示される。B) 各試験濃度に対する電流応答変化の速度、および (C）nPS（100 nm粒子）の各濃度に対する電流変化の平均値を用いて作成した検量線。すべての測定は3回繰り返し（n = 3）行い、同一の信号のグラフを解析に用いた。各濃度の100 nm試料について得られた電流の平均変化率と線形回帰フィッティング（R2 = 0.746, p-value = 0.0266、RMSE = 0.00281）であり、感度は5.09であった × 10-4 dA dt /log(g/L)、検出範囲は4.2から × 10-9 g/Lから2.1 × 10-4 g/L、誤差範囲5％、検出限界4.2 × 10-9 g/L。この図はSanchez-Almirolaらの研究から改変して作成した。1. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

メトリック電気化学センシングFTIR分光法ラマン分光法熱分解ガスクロマトグラフィー質量分析法
データ出力濃度／粒子数粒子数、サイズ & 化学物質ID粒子数、サイズ & 化学物質ID全ポリマー質量 & 添加剤
ターゲットサイズの上限サブマイクロメートルマイクロスケールマイクロスケール サイズに依存しない（質量非依存）
<100 nm>10 µm>1 µm
解析速度分（リアルタイム）時間（スキャン＋処理）時間（マッピング＋処理）時間（熱抽出）
機器費用低 高 高 極めて高い
<$1,0004万米ドル - 15万米ドル5万米ドル - 20万米ドル15万ドル - 30万ドル

表1：ポリスチレン検出に用いられる他の手法と比較した電気化学的ポリスチレンセンシングの性能比較.

ディスカッション

本研究では、水試料中のnPSを検出するためのMIPベースの電気化学センサの設計と開発について実証します。ここでは、(1) 100 nmサイズのnPSをテンプレート材料としたMIP@PoPD@SPCEと、(2) 500 nmサイズのnPSをテンプレート材料としたMIP@PoPD@SPCEという2つの個別のチップを用います。その過程において、各MIPの作製およびnPSのセンシングに関する段階的な特性評価を、CVおよびDPVに基づく電気化学的検討を用いて行いました。また、SPCE、PoPD、およびnPSの電気化学的な性質の解明に重点を置いています。CVおよびDPVの研究結果から、電解質にnPSを添加するとSPCEの信号強度が上昇することが示され、これによりnPSの電気活性な性質が確認されました。一般にマイクロプラスチック（MPs）は絶縁材料と考えられていますが、MIP@PoPD@SPCEシステムにおいては、m/n-PSの存在が逆に電気化学信号の強度を増加させることが観察されました。この挙動は、電界を印加した際のnPSの特性向上に関連していると考えられ、これは文献の詳細な検討と分析に基づいています。これらのnPS（100 nmおよび500 nmサイズのnPS）は、調整可能な表面電荷や、異なる条件下（電界など）でのラジカル化といった異なる特性を示し、電子輸送を促進します。nPS@PBS@MIP@SPCEのCVに基づく電気化学的検討では、ピーク位置のシフトと電流強度の増加が観察されました。さらに、DPVに基づく電気化学的検討において、nPS@PBS@MIP@SPCEの電気化学信号強度は、nPSを含まないPBSの約4倍に増加しました。これらの結果は、電位差および電解質溶液の存在下において、nPSが電気活性材料として機能していることを裏付けています。

oPDの電解重合により、ポリマーネットワークであるPoPDが形成されます。同様に、oPDをnPSと共に電解重合させることで、nPS（100 nmおよび500 nmの粒子）が内部に埋め込まれたポリマーシステムが生成されます。さらに、溶出プロセスを通じてPoPDとnPSのシステムからnPSを除去することにより、PoPD内部に特定の空孔が作製されます。これらの空孔は、nPS粒子のサイズ、配向、および全体的な形状に特異的です。溶出後、PoPDのMIP（100 nmおよび500 nmの両サイズのnPSという元のテンプレート分子を特異的に標的とするもの）がSPCE上に作製されます。MIP@PoPD@SPCEセンシング電極システムの作製が成功したことを確認するため、さまざまな電気化学的研究が体系的に行われました。これらの実験結果は、ベアSPCEを基準として分析されました。分析評価により、MIP@PoPD@SPCE作製の各段階において電気化学的応答の変化があることが示唆されました。主な観察結果として、電極表面にnPSが存在するため、(nPS含有) PoPD@SPCEの電気化学的応答の大きさが増加しました。さらに、ポリマー(PoPD)マトリックスから電気化学的に活性なnPSが除去されたことにより、MIP@PoPD@SPCEの電気化学的応答の大きさは、MIP@PoPD@SPCEと比較してわずかに減少しました。このような電気化学的挙動の観察により、水試料中のnPSの電気化学センシングに利用されるMIP@PoPD@SPCEチップの作製が確認されました。

PoPDおよびMIP@PoPDシステムの作製における全工程では、さまざまな表面変化および修飾が行われ、これらの変動はラマン分光法およびラマンイメージングの結果に基づいて確認されました。PoPDの場合、ラマンスペクトルの曲線はPoPDポリマーシステムの官能基に関連するすべてのピークを示し、PoPDに関する文献と一致しました（データ未掲載）。MIP@PoPDのラマンスペクトル曲線は、PoPDおよびnPSの機能性に関連するすべてのピークを示しました（データ未掲載）。これにより、PoPDマトリックスに埋め込まれたすべてのnPSが溶出工程で除去されなかったことが確認されました。nPSの性質について、光照射下での調査が行われました。このような特徴は、MIP@PoPDのラマンイメージングおよびMIP@PoPD内におけるnPSの配置においても観察され、センシングチップ上にnPSが存在することが確認されました。

本研究において、CAおよびDPVの手法を用いてMIP@PoPDプラットフォームによるPSセンシングを行ったところ、チップ表面のnPS濃度が増加するにつれて電気信号の大きさが上昇することが観察されました。このような電気化学的信号の検出は、PBS中のnPSの存在に関連しており、nPSが輸送を促進する微小環境を形成することで、SPCE信号の大きさを増大させます。同時に、それぞれのMIP@PoPD@SPCEセンシングチップを用いてnPS（粒子径100 nmおよび500 nmのnPS）の電気化学的センシングを行った際、nPSをMIP@PoPDネットワーク内でインキュベートすると、MIP@PoPS@SPCEチップの電気信号の大きさも増加することが観察されました。

このような電気化学的応答の向上の根拠となる説明を提供するため、我々は文献を注意深く検討した。電界を印加すると、nPSが電気化学的に活性化することが観察されている。MIP@PoPDと比較して電気信号の増加が見られ、これはMIPのキャビティ内におけるnPSの配向、およびnPSとPoPDが相互作用する可能性に関連している。上述のように、印加された電界はnPS上に電気化学的活性部位を生成でき、これが電気化学測定中の電子輸送を促進し得る。さらに、MIP@PoPD@SPCEチップの電気信号強度の増加に関連するnPSの役割を正当化する要因がいくつか存在する。同時に、nPSとポリマーマトリックスの相互作用も、電気化学プロセスの科学的根拠を探索する上で重要な役割を果たす。この点において、nPSとPoPDのブレンドはπ-πスタッキング相互作用を形成し、電子輸送を強化し得る。この拡張されたπ-πネットワークにより、電気化学プロセスの間に電界を印加した際、酸化が容易に進行する。加えて、印加された電界はnPSおよびnPS@MIP@PoPDにさまざまな電気化学的活性部位を生成し、全体として電子輸送をサポートし得ると考えられる。

500 nmのnPSをテンプレート物質として作製したMIP@PoPD@SPCEを用いたnPS（粒子径500 nmのnPS）の電気化学センシングでは、4.2 x 10-9から2.1 x 10-4 g/Lの濃度範囲において、（回帰係数の値において）許容可能な数学的モデルが示されました。同時に、100 nmのnPSをテンプレート物質として作製したMIP@PoPD@SPCEを用いたnPS（粒子径100 nmのnPS）の電気化学センシングでは、4.2 x 10-9から2.1 x 10-4 g/Lの濃度範囲で濃度に応じた明確な信号変化を示しました。しかし、回帰係数が低いため、得られた数学的モデルは許容できるものではありませんでした。作製した両タイプのセンシングの選択性は、以下の2つの方法で評価しました：1) DPV法を用いて、各センシングチップにおける100 nm PSおよび500 nm nPSの影響を評価しました。その結果、500 nmサイズのnPSキャビティに特異的なMIP@PoPD@SPCEセンシングチップは、500 nmサイズのnPSに対して非常に良好な応答を示し、100 nmサイズのnPSに対しても電気化学的な信号変化を示したことが確認されました。これらの観察結果は、500 nm nPSに対するMIP@PoPD@SPCEが、500 nm nPSの選択的検出および100 nmサイズのnPSのスクリーニングに適したセンシングチップであることを示唆しています。

この手法では、主にPoPD内に形成された特異的な空孔によってnPSセンシングに選択性が生まれ、nPSとPoPDの間の相互作用によるものではありません。したがって、PoPDのみをSPCE上に堆積させた非刻印ポリマー（NIP）を用いて、nPS濃度（500 nmサイズのnPS粒子、濃度 2.1 x 10-4 g/L）に対する電気化学的挙動を評価しました。DPV解析の結果（ピークの顕著性において）、MIP@PoPDはNIPよりもnPSに対して高い応答性を示すことが確認されました。これは、MIPの手法がより選択的で適応性が高く、nPSの形状、サイズ、配向に合わせて作製された特異的な空孔内にnPSが特異的に捕捉されるため、nPSの選択的なセンシングが可能になることを意味しています。

実世界への応用を想定した概念実証として、作製したセンサーを用いて、100 nmサイズのnPS粒子を2.1 × 10-4 g/L含む湖水のサンプルでテストを行いました。CVおよびDPV研究の結果、すべてのサンプルが電気化学信号に影響を与えることが確認されましたが、nPSを含むサンプルは電気化学信号に顕著な影響を及ぼし、開発したセンサーのnPSに対する選択性が確認されました。提案した手法は既報のプロトタイプ研究に基づいており、開発したセンシングシステムの検証は現在も進行中で、本プロジェクトの第2段階の研究の一部となっています。プロジェクトの第2段階の結果については、今後別途発表される予定です。

結論として、本手法はMIPベースの電気化学的センシングアプローチを用いて、100 nmおよび500 nmサイズのnPS粒子の電気化学的センシングを実証することに成功した。このセンシング法では、oPDをモノマー、nPS（100 nmおよび500 nmサイズ）をテンプレート材料として、カスタムSPCE上にPoPDのMIPを電気化学的に作製した。MIP@PoPDの作製に関連するすべての工程は体系的に実施され、CV、DPV、CA、およびラマン分光法を含む高度な分析手法を用いて特性評価を行った。これらの研究結果により、センシングチップの電気的特性、関連する表面変化、およびセンシングメカニズムが明らかにされた。両方のセンシング電極、すなわちMIP@PoPD@SPCE（100 nmおよび500 nmサイズのnPS粒子に特異的）は、数分という短い操作時間で、4.2 x 10-9 – 2.1 x 10-4 g/Lの濃度範囲における特定のnPS粒子の選択的センシングに利用される。センシング結果の分析から、500 nmサイズのnPSに特異的なMIP@PoPD@SPCEシステムの方が数学的により許容範囲内であることが示唆された。対照的に、100 nmサイズのnPS粒子に特異的なセンシングチップは、100 nm nPSのスクリーニングに採用することが可能である。

CAおよびDPVを用いて得られたセンシング結果は互いに一致しており、実際のアプリケーションにはどちらの手法も採用可能です。同時に、MIPによる電気化学的センシングは、NIPの場合に観察される信号とは明確に異なります。したがって、MIPベースのセンシングは、期待通り選択性と認められます。実世界でのアプリケーションを検討するため、概念実証として、既知のnPSを用いて調製した人工試料およびフロリダポリテクニック大学の湖水を用いて、このMIP@PoPDベースの電気化学的センシングを実施しました。観察された信号は非常に明確であり、開発したセンシング電極の選択性が示唆されました。

本研究で報告した電気化学センシングは、スマートフォンやタブレットで操作可能なポータブル電気化学ワークステーションを用いて実施できるため、提案したシステムはPoC（ポイント・オブ・ケア）およびPoU（ポイント・オブ・ユース）アプリケーションに採用可能です。今後は、超小型のMEPを用いてこのセンシング手法を確立する取り組みが行われる予定です。このようなハンドヘルドMEPはスマートフォンで操作でき、POC、PoN（ポイント・オブ・ニード）、またはPoUセンシング、必要なデータの収集、迅速な分析、および意思決定の方針策定を可能にします14,15。

開示事項

本論文の著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本論文では、Florida Polytechnic UniversityおよびFulbright Foreign Scholarship BoardのFulbright Specialist Program Awardから提供された資金（AW-2000022、GR-23SUMR-AK、GR-24SUMR-AK）への謝意を述べます。著者は、本手法が既発表の研究論文および米国特許（US 12,523,590B1）に基づいていることを明記します。また、Fulbright Specialist Awardの獲得にあたり支援をいただいたFlorida Polytechnic Universityのシニア・グローバル・アフェアーズ・オフィサーであるMustapha Achoubane氏の貢献に感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
データ解析MATLAB
脱イオン水フロリダポリテクニック大学内のMillipore
電気化学分析装置PalmSens4 ポテンショスタット (Houten, Netherlands)
エタノールSigma Aldrich459836
塩酸 (HCL)Sigma Aldrich7647-01-0
メタノールSigma Aldrich423950010
o-フェニレンジアミン (oPD)Sigma Aldrich615-28-1
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）タブレットSigma AldrichMFCD00131855
マイクロプラスチックとしてのポリスチレン（100 nm）Sigma Aldrich43302
マイクロプラスチックとしてのポリスチレン（サイズ500 nm）Sigma Aldrich59769
フェリシアン化カリウムSigma Aldrich13746-66-2
フェロシアン化カリウムSigma-Aldrich14459-95-1
ラマン分光光度計および顕微鏡LabRAM HR Evolution, Horiba Scientific
スクリーン印刷カーボン電極BASi Instrumentation PALM-IS-C U/M EA - ItalSens カーボン電極 

参考文献

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  3. Sharma B, Mangla S, Aery S, Sharma C, Kaushik A, Kumar S, Chaudhary GR. Advanced tools and methodologies for identification, characterization, and quantification of micro/nano plastics in environmental matrices. Adv Colloid Interface Sci. 2026;347:103716.
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