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方法論記事

HEK293細胞におけるスプリット発光タグを用いた生存細胞mRNA翻訳ダイナミクスの測定

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DOI:

10.3791/70840

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2026年8月14日

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本稿では、分割発光タグを用いてHEK293細胞内での生細胞mRNA翻訳ダイナミクスを測定する、柔軟でハイスループットに対応した手法を提示します。この多用途なアッセイは、構造的影響の区別を可能にし、in vitro 転写の最適化をサポートし、mRNA治療薬の開発を効率化します。

要約

COVID-19に対抗するための迅速なワクチン開発は、メッセンジャーRNA（mRNA）治療薬が創薬を変革させる可能性を示しました。成熟したmRNAと同様に、in vitro転写mRNAは、5’キャップ、非翻訳領域（UTR）、コーディング配列、およびポリ(A)テールを含む同一の要素を備えています。これらの構成要素がmRNA翻訳に及ぼす影響を研究した先行研究では、主に、効率的な翻訳とタンパク質安定性を示す高度に設計されたレポータータンパク質が利用されてきました。各mRNAの構造要素が翻訳に異なる影響を与えるため、目的の治療用タンパク質（POI）に関連する最適な設計を特定することが不可欠です。POIの翻訳特性を評価するため、スプリットルシフェラーゼ相補系が採用されました。POIのいずれの末端にも融合させることができる短鎖ペプチドタグ（HiBiT）は、細胞透過性基質が存在する状態で、その相補的なヘテロ二量体（LgBiT）と結合し、酵素活性を再構成します。これまで、スプリット発光タグ付けは主にハイスループットなタンパク質ターンオーバー研究に使用されてきました。我々は以前、相補的ヘテロ二量体を恒常的に発現させたHEK293細胞において、スプリット発光タグ付けを用いてmRNA翻訳をin celluloで経時的にハイスループット定量化できることを実証しました。本研究では、このアッセイの汎用性をさらに実証し、コスト削減のためにin vitro転写を最適化する方法を詳述します。このアッセイシステムは、非設計遺伝子を用いてコーディング配列最適化の効果を明確にする一方で、構造構成要素の変化を独自に区別することが可能です。さらに、in vitro転写における5’キャップ濃度を4分の1に減少させても、in celluloでの翻訳量は同等であることを示します。これらの知見は、スプリット発光タグ付けをmRNA治療のワークフローに容易に組み込めることを示しており、in celluloでのmRNA駆動性タンパク質発現ダイナミクスのリアルタイムモニタリングを可能にし、mRNAベースの治療薬の進展に向けた汎用性の高い手法を提供します。

概要

メッセンジャーRNA（mRNA）治療法および研究への応用は、mRNAワクチンの成功1,2と、プログラミング可能な生体分子としてのRNAの汎用性への認識の高まりにより、近年急速に拡大しています。この分野における中心的な課題は、多様なコンテキストにおいてmRNAの翻訳効率を定量的かつ動的に評価できる能力にあります。本手法では、分割発光タグシステムを活用することで、細胞内（in cellulo）での生きたmRNA翻訳を研究するための柔軟で拡張可能なプラットフォームを提供します3。本手法の全体的な目的は、配列上の特徴、化学修飾、および構造的要素が翻訳速度論およびその後のタンパク質代謝回転にどのように影響するかを研究者が測定できるようにすることであり、これにより、治療および基礎科学への応用のためのmRNA構築物を最適化する強力なツールを提供します。

In vitro転写されたmRNAは、5′キャップ、非翻訳領域（UTR）、コーディング配列、およびpoly(A)テールを備え、成熟転写物の重要な構造を模倣しており、免疫原性を低減させるために修飾ヌクレオチドが含まれることが多い4,5。広範な研究により、これらの各要素が単独で、あるいは組み合わせによって、翻訳効率とタンパク質収量に強力に影響を与えるよう設計可能であることが示されている6,7。しかし、先行研究の多くは、緑色蛍光タンパク質（GFP）7、NanoLuc8、またはSARS-CoV-2スパイクタンパク質8,9などの高度に最適化されたレポータータンパク質に依存していた。これらは高い効率で翻訳され、非常に安定したタンパク質を産生するように設計されており、そのため治療上の文脈で直面する課題を反映していない。治療用mRNAは、それぞれ独自の構造的制約や細胞型特異的な制御を受ける多様な目的タンパク質（POI）をコードするため、ある構築物で翻訳を最大化する設計原理が別の構築物に一般化できるとは限らず、これは既報の通りである3。したがって、特定の治療用POIにとって最適な構成を特定することは不可欠であり、転写物の個々の特徴がタンパク質出力にどのように寄与するかを感度高く、かつ系統的に評価できる手法が必要である。

ポリソームプロファイリングなどのリボソームに焦点を当てた手法では、密度勾配遠心法を用いて翻訳分画を区別しますが10、リボソームプロファイリング（Ribo-seq）では、リボソームの占有率、開始部位、およびポーズをヌクレオチドレベルの解像度で提供します11。Ribo-seqと同様に、架橋免疫沈降によるRNA単離の高スループットシーケンシング（HITS-CLIP）や翻訳リボソームアフィニティー精製（TRAP）などの他のシーケンシングベースのアプローチにより、RNA結合タンパク質関連またはリボソーム関連RNAの翻訳をさらに特性解析できます12。これらの手法は強力ですが、複雑な調製、専門的な装置、および計算科学的な専門知識を必要とするため、高スループットな治療用mRNAの開発には適していません。新生鎖免疫沈降法13では、リボソームから免疫沈降させたFLAGタグ付きタンパク質を用い、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）で定量することで、翻訳効率を測定します。このアッセイは治療用mRNAにも適応可能ですが、手間がかかり、時間分解能に欠け、高スループットなアプリケーションには不向きです。SunTagシステム14は、単一のmRNA分子からのタンパク質合成量と翻訳調節を生細胞で測定することを可能にし、GFPに融合させた単鎖可変断片（scFv）とペプチドエピトープのタンデムリピートとの相互作用によって機能します。このシステムにより、単一mRNAの解像度で翻訳と局在の動的な測定が可能となり、そのため数多くの新生鎖追跡システムが開発されてきました15,16。しかし、このアプローチはスループットが低く、高出力の顕微鏡を使用する必要があります。

新生タンパク質へのタグ付けは避けられませんが、生細胞内でのmRNA翻訳を報告するために、NanoLucルシフェラーゼ由来の小さなペプチドタグを利用する可能性が示されています。NanoLucルシフェラーゼは、小さな11アミノ酸のサブユニット（HiBiT）と、より大きな158アミノ酸のサブユニット（LgBiT）に分割されるよう設計されており、これらは迅速に二量体化し、基質の存在下で機能的なルシフェラーゼを再構成することができます17,18。mRNAダイナミクスの研究において、この分割発光タグシステムにはいくつかの重要な利点があります。第一に、POIに融合させる小サブユニットのサイズが最小限であるため、コードされた構築物を目的の天然タンパク質に可能な限り近づけることができます。コード配列の長さは翻訳効率に直接影響を及ぼす可能性があるため19、タグの長さを最小限に抑えることで、合成mRNAの翻訳ダイナミクスの予測精度を高めることができます。極めて重要な点として、この最小限のタグ付け戦略により、同義コード配列のバリエーションによって駆動される翻訳の差異を検出することが可能になり、タンパク質の配列や安定性とは独立して翻訳効率を調査することができます3。このため、蛍光タンパク質やフルレングスのルシフェラーゼのような大きなタグの使用は最適ではありません。第二に、ここで採用した分割発光タグシステムは、即時の信号生成を可能にします。その迅速かつ効率的なin cellulo相補反応は、高い親和性（KD = 700 pM）が報告されており、30 sという短い間隔での読み取りによるタンパク質ターンオーバーの調節測定に使用されています18。元の分割発光タグシステムは主に他の分割ルシフェラーゼシステムとの比較でベンチマークされていましたが17,18、この文脈における最大の利点は、信号生成がタンパク質の成熟によって制限されないことです。対照的に、蛍光タンパク質は発色団の成熟に数分から数時間を要するため20、時間分解能が制限されます。最後に、ここで採用した確立済みの分割発光タグシステムは、相補後に発色団の形成を通常必要とする分割蛍光タンパク質システムの制限を克服しており21、これにより追加の遅延が導入され、迅速で動的なプロセスの捕捉への適応性が制限されるという問題を解消しています。先行研究では、タンパク質ターンオーバーアッセイや分解研究における分割発光タグの有用性が実証されています22,23,24。この確立された技術を翻訳キネティクスに拡張することは、重要な手法上の進歩を意味します。例えば、リボソームプロファイリングは転写産物上のリボソーム密度を明らかにできますが、異なる条件下での翻訳開始率や伸長率の動的な変化を容易に捉えることはできません。既報の通り3、この分割発光タグシステムは、キャップ構造、5′非翻訳領域（UTR）の組成、コドン最適化、ヌクレオチド修飾、およびpoly(A)テイルの長さなどの変更による差異を検出でき、これらはすべて翻訳効率の重要な決定因子です。この適用範囲の広さにより、個々のmRNAの特徴がタンパク質の総出力にどのように寄与しているかを解明する上で、本手法は非常に強力なものとなります。なお、使用する機器によって、単一細胞およびウェル全体のデータの両方をこの技術で取得できることは注目に値します。発光ベースの画像を取得できるイメージングプラットフォームを利用すれば、この技術を用いて単一細胞の翻訳ダイナミクスを研究することが可能です。ここでは、中〜高スループットであることおよびデータ分析への要求が最小限であることから、プレートリーダーを用いたウェルベースのアプリケーションに焦点を当てます。

この手法の検討にあたり、研究者は自身の具体的な実験目的に照らして、その妥当性を評価する必要があります。本アッセイは、mRNAベースの治療薬設計パイプラインなど、合成mRNA構築物のハイスループットスクリーニングが必要な状況において特に有用です。また、非翻訳領域、コドン使用頻度、あるいはヌクレオチド修飾を含む合成mRNAの配列特性の比較分析に適しており、翻訳効率のわずかな差を検出することが可能です3。本システムは、無細胞翻訳プラットフォーム、生細胞アッセイ、および時点特異的な溶解アッセイとの互換性があるため、メカニズム研究または応用研究のいずれかに合わせて実験設計を調整したい研究者に柔軟な選択肢を提供します。同時に、本手法の限界を認識しておくことも重要です。決定的な点として、スプリットルミネッセンスタグgingアッセイでは、リボソームフットプリンティング法のみが持つ能力であるリボソーム占有率の解像度は得られません。また、RNAの安定性や分解を直接測定することはできず、これらは補完的な手法を用いて評価する必要があります。しかしながら、既存のリボソーム中心的な手法には限界があるため、翻訳ダイナミクスの代用指標として、時間分能を持つmRNA駆動のタンパク質発現を調査するには、スプリットルミネッセンスシステムのようなタグベースのアッセイに依存することになります。したがって、本システムは合成mRNA駆動のタンパク質発現をモニタリングするための強力なツールとなりますが、その適切性は、研究課題が詳細なリボソームの位置指定やRNA分解ではなく、動的なタンパク質出力に焦点を当てているかどうかに依存します。

要約すると、分割ルミネッセンスタグ標識システムは、mRNA翻訳の研究における強力かつ多用途な手法です。その全体的な目的は、構造的および配列的要素が異なる合成mRNAから生じるタンパク質出力の差異を検出可能で、柔軟かつシステム的に拡張可能なハイスループットな手段を研究者に提供することにあります3。本システムの開発根拠は、既存技術の限界を克服し、感度、スケーラビリティ、および時間分解能における利点を提供することにあります。RNA生物学および治療法の広範な文献において、本手法は実験的レパートリーへの貴重な追加となり、基礎的な知見とトランスレーショナルな進展の両方を可能にします。このアッセイの強みと限界を慎重に検討することで、研究者は自身の特定のアプリケーションへの適切性を判断でき、それによって急速に進化するRNA科学の分野においてその影響を最大化することができます。

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プロトコル

プロトコル全体の概略図を図1に示します。

1. 〜のためのテンプレート調製 in vitro 転写（IVT）

注：IVT用のDNAテンプレートを調製する際は、プラスミドDNAにRNAポリメラーゼプロモーター（一般的にT7またはSP6）、5'および3' UTR、および目的タンパク質（POI）のオープンリーディングフレームが含まれていることを確認してください（図1）。

  1. 3' UTRの後に単一の切断部位を持つ制限酵素を用いてプラスミドDNAを直線化し、製造元の指示に従って反応系を調製する。インキュベーション後、スピンカラム方式のDNA精製キットを用いて制限酵素消化反応液を精製する。分光光度計を用いてDNA量を定量する。
  2. 直線化を確認するため、0.1 µg/mLのエチジウムブロマイドDNA染色剤を含む1%アガロースTAEゲルを調製する。消化したDNA 150 ngを水およびローディングダイと混合する。アガロースゲルにサンプル、未切断プラスミド、およびDNAラダーをロードし、1×Tris-酢酸-EDTA (TAE) バッファー中で100 Vで40分間電気泳動を行う。ゲルイメージャーで可視化する。
    注意：エチジウムブロマイド溶液は強力な変異原であるため、適切な個人用保護具（PPE）を用いて慎重に取り扱う必要がある。
  3. プラスミドDNAの3' UTRの直後にポリ(A)テールがない場合は、PCRを用いて導入する。適切に設計されたプライマーとハイフィデリティポリメラーゼを用い、製造元の指示に従ってPCRを行う。アンプリコンにT7プロモーター、オープンリーディングフレーム、およびポリ(A)テールが含まれていることを確認する。
    注：キャッピング技術によってはT7プロモーターに特定の配列要件がある場合がある。そのため、適切なフォワードプライマーの設計によってこれらの要件を満たすことができる。リバースプライマーは3' UTRの末端に結合し、ポリ(A)テールを導入する（推奨される長さは少なくとも80 T）。GC含量の高いコンストラクトについては、ステップアップPCRおよび/または3% DMSOの使用を推奨する。
  4. PCRの成功を確認するため、エチジウムブロマイドを含むアガロースTAEゲルを調製する（ステップ1.2を参照）。コンストラクトの長さが≥1 kbの場合は1%ゲルを、<1 kbの場合は2%ゲルをそれぞれ調製する。PCR反応液5 µLを水およびローディングダイと混合する。アガロースゲルにサンプルとDNAラダーの両方をロードし、TAEバッファー中で100 Vで40分間電気泳動を行う。ゲルイメージャーで可視化する。
  5. PCRによるサイズ確認後、スピンカラム方式のDNA精製キットを用いてPCR反応液を精製する。IVTに使用するためのDNAテンプレートを濃縮するため、15–20 µLの溶出バッファー（通常はDNA精製キットに付属）またはヌクレアーゼフリー水で溶出する。分光光度計を用いてDNA量を定量する。

2. In vitro転写

  1. 開始前に、ベンチ、手袋、およびピペットをRNase除染液でスプレーし、拭き上げます。収量と品質を向上させるため、この手順は滅菌フード環境下で実施してください。
  2. 製造元の指示に従い、T7ベースのin vitro転写（IVT）キットの構成成分を融解し、調製します。
    注：一部の製造元では、反応の酸化を抑え効率を向上させるためにジチオスレイトール（DTT, 0.1 M）の使用を推奨しています。キットと互換性がある場合は、このステップを推奨します。修飾dNTPを使用する場合は、対応する未修飾ヌクレオチドを同量の修飾ヌクレオチドに置き換えてください。全量反応では収量に大幅な改善が見られなかったため、半分量での反応で収量を評価してください。複数のmRNAを合成する場合は、ピペッティングエラーとばらつきを減らすためにマスターミックスを作成することをお勧めします。
  3. ピペットで十分に、かつ短時間混ぜ合わせ、結露を防ぐために加熱蓋を使用して37 °Cで5時間インキュベートします。必要に応じてインキュベーションをオーバーナイトまで延長してください。これによりmRNAの収量や完全性に与える影響は最小限です。
  4. DNase Iを1 µL加え、ピペットで十分に混ぜます。37 °Cで30分間インキュベートします。
  5. in vitro転写（IVT）RNAの精製
    1. 製造元の指示に従い、カラムベースのRNAクリーンアップキットを用いてIVT反応液を精製します（キットによって回収率や結合容量が異なる場合があります）。溶出には、ヌクレアーゼフリー水を60 µL加え、室温で5分間インキュベートした後に遠心分離します。
    2. あるいは、より安価で柔軟な方法として塩化リチウム沈殿法を使用します。
      1. 反応液に等量の7.5 M塩化リチウムを加え、混ぜて-20 °Cでオーバーナイトインキュベートします。
      2. 4 °C、18,300 × gで20分間遠心分離し、RNAペレットを乱さないように注意して上清を取り除きます。
      3. 70%エタノール950 µLで洗浄し、4 °C、18,300 × gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを室温で約5分間乾燥させた後、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁します（標準は60 µLですが、濃度を高めるにはペレットの大きさに応じて液量を減らしてください）。
        注意：適切なPPE（個人用保護具）を使用しない場合、塩化リチウムは皮膚や目に刺激を与える可能性があります。取り扱う際は手袋と保護メガネを着用してください。また、エタノールは引火性の高い液体であり、目に刺激を与える可能性があります。裸火から遠ざけ、保護メガネを含む適切なPPEを着用してください。
  6. 分光光度計を用いてmRNAを定量します。mRNAのA260/A280比が約2.0であることを確認し、A260/A230比が1.8から2.2の間にあることを確認してください。
  7. IVTの成功を確認するために、エチジウムブロマイドを含む1%アガロースTAE（非変性）ゲルを調製します。500 ngのmRNAを水およびローディングダイと混ぜ、RNAラダーの調製および変性手順に関する製造元の指示に従います。アガロースゲルにアプライし、TAEバッファー中で80 Vで40分間電気泳動します。ゲルイメージャーで可視化します。
  8. mRNAの正しいサイズをさらに確認するには、サンプルをBioanalyserで解析します。
  9. 凍結融解を避けるため、実験に必要な量ずつmRNAを分注します。例えば、96ウェルプレートの1ウェルあたり1.2 pmolのmRNAを使用する場合、1.2 pmol × n回繰り返し分に相当する適切な量を分注し、-80 °Cで保存します。

3. HEK293のリバーストランスフェクション

注：時間的な測定を行うには、相補的なルシフェラーゼ断片を恒常的に発現している細胞株が必要です。これは、必要なルシフェラーゼ断片を発現するプラスミドをトランスフェクションし、その後のクローン選択を行うことで、安定細胞株を作成することで達成できます。これにより、任意の細胞背景において、時間分解能を持ったmRNA翻訳ダイナミクスの測定が可能になります。あるいは、必要なルシフェラーゼ断片を発現している細胞株を購入することも可能です。本実験では、相補的なヘテロ二量体を恒常的に発現しているHEK293細胞を用いて実施しました。

  1. 開始前に、分解を防ぐためmRNAを氷上で解凍する。
  2. トランスフェクション複合物を調製する。96ウェルプレートの場合、1ウェルあたり1.2 pmolのmRNAが必要である。デュプリケートで実施する場合、ピペッティング誤差を考慮して2.5倍量分を調製する。したがって、3 pmolのmRNAをOpti-MEM Reduced Serum Mediumに加え、最終容量を50 µL（20 µL/ウェル）にする。
  3. カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を0.5 µL（0.2 µL/ウェル）加え、ピペッティングで混ぜて室温でインキュベートする。5分間インキュベートした後、ピペッティングで混ぜ、96ウェル白色平底マイクロプレートに1ウェルあたり20 µLずつ加える。トランスフェクションを行うウェルはプレートの中央に配置し、外周のウェルは空けておくことが推奨される。
  4. HEK293細胞を調製するため、培地を除去し、Ca2+およびMg2+不含のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2 mLで洗浄する。洗浄液を除去し、Trypsin-EDTAを500 µL加え、37 °Cで3分間インキュベートする。
  5. 細胞解離の間、細胞培養中の培地の蒸発を抑えるため、96ウェルプレートの外周ウェルにPBSを満たす。すべてのウェルを使用する場合は、ウェルの間にPBSを満たすことができる。
  6. 1× L-glutamineおよび10%胎児牛血清（FBS）を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）を4.5 mL加え、細胞を回収する。ヘモサイトメーターまたは自動細胞計数器を用いて細胞数を計測する。
  7. 必要な量の細胞（1ウェルあたり1 x 105 cellsを播種するのに十分な量に、ピペッティング誤差用の3ウェル分を加えた量）を新しいチューブに移し、500 × gで2分間遠心分離する。
  8. 上清を除去し、10% FBSおよびEndurazine Live Cell Substrate（1:200）を添加したLeibovitz’s L-15 medium（フェノールフリー）の必要量で再懸濁し、最終濃度を1 × 106 cells/mLにする。Endurazineが十分に混ざるように、セロロジカルピペットで混合する。再懸濁した細胞を1ウェルあたり100 µL（1 × 105 cells）ずつ分注する。
    注：72時間のタイムコース実験を行う場合は、蒸発を防ぐために液量を200 µLに増やす。
  9. トランスフェクション直後、細胞を37 °Cに設定したプレートリーダー（ルミノメーター）に設置する。積分時間を1 sとして、一定の間隔で記録を行う。システムの相補効率が高いため、数分以内にシグナルが検出される。したがって、正確なベースライン値を測定するためには、この手順を速やかに実行する必要がある。測定間隔は実験や装置に依存するが、本実験では18時間のタイムコース実験では12分ごと、72時間の実験では48分ごとの測定が最適であった。ルミネッセンスの測定にフィルターは不要だが、530–540 nmのフィルターを使用した場合に、より良好なS/N比が観察された。
    注：Bioluminescence Resonance Energy Transfer（BRET）シグナルは、スプリットルシフェラーゼタグ付きeGFPから生成されるため、530–540 nmのフィルターではルミネッセンスシグナルと蛍光シグナルの両方が検出される。BRETの検出を避けるには、460–480 nmのフィルターを使用するか、あるいはMYL3などの非蛍光タンパク質をリファレンスとして使用する。

4. データ解析

  1. アッセイ開始時のシグナルがバックグラウンドレベルとなるため、各条件のシグナルを最初のタイムポイント（t0、テクニカルリプリケートの平均に正規化）で正規化し、相対ルミネッセンスユニット（RLU）のフォールドチェンジを算出します。
  2. コントロール条件で正規化することにより、バイオロジカルリプリケート間のばらつきを低減させます。
  3. 解析の目的に応じて、単一タイムポイントまたは曲線下面積（AUC）のいずれかの統計解析を選択します。
    1. 単一タイムポイントの場合、ピーク発現が起こるタイムポイント（POIに依存する）とエンドポイントのタイムポイントを使用します。ステップ4.1で算出した特定のタイムポイント（例：240 min）におけるRLUをプロットし、適切な統計検定を用いて解析します。
    2. 特定の時間枠（t0から240 minまで）またはアッセイ全期間（t0からエンドポイントまで）のAUCを算出することで、タンパク質の翻訳および分解のダイナミクスを測定します。各バイオロジカルリプリケートのAUC値をリファレンスmRNAの平均で正規化し、これにより得られたAUCのフォールドチェンジを適切な統計検定を用いて解析します。

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結果

本プロトコルの費用対効果を最適化する方法はいくつかあります。例えば、IVT反応をメーカー推奨量の半分の容量に小型化したところ、得られた収量はin cellulo実験に必要な量を満たすことが分かりました。配列の長さや複雑さがIVT収量に影響するため、プロトコルの最適化に成功した場合は、1回のIVT反応あたり少なくとも50 µgのmRNAが得られる必要があります。IVT反応キットと同様に、キャッピング試薬も高価であることが多いです。mRNA分子1つにつきキャップが1つだけ必要であることを考慮すると、IVT反応においては、得られるmRNA分子数に対してキャップ分子が過剰に存在しているという仮説を立てました。そこで、IVT反応に添加するキャッピング試薬の量を滴定することでプロトコルをさらに最適化できるかを検討し、その結果を図2に示しました。10 µLのIVT反応に、キャッピング試薬を100%（最終濃度10 mM cap）、50%、25%、または0%（未キャッピング）添加し、得られたeGFP mRNAを、相補的なヘテロ二量体を構成的に発現しているHEK293細胞にトラン...

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ディスカッション

mRNA治療薬の分野は近年急速に拡大しており、開発パイプラインにおける極めて重要な段階として、配列設計と最適化の重要性が強調されています。最も効果的なRNA構造と組成を予測するための計算ツールの構築に多大な努力が注がれており、特に配列の最適化が注目されています8,9。これらのツールは強力ですが、これらの設計を実験的に検証することは、依然としてパイプラインの不可欠な一部です。しかし、この検証は主に、GFP7、NanoLuc8、SARS-CoV-2スパイクタンパク質9 などの、すでに極めて安定し、翻訳効率の高いレポータータンパク質に依存してきました。この制限を克服するため、HEK293細胞におけるin vitro 転写mRNAの翻訳ダイナミクスを研究するパイプラインに分割ルシフェラーゼシステムが導入され、時間分解能が可能となり

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開示事項

著者は、申告すべき利益相反がないことを表明します。

謝辞

著者らは、HEK293 LgBiT細胞株を提供いただいたLaura Itzhaki氏に感謝いたします。本研究は、British Heart Foundationのプロジェクトグラントおよびトランスレーショナルアワード（CHWへのG114642およびG919651）、ならびにGenScript Life Science Research Grant（CAPB）の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸Sigma-AldrichA6283TAE緩衝液の成分
アガロースSigma-AldrichA9539ゲル電気泳動用
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BmRNAの品質管理に使用するバイオアナライザー
CLARIOstar Plus ルミノメーターBMG Labtech430-501S-F発光測定に使用するプレートリーダー/ルミノメーター
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113IVTに使用する5'キャップ
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific41966029HEK293-LgBiT細胞の培養に使用する培地
DNase INew England BiolabsM0303IVT反応後のDNAテンプレートを分解
ダルベッコPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Sigma-AldrichD8537細胞洗浄および蒸発防止のためのプレートへの添加用
EDTA, pH 8.0, RNase-freeThermo Fisher ScientificAM9260TAE緩衝液の成分
エチジウムブロマイドSigma-AldrichE1510ゲル電気泳動用の染色剤
胎児ウシ血清 (FBS)Sigma-AldrichF7524DMEMに添加するサプリメント
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040in vitro 転写 (IVT) キット
Leibovitz L-15 Medium, no phenol redThermo Fisher Scientific21083027発光測定中のHEK293-LgBiT培養に使用する培地
L-グルタミンThermo Fisher Scientific25030-024DMEMに添加するサプリメント
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150脂質ベースのトランスフェクション試薬
塩化リチウム沈殿溶液Thermo Fisher ScientificAM9480IVT後のmRNA精製における代替手法
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130プラスミド直鎖化後の精製キット
NanoDrop One マイクロボリューム UV-Vis 分光光度計Thermo Fisher ScientificND-ONE-WDNAおよびmRNA濃度の定量に使用する分光光度計
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570L-15培地に添加する発光に必要な基質 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612IVT反応後のmRNAを精製
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Fisher Scientific136101HEK293-LgBiTの播種およびその後の測定に使用するプレート
Opti-MEM 低血清培地Thermo Fisher Scientific31985062トランスフェクション反応に使用する培地
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553PCRキット
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993ゲル電気泳動用のRNAラダー
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020RNase除染スプレー
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066TAE緩衝液の成分
トリプシン-EDTA溶液Sigma-AldrichT4174細胞解離試薬
UltraPure DNase/RNase free 蒸留水Thermo Fisher Scientific10977035テンプレート調製およびIVTに使用

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