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方法論記事

ショウジョウバエ溶解液における細胞フリーin vitro mRNA翻訳

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DOI:

10.3791/70844

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2026年6月12日

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

この記事について

サマリー

ここでは、ショウジョウバエ胚を用いた溶解液の調製方法と体外翻訳の方法について詳しく説明します。

要約

細胞遊離mRNA のin vitro 翻訳は、真核生物における遺伝子発現中のタンパク質合成過程の理解において重要な役割を果たしてきました。体 外 翻訳のための異なるシステムからの溶解液の開発は、翻訳機構のほとんどの構成要素の役割の研究や、タンパク質合成プロセスの多くの段階の解明に重要な役割を果たしてきました。Drosophila melanogasterの解析液を用いて、翻訳および翻訳制御のさまざまな側面が研究されています。本論文は、合成mRNAテンプレートの調製、大規模な生体ハエ培養、ショウジョウバエ胚からの翻訳適性解離液の製造、細胞フリーの in vitro 翻訳反応の実施に関する詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルはショウジョウバエ属のあらゆる種、すなわちメラノガスター、ビリリス、偽スクラ、グリムシャウィ、ハイデイなどに適しています。さらに、このプロトコルを他の翻訳システムと比較して、制限点、重要なステップ、トラブルシューティングについて議論します。プロトコルの性能と再現性を評価するために代表的なアウトカムも含まれています。最後に、バイオテクノロジーや研究における潜在的な応用について議論します。

概要

100年以上にわたり、ショウジョウバエは翻訳制御や翻訳機構1、2、3、4を含む多くの生物学的現象や分子を研究する強力で遺伝的に扱いやすいモデル生物であることが証明されています。ショウジョウバエの細胞フリーin vitro翻訳は、生体内で観察された多くの事象を再現できるため、タンパク質合成を研究する強力なツールとなっています。したがって、ショウジョウバエは翻訳および翻訳制御を行う新しい機能や分子の発見に理想的なシステムです。初期の研究では、ハエ関連節足動物Artemia salina5および後のショウジョウバエ6においてin vitroで翻訳適格なシステムが確立されました。

その後、外因性mRNAに応答性のある溶解液がショウジョウバエメラノガスターで開発されました。ショウジョウバエのin vitro翻訳に関するほとんどの研究は異なる年齢の胚で行われていますが、翻訳反応バッファーの一部のバリエーションは異なる研究グループによって用いられています。比較のために、研究したさまざまな現象と平行移動反応条件は表1に示されています。胚以外にも、ショウジョウバエの卵母細胞10,22,23,24,25,26および培養シュナイダーまたはKc細胞溶解液を用いた細胞外インビトロ翻訳プロトコル(17,27,28,29,30,31,32)も開発されています。 in vitro翻訳に必要な成分の記述および異なる種の溶解液間の比較は参考文献33,34に記載されています。

mRNA翻訳の過程は真核生物間で保存されているものの、分類群間の有意な違いは主に翻訳の開始段階で見られ、そこでは様々な分子が発達過程で翻訳を抑制または促進し、分類群や種特異的な方法で行われる(35,36)。このプロトコルは、系統的に遠い多生動物の溶解物(小麦やウサギの商業溶解物を含む)を使用できない発生過程における昆虫のmRNA翻訳研究に非常に適しています。実際、このプロトコルは胚発生時に起こる翻訳イベントを再現でき、卵母細胞溶解23を用いる場合には不可能です。これまでのところ、胚、卵母細胞、培養細胞のショウジョウバエ系の比較は行われていません。in vitro合成タンパク質に翻訳後修飾を加えることは、このプロトコルの現状における制限です。さらに、この方法は細菌内で組換えタンパク質を生成する方法と比べて、前製的なタンパク質量を得られません。

ここでは、ショ ウジョウバエ の大規模なケージを日常的に培養する詳細なプロトコル、合成mRNAテンプレートの製造、胚からの翻訳適性溶解液の製造、そして細胞フリーの in vitro 翻訳アッセイの実施について説明します。 材料表 にはプロトコル全体に必要な試薬が示されています。

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プロトコル

1) in vitro 転写のためのテンプレートプラスミド構築

  1. T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼプロモーターの下流に位置する5'の未翻訳領域(UTR)、リポーターシストロン、3'のUTR、およびポリ(A)テールを含むプラスミドを選択します。転写前に、各構成要素がポリ(A)尾の直下流に一意の制限部位を含み、プラスミド線形化のために必ず確認してください(図1)。
    注意:使用される制限酵素部位は、認識部位が転写配列の外にあるか、線形化されたDNAがAで終わる位置に位置するよう慎重に選ぶべきです。さらに、制限酵素はテンプレートの3フィート端にブラントまたは5フィートのオーバーハングを残すべきです。3'のオーバーハングは異常な転写生成物を引き起こすことがあります。3フィートのオーバーハングを持つ酵素を使用する場合、使用前に断片を鈍らせるべきです。
  2. すべての構成要素をシーケンスで検証し、in vitro 転写のテンプレートとして使用してください。
    注:このワークフローには、poly(A)71 尾を持つFireflyルシフェラーゼ(FLuc)レポーター構造体が使用されています。FLuc構成要素はpLUCカセット12から派生しています。ベクターおよびキットの情報は 材料表に記載されています。

2) キャップ付きおよびポリアデニル化mRNAの in vitro 転写

  1. ポリ(A)テールの下流にある独自の制限部位(ここではKpnI)を使って各プラスミド構成体を線形化します。
  2. 線形化されたDNAを1%アガロースゲル電気泳動で100Vで1時間分離します。
  3. DNAをゲル抽出し、同一アガロースゲル電気泳動でその完全性と適切な線形化を確認します。
    注:線形化されたDNAをゲル精製する必要はありません。DNAが完全に切断されていれば、カラム精製やフェノール抽出/ETOH沈殿で十分です。
  4. 製造元の指示に従い、 in vitro 転写キットを使って精製された線形化されたDNAを転写します。転写反応に5'キャップ類似体を含み、RNAを安定化させ翻訳を刺激します。
    注:m7G(5′)ppp(5′)G RNAのような機能的キャップ類似体は、転写本の安定化と翻訳刺激をサポートします。G(5′)ppp(5′)Aのような非機能的なキャップ類似体は転写本の安定化をサポートしますが、翻訳刺激はサポートしません。この翻訳阻害因子は、ビシストロニック転写本を翻訳する際に、第2シストロン7の翻訳を駆動する内部リボソーム進入部位(IRES)の有無を調べるために使用されます。ポリ(A)尾の依存性を調べるために、転写を行う前にテンプレートプラスミド内でこれを削除することができます。
  5. すべての転写反応をRNaseフリーDNaseで処理し、製造元の指示に従って転写後にDNAテンプレートを除去します。すべての in vitro 転写キットはRNaseフリーDNaseを提供します。
  6. 製造元の指示に従い、塩化リチウム沈殿またはカラムベースのRNAクリーンアップで転写本を精製してください。
    注:すべての in vitro 転写キットには塩化リチウム試薬が含まれています。
  7. 精製された転写本を分光法で定量し、1%アガロースゲル電気泳動で100Vで1時間かけてmRNAの完全性を評価します。
  8. mRNAをアリコートし、-70°Cで保存して使用します。

3) 大規模な ショウジョウバエ 培養の定期的な維持管理

  1. 参考文献である ショウジョウバエ・メラノガスター 野生型株 Oregon-Rを使用してください。
  2. 確立された参考センターのレシピに従ってハエフードを用意しましょう。
    注:著者はブルーミントンショ ウジョウバエ ストックセンターのレシピ37 を食品の調理基準として使用しました。このレシピの詳細は 表237に記載されています。 図2 は胚採取からルシフェラーゼ活性定量までの全体のワークフローを示しています。
  3. 約1mの長さ、直径50cmの立方体または円筒形のアクリルケージを設置します。
  4. ケージの上部に直径約30cmの穴を開け、メッシュで封印します(図3)。
  5. メッシュの上に濡れた紙を敷いてハエに水を供給し、濡れた紙は毎日交換してください(図3)。
  6. ケージの前面部分は開けたまま、内側にアクセスできるように布で覆いましょう。プラスチック製フライケージの裏側にアクリルを貼り、完全に密閉してください。
  7. 胚採取前にハエの株を増幅し、ケージの中に~1,000匹の若いハエを入れます。ハエのケージは常に22〜25°Cに保ちます。
    注:同じサイズと密度の複数のフライケージを同時に維持できます。ハエは約15日間卵を産み、20日目頃に死に始めます。
  8. 毎日、アガーフルーツジュースの皿に、200μLの酢酸または酢を含む再水和ベーカーズイーストをスプーン1杯のトッピングで餌やりましょう。
  9. 次世代のハエを確立するために、0〜12時間齢の胚を複数採取します。胚を22cm×17cm×10cmのプラスチックボックスに入れ、3cmの深さでハエ餌を入れます。箱にはメッシュで塞がれた穴を設け、空気の循環を良くし、幼虫の逃げ出を防ぎましょう(図4)。餌の上に乾燥活性酵母を加え、胚を25°Cで育てます。
  10. 3日後、折りたたんだ高さ5cmの紙を箱に入れ、三齢幼虫が登って蛹になるようにします。
  11. 10日後には、孵化したばかりの成虫が入った箱をケージに入れます。ハエが箱から出て2日間ケージ内で交尾します。
  12. 特定の年齢の胚を分解液の製造のために入手するには、ケージを慎重に開け、必要な産卵期間のためにケージ内にアガージュースプレートを入れます。
  13. 皿を取り除き、卵をふるいの山で集めます。
    注意:0〜12歳の胚溶解液の場合は、午前8時にケージに2つの寒天液プレートを置き、午後8時に取り出して胚採取してください。
    1. 成虫のハエが孵化してから3日目から10日目の間に、溶解液準備用の胚を採取します。
    2. 並行して、2日目から4日目に胚を採取し、上記のように餌箱に新世代のハエを形成します。

4) 0〜12歳の ショウジョウバエ 胚からの翻訳溶解液の準備

注:このプロトコルには微小球核酸塩クレアーゼ治療は含まれていません。この工程は、ヌクレアーゼ不活化が不完全の場合に外因性レポーターmRNAの分解を防ぐために省略されました。各実験では、ノーmRNA対照群を用いて背景翻訳を監視する必要があります。
注:この方法は、以前に記載されたプロトコル7、12、14、15、16、17、22から派生しています。

  1. 表2に記載された胚溶解バッファーを準備し、-20°Cで1mLのアリコートで保存します。
    注意:各アリクォートはすぐに使うために最大2倍解凍してください。
  2. ふるいを使って胚を採取する。
    注:標準プロトコルでは0〜12時間齢の胚を使用しますが、他の胚年齢でも溶解液の調製に適した場合があります。
  3. 胚は水道水で広範囲に洗浄し、その後0.9%NaCl+0.03%Triton X-100を含む胚バッファーで洗浄します。
    注:胚は処理前に最大24時間、4°Cで保存可能です。
  4. 脱毛膜胚を50%胚バッファーと50%ハウスブリーチ(次亜塩素酸ナトリウム[NaOCl]4–6%および水酸化ナトリウム[NaOH]0.02–0.1%)で5分間投与します。
    注意:漂白剤を扱う際は手袋と透明なプラスチックゴーグルを使用してください。
  5. 水道水でしっかり洗いましょう。胚を紙で乾燥させて重さを測ります。
  6. 充填された胚を氷の上のガラス組織グラインダーホモジナイザーに移植します。胚1gあたり1mLの胚溶解バッファーを追加します。胚を氷の上で20回のストロークで均質化します。
  7. ホモジネートを1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。遠心分離機は15,900 × g で4°Cで20分間処理します。
  8. 間期を氷上で50μLのアリコートで回収します。アリコートを液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。
    注意:間期は上部と底部の相の間に濁った液体溶液が存在します。上部は高粘度で不透明な白色の脂質層です。下部の相は固体のペレットです。
    注意:隣接相からの間相溶液の汚染を避けてください。
    注意:液体窒素を扱う際は手袋と透明なプラスチックゴーグルを着用してください。

5) in vitro 翻訳反応

  1. 翻訳反応を96ウェルプレートまたはPCRサーモサイクルラー上の0.2 mL PCRチューブで設置します。各翻訳反応は最終体積17μLで準備し、胚溶解液5μLと 表2に記載された残りの反応成分を含みます。
    注:胚溶解液は反応全体の体積の30%を占めます。
  2. 翻訳反応に組換えタンパク質を加えた場合、タンパク質を20 mM HEPES-KOH PH 7.4に対して透析します。透析カセットの容量と分子量のカットオフは、サンプルの体積とタンパク質サイズに応じて選択します。
    注:組換えタンパク質の追加は、トランスレーショナルリプレッサーや開始因子を用いた線量依存アッセイの研究に関連しています。翻訳反応に使われる組換えタンパク質にPBSを加えるのは避けてください。タンパク質サンプルまたは翻訳反応のグリセロールは5%以下に保ちましょう。可能であれば、反応にグリセロールを加えないようにしましょう。
  3. mRNAを変性させるために、65°Cに2分間加熱し、その後2分間氷上で素早く冷却してからin vitro 翻訳反応を行います。
  4. 各mRNAを三重に翻訳します。反応の設定は次の通りです:反応カクテル2 μL + 胚溶解液5 μL + mRNA(30 ng) + H2Oから最終体積17 μL。基本マスターミックスとして、表2の反応に反応カクテルに従い、実行する反応の数に応じてスケールします。反応を25°Cで60分間培養します。
    注:ATPとGTPはここで説明する標準反応に別々に追加されるものではありません。私たちの実験では、追加のATP/GTPを補足してもFLucの出力は改善せず、試験条件下での翻訳も減少しました。したがって、この反応は 表2 に示されたエネルギー再生系で、追加のヌクレオチド補給なしで行われます。
  5. サーモサイクラーを4°Cで5分の初期ステップ、25°Cで60分、最後の4°Cで10分のステップをプログラムします。
  6. 反応を止めるために、20μLの冷たい1×受動溶解バッファーを加えます。反応を氷にさらに10分間置きます。
  7. サンプルは-20°Cで保存するか、ルシフェラーゼ定量に進みます。
    注:プロトコルはここで一時停止可能です。

6) 合成ルシフェラーゼの定量化

  1. FLuc活性を定量する前に、反応を室温に20分間移します。
  2. 各翻訳反応10 μLとルシフェラーゼ基質50 μL(使用前に少なくとも2時間)室温に移します。
  3. 翻訳反応にルシフェラーゼ基質を加えます。自動または手動のルミノメーターを使って相対光単位を記録します。ルミノメーターを1秒間隔で10回の読み取りを取るようにプログラムしてください。

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結果

0〜12時間の胚を用いて、6つの独立した溶解液製剤(すなわち生物学的繰り返し)間の効率変動を解析するために翻訳反応を実施しました。各棒は技術的な三重図を表しています(図5)。同様の平行移動効率が観察されましたが、多少のばらつきはありました。また、異なる年齢の胚間の翻訳効率も比較しました。したがって、0–2時間、0–12時間、0–18時間の胚から分解液を生物学的繰り返し、すなわち独立した溶解液を用いた検査を行いました(図6)。0〜2時間齢胚の溶解液が最もFLuc活性が低く、0〜18時間齢胚の溶解液が最も高いFLuc活性を示したことが観察されました。最後に、ショウジョウバエ0〜18時間齢の胚溶解液の翻訳効率を他の種と比較してみました。ウサギ網様血球と小麦胚物からの商業用溶解液を試験しました(図7)。ウサギ網様細胞および小麦胚芽反応は70%(容量/容量)の溶解物を含み、 ショウジョウバエには...

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ディスカッション

ショウジョウバエの細胞外離体外翻訳用溶解液は再現可能な結果をもたらすことがあります。異なる年齢やバッファー組成の変動を持つ胚は、タンパク質合成およびその仕組みにおける基本的な現象の幅広い調査に用いられてきました(表1)。ここでは、あらゆる年齢の胚が正確かつ定量的に研究を行うための標準的な方法を説明しました(表1)。このプロトコルは、特定の変異バエの特定のタンパク質や遺伝子型の機能を大規模に培養する際に研究する際に有効である可能性があります。さらに、この方法はショウジョウバエ属のあらゆる種に適用でき、他のハエ属や昆虫の属と比較・進化研究のために標準化されています。これは特に重要で、多くの昆虫のゲノムが現在入手可能になっているからです。

ここで説明する方法には、いくつかの限界があります。図6に示

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

N.B-ÁとG.H.は、メキシコ国立がん研究所(Instituto Nacional de Cancerología, INCan)の学内資金プログラムの支援を受けていました。D.E.V.は、Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación(SECIHTI)プログラム「2022年、メキシコにおけるメヒコ・フォーマシオン・イ・コンソリダシオン・ドスドクターレス・デ・ラス・イ・ロス・スティバドレス・ポルシコ」のポスドクフェローです。ファニス・ミシルリス氏とベティ・オソリオ氏(CINVESTAV、メキシコ)にフライを提供していただき感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルミニウム箔シートReynoldsN/A標準的な家庭用アルミニウム箔。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。
アミノ酸混合物PromegaL4461N/A
アップルサイダービネガーHeinzN/A市販のアップルサイダービネガー（5％酸味）。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。
リンゴまたはグレープフルーツジュースJumexN/A市販のグレープジュース。もしくは同等に商業的に利用可能なブランドでも可。
細菌学的アガー Merck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
ホウ酸 (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent、分子生物学グレード、≥99.5％、粉末。TBEバッファの調製に使用。
キャップ：アンチリバースキャップ (ARCA)：3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNAキャップ構造BioLabsS1411SN/A
キャップ：m7G(5')ppp(5')G RNAキャップ構造類似体New England BiolabsS1404SN/A
キャップ：機能しないキャップ類似体 G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
遠心分離管 (15 mL)Corning 430053N/A
完全、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテルRoche11836170001N/A
ウサギの筋肉からのクレアチンホスホキナーゼMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
クレアチンリン酸、二ナトリウム塩Merck1120A47950N/A
脱水ベーカーズイーストFleischmann'sN/A市販の活性乾燥酵母。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。
ジエチルピロカーボネート Merck/Sigma-AldrichD575897％(NNR)
DNAクリーン＆amp;コンセントレーター-5Zymo ResearchD4004N/A
ショウジョウバエ野生型株オレゴンRBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; Drosophila melanogasterの変異株、そしてvirilis、pseudoscura、grinshawi、hydeiなどの他のDrosophila種の野生型基準株もこのストックセンターで提供されている。
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS試薬、99.4-100.6％、粉末。TBEバッファの調製に使用。
HEPESSigmaSLBH4583V99.5％(滴定)
過酸化水素 (H2O2)EquateN/A市販の（約2.5-3.5％過酸化水素溶液）。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。
in vitro転写mMessage mMachine T7、T3、またはSP6キットThermo Fisher ScientificAM1344とAM1348N/A
KOAc、KCH3COOとも呼ばれるMerck/Sigma-AldrichSeveralN/A
Lbブロス（レンナックス）Merck/Sigma-AldrichL30221kg 
ルシフェラーゼアッセイシステムPromega E1501N/A
MAXIscript T7、T3、またはSP6 in vitro転写キットInvitrogenAM1316とAM1312N/A
Mg(OAc)2、Mg(CH3COO)2とも呼ばれるMerck/Sigma-AldrichSeveralN/A
NaCl（塩化ナトリウム）J.T Baker B17W53ACS試薬
オリゴヌクレオチド任意の会社N/A配列に依存する。
Pasive lysis 5XバッファPromegaE1941N/A
ピペットチップAxygenT-200-Y200マイクロリットルの黄色いチップ。
ピペットチップAxygenT-1000-B1mlの青いチップ。
ピペットチップ AxygenT-3000.5-10マイクロリットルの透明チップ。
プロピオン酸Merck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS試薬グレード、≥99.5％、液体。
PYREX® 5 mLガラスペステル組織グラインダー  PYREX®  7724-5N/A
QIAprepスピンプラスミドミニプレップキットQiagen27106N/A
QIAquickゲル抽出キットQiagen28704N/A
ウサギの網状小胞体溶解物（RRL）Promega L4960N/A
レンリラルキフェラーゼ（RLuc）アッセイシステムPromega E2820N/A
RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤PromegaN2111AN/A
RNeasy minielute RNAクリーンアップキットQiagen74204N/A
Slide-A-Lyzer透析カセットThermo Scientific87735 (ただし、分子サイズカットオフによって異なります)。N/A
次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）CloroxN/A市販の漂白剤（約5-6％NaOCl）。同等に商業的に利用可能なブランドでも可。
スペルミジンMerck85558N/A
ステンレス製ふるいN/AN/A任意の商業サプライヤー。
Taq plus精密DNAポリメラーゼStratagene600211-51N/A
牛の肝臓型XIからの転移リボ核酸（tRNA）

参考文献

  1. Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.
  2. Hernández G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.
  3. Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.
  4. Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.
  5. Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5′-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.
  6. Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.
  7. Hernández G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.
  8. Zapata JM, Martínez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.
  9. Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.
  10. Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.
  11. Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.
  12. Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5′ and 3′ UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.
  13. Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.
  14. Vázquez-Pianzola P, Hernández G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.
  15. Hernández G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.
  16. Hernández G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.
  17. Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.
  18. Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.
  19. Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.
  20. Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.
  21. Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.
  22. Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.
  23. Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.
  24. Hernández G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.
  25. Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.
  26. Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.
  27. Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.
  28. Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.
  29. Krüger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.
  30. Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.
  31. Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.
  32. Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.
  33. Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.
  34. Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.
  35. Hernández G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.
  36. Hernández G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.
  37. Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.

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