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方法論記事

自由に動くマウスの自発的な歩行および移動解析のための低コストマーカーレスDeepLabCutベースのワークフロー

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DOI:

10.3791/70845

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2026年6月12日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Investigación en Neurociencias y Enfermedades Neurodegenerativas (LINEN), Carrera de Médico Cirujano, Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Neurobiología del Desarrollo y Neurofisiología, Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Laboratorio de Fisiologia de interacciones Neurona-Astrocito (FINA), Escuela Nacional de Estudios Superiores Juriquilla, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

DeepLabCutを用いて、自由に動くマウスの自発的な歩行と移動を定量化する低コストでマーカーレスのワークフローを提案します。このプロトコルは、単一カメラのビデオ取得、マーカーレスの解剖学的ランドマーク追跡、時空間的運動パラメータの抽出を統合し、専門機器を使わずに非侵襲的かつアクセス可能な運動行動分析の枠組みを提供します。

要約

歩行は、協調運動、筋力、バランス、感覚運動統合の変化を反映するため、さまざまな疾患や状態における運動変化を検出するための広く使われる機能的バイオマーカーです。しかし、動物モデルの歩行を解析する従来の方法は、高価な機器や複雑なセットアップ、または自然な行動を変化させる侵襲的な手法を必要とすることが多いです。ここでは、オープンソースのポーズ推定ソフトウェアDeepLabCutをベースにした低コストでマーカーレスのワークフローを紹介し、自由に動くマウスの歩行と自発的な移動を定量的に解析します。この方法は、物理的なマーカーや専用ハードウェアを必要とせず、単一カメラでのビデオ取得、マーカーレスの解剖学的ランドマークの追跡、時空間の運動パラメータの抽出に依存しています。プロトコルの適用可能性を示すために、アルツハイマー病のトリプルトランスジェニックマウスモデル(3xTg-AD)に実装され、その代表的な応用例となりました。このアプローチは自由な動きを維持し、取り扱いに伴うストレスを最小限に抑え、非侵襲的な運動行動の評価を可能にします。このプロトコルは標準的な動作テスト環境と互換性があります。全体として、この方法は前臨床研究における歩行と移動の定量的解析にアクセスしやすく非侵襲的な枠組みを提供します。

概要

歩行は、運動、感覚、認知システムのリアルタイムな相互作用から生じる複雑な運動過程であり、安定した適応的な動きを生み出すためには、感覚フィードバック、姿勢制御、運動計画、筋肉の活性化の協調処理が必要です。この統合的な性質から、歩行の変化は臨床実践や実験研究において神経機能障害の機能的指標としてますます認識されています。人間および動物モデルにおいて、歩行分析は可動性、転倒リスク、虚弱、機能的能力の変化を検出可能にし、複数の疾患における疾患進行や介入効果のバイオマーカーとして提案されています。

基礎研究、特にマウスモデルにおいて、自発歩行や運動活動の評価は、運動表現型の特徴付けや生理的撹乱や治療的介入の影響を評価するために広く用いられている戦略です。運動パラメータの客観的な定量化により、目眼だけでは確実に捉えられない微細な運動変化を検出することが可能になります。これは、早期または軽度の表現型を対象とした前臨床研究において特に重要な制限です。この文脈で、歩行分析は運動行動の変化を調査し、神経変性疾患や神経変性疾患など様々な実験的状態に関連する機能的変化を特定するための貴重なツールとして浮上しています。

マウスモデルにおける運動行動や歩行の解析は、空間的および時間的な運動変数を定量化するために設計された専門的な技術プラットフォームに依存してきました。照明付き歩道、計装プラットフォーム、商用モーショントラッキングソフトウェアなどのシステムが一般的に使用されています。しかし、高価なハードウェアや専用インフラへの依存が、多くの研究室のアクセスを大きく制限しています 7,8,9,10。経済的な考慮を超えて、これらのアプローチは追加の実験的制約をもたらします。いくつかのシステムは動物に狭い通路や明るい車線を通行させ、強制的な運動パターンを課して自発的な行動を減らしますが、他のシステムは物理的なマーカーや塗装スポット、または四肢に貼り付けられた粘着タグに依存しています。このような介入はストレスを誘発し、歩行力学を変化させ、運動結果の生理学的解釈を混乱させる可能性があります(11,12,13,14)。これらの制約は、侵襲的な手法や高価なインフラに頼らず、自然で自由に動く環境下で歩行を捉えられる方法論の必要性を強調しています。

無制限の移動時の歩様を評価することで、速度、軌道、姿勢を人工的に制限する外部の制約を回避し、より自然な運動パターンを観察することが可能になります。このアプローチにより、最小限の制約条件下での運動行動の特徴付けが容易になります。DeepLabCutは、物理的なマーカーを必要とせずに、畳み込みニューラルネットワークを用いてユーザー定義の解剖学的ランドマークを追跡する、オープンソースのディープラーニングベースのポーズ推定フレームワークです。標準的なビデオ録画から解剖学的ポイントトラッキングを可能にすることで、DeepLabCutは運動学的パラメータの抽出を可能にし、コストと実験の複雑さを大幅に削減します(15,16,17,18)。重要なのは、マーカーレストラッキングが実験的干渉を最小限に抑え、自発的行動の研究に適しています。この単一カメラマーカーなしアプローチは、自由に動く条件下で自発的な運動活動や二次元歩行関連特徴のアクセス可能で非侵襲的な定量化を必要とする研究に最適です。しかし、地面の反作用力、足底圧、関節角、または完全な三次元四肢運動学などの直接的な生体力学的変数が必要な場合には、計測付き歩行プラットフォームや三次元モーションキャプチャシステムが必要です。

本記事の目的は、DeepLabCutをベースにした低コストでマーカーレスのワークフローを提示し、自由に動くマウスの歩行と自発的な移動を非侵襲的に定量化し、シングルカメラのビデオ取得、解剖学的ランドマーク追跡、時空間的運動パラメータの抽出を、専門的なハードウェアや侵襲的な操作を必要としないアクセス可能なワークフローで統合することです。このプロトコルは、ワークフローの方法論的実装と代表的な出力に焦点を当てています。

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プロトコル

すべての動物処置はNIHの実験動物ケア・使用ガイドに従って実施され、メキシコ国立自治大学神経生物学研究所の生命倫理委員会によりプロトコル番号117のもと承認されました。

1. 文脈の研究

  1. 研究に必要な実験条件下でマウスを使用。本プロトコル記事では、アルツハイマー病のトリプルトランスジェニックマウスモデル(3xTg-AD)を用い、APPSweおよびtauP301LトランスジーンをPS1M146Vノックイン背景に搭載し、対照群として非トランスジェニックマウスを用いて、ワークフロー実装の代表例として用いています。
  2. 研究開始前にすべての動物を遺伝子型分析してください。
  3. 獣医の監督のもと、12時間12分の明暗サイクル、22°C±2°C、相対湿度60%±5%の管理された環境で、マウスを自由に餌と水で飼育してください。
  4. 60分の慣れ期の後、光フェーズ中に記録を行い、1匹につき1回の野外セッションを行い、自発的な探索行動を維持し、繰り返しのアリーナへの曝露による活動減少を避けます。
    注: 本プロトコル記事では、生物学的比較を支持するのではなく、ワークフローや方法によって生成される運動・歩行出力の種類を示すためにのみ代表的な記録を提示します。

2. 材料

  1. 自発的な移動と歩行の記録・解析のための材料および機器表に記載されている材料および機器。実験装置の全体組み立てについては図1を参照してください。

3. 自発的な移動の習慣化と記録

  1. 動物の準備と慣れ
    1. 実験の少なくとも60分前に、ネズミを飼育室から行動検査室へ慎重に移し、環境慣れを促します。
    2. 行動テストルームは、20°C〜22°Cの一定温度、標準化された照明強度(アリーナレベルで測定120〜150ルクス)、外部聴覚刺激を最小限に抑えるための連続ホワイトノイズなど、制御された環境条件下で維持すること。
    3. 慣れ期間中は、追加の刺激や刺激を与えずに動物を自宅のケージに留めてください。動物を組織的な動物福祉ガイドラインに従って取り扱い、ストレスによる行動の変動を最小限に抑えましょう。
    4. 清潔な手袋を使い、ゆっくりと意図的な動きで動物を扱いましょう。尾の付け根で優しく持ち上げ、反対の手で体を支えてから、野原のアリーナに置きます。
      注意:重要なステップ:不一な取り扱いや慣れの時間が不足すると、不安関連行動が増加し、運動パラメータに変動が生じる可能性があります。すべての動物とセッションで同一の慣れ化手順を確実にしてください。
  2. オープンフィールドアリーナとカメラの準備
    1. 各録音セッションの前に、アクリル製のオープンフィールドアリーナを70%(v/v)エタノールで徹底的に清掃し、残留臭いや以前の匂いの手がかりを取り除きます。使用前に表面を完全に乾かしてください。
    2. 換気の良い場所で70%のエタノールを扱い、熱や発火源から遠ざけ、使用前にアリーナを完全に乾燥させてください。
    3. 屋外のアリーナを木製のプラットフォームにしっかりと設置し、構造が安定し振動がないことを確認します。
    4. 透明なアクリル壁とマットな床面を点検し、ほこりや湿気、反射性の残留物が混在していないか確認してください。これらはビデオトラッキングに干渉する恐れがあります。
    5. アリーナの両側に外部の横白色光ランプを配置し、アリーナ面に対して約30〜45°の角度で配置し、録画エリア全体に均一な照明を提供し、影や反射、過度な明るさを最小限に抑えます。各セッション前にランプの配置を調整し、アリーナレベルの照明が目標範囲である120〜150ルクスの範囲内であることを確認しましょう。
    6. カメラをアリーナ下部の下方、アリーナ面から約80cmの固定距離に位置させ、録画エリアを完全に視認できるようにします。この最適な距離は、特定のカメラのレンズ絞りや視野(FOV)によって調整が必要になる場合があり、アリーナ全体をカバーするようになることに注意してください。
    7. カメラをコンピューターシステムに接続し、動物を紹介する前にビデオ取得ソフトウェアを開始します。
    8. カメラのフォーカスと視野を調整し、アリーナ全体の表面が鮮明に見えるようにしましょう。
    9. 既知の寸法を持つチェッカーボードグリッドまたはキャリブレーションパターンをアリーナ面に配置して、空間キャリブレーション用の参照画像を取得します。
      注意:重要なステップ:正確なカメラのアライメント、固定カメラ距離、そして一定の照明は、信頼できるマーカーなしポーズ推定に不可欠です。ジオメトリや照明条件のずれは追跡精度を低下させ、セッション間のデータ比較性を損なう可能性があります。
      注:外部支持構造にはステンレス鋼などの代替材料が使用されることがありますが、セットアップが安定し記録の整列が維持されている必要があります。
      注意:録音設備が安定し外部視覚干渉を最小限に抑えたい場合、外部視覚入力の追加制御が必要な場合、不透明なアリーナや代替の壁材も使用可能です。
      注:このプロトコルで使用されているアリーナの寸法は、自由に動くマウスを記録するための構成に対応しています。これらの寸法は、使用される齧歯類や採用されたオープンフィールドプロトコルに応じて調整可能ですが、完全な動物の視認性、空間的キャリブレーション、一貫した取得条件が維持されます。
  3. 自発的な運動行動の記録
    1. マウスをアリーナに入れる前に、ビデオフレーム内に動物識別子を短く表示し、録画と対応する実験セッションとの直接的な視覚的連想を確保します。
    2. マウスをオープンフィールドの中央に置く前にビデオ録画を開始し、セッション開始時の最初の探索行動を確実に記録します。
    3. ネズミを優しく野原の中央に置きます。
    4. 視覚的、聴覚的、触覚的な乱れを生み出さずに、3分間連続して自発的な移動を記録します。現在のプロトコルでは、マウス1匹あたり1回の記録セッションのみが行われていました。
    5. コンピューター画面のライブ映像を監視し、動物の動きが途切れなく録画されているか確認してください。
    6. 撮影間でカメラの位置や照明の均一性を定期的に確認し、動物間で一貫した記録条件を確保しましょう。
    7. 録画終了後は映像撮影を停止し、上記の取り扱い手順で慎重に動物をアリーナから移動させます。
    8. 動物を元のケージに戻し、その後の処置前に休ませてください。
      注意: 記録中に動物の位置を変えることは避けてください。外部の干渉により自発的な歩行パターンが変化し、下流の解析に影響が出る恐れがあります。
  4. クリーニング、データ保存、セッション完了
    1. 各セッション後は、70%(v/v)のエタノールでオープンフィールドのアリーナを再度清掃し、完全に乾かしてから次の動物を導入します。
    2. 次の動物を導入する前に、アリーナ表面に残留するエタノールや臭いが残っていないか確認してください。
    3. 各録音の直後に動物識別子、セッションの日時、実験状況、オペレーター名をすぐに記録してください。
    4. 追加の動物をテストする場合は、同じ環境条件と実験条件でステップ3.1.1から手順を繰り返します。
    5. 各ビデオファイルを標準化された命名規則(例:AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4)で専用フォルダに保存します。
    6. 実験終了後は、撮影期間中の照明設定のずれを防ぐためにカメラシステムと照明機器を停止します。
      注:本プロトコルでは70%エタノールが使用されましたが、この種の手技で一般的に使用される消毒剤であるため、アクリル互換性消毒剤も、次回の記録までにアリーナが完全に乾燥し残留臭いがなければ、表面劣化の進行を防ぐために使用されることがあります。
      注:可能であれば、複数のアリーナを用意し、セッション間の即時切り替えや動物間での実験の継続的な進行を促進する場合があります。
      実験装置の材料と組み立てについては 図1 を参照してください。木製プラットフォーム(図1A)、アクリルアリーナ(図1B)、横方向照明システム(図1C)、ボトムビューカメラの位置決め(図1D)、および完全な実験装置(図1E)が含まれます。

figure-protocol-1
図1:野外アリーナでの移動のビデオ記録のための実験装置。(A) アリーナの支持構造;(B) プラットフォーム上に設置されたアクリル製の野外アリーナ;(C) 均一な照明を確保するための横照明;(D) 下からの移動記録のためのカメラ配置;(E) 完全なセットアップ。白い矢じりは図1Cの光源の向きと図1Dのカメラの向きを示しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 映像処理と運動学的解析

  1. ビデオ準備と品質管理
    1. 生動画を入手。MOVフォーマットを行い、フレームレートと解像度パラメータを一定に保つ.avi DeepLabCutとの互換性のために変換します。
    2. B取得直後にすべての生の動画ファイルを解析コンピュータの専用フォルダに記録し、標準化された命名規則(例:AnimalID_Session_Date)を適用してください。
    3. 各動画を全編で確認し、録画が完全で中断やフレームの落下、破損がないか確認してください。取得エラーのある動画は分析から除外すべきです。
    4. 元のフォーマットがDeepLabCutに対応しない場合は、動画をMP4(H.264)または非圧縮AVI形式に変換してください。
    5. オプションとして、セッションの開始時と終了時(例:動物を実験場から取り出す際)に非実験的な間隔を除去するために、ビデオ映像の時間的トリミングを行うことも可能です。
    6. 解像度とフレームレートが録画時に使用された取得パラメータと一致し、すべてのセッションで一貫していることを確認しましょう。
    7. 映像フレーム内でアリーナ全体が見えること、そして移動中に身体の一部が継続的に遮られていないかを確認してください。
    8. すべての検証済み・処理済み動画をDeepLabCut分析用の指定プロジェクトディレクトリにまとめます。
      注意:重要なステップ:フレームレートの不安定さ、アリーナの部分的な視認性、モーションブラーはトラッキング精度を直接低下させます。品質基準を満たさない動画は、モデルトレーニングや推論に含めるべきではありません。
  2. プロジェクトの作成と構成
    1. プロジェクト用のビデオライブラリを指定し、分析用に用意した同じ動画か、ネットワークトレーニング用の代表的なサブセットを使用します。
    2. Python環境を起動し、DeepLabCutパッケージをインポートします。
    3. 次のコマンドを使って新しいDeepLabCutプロジェクトを作成します:
    4. deeplabcut.create_new_project(「プロジェクト名」「著者」「ビデオパス」)。
    5. config.yamlファイルで関心のある解剖学的ランドマーク(身体部位)を定義し、明確かつ解剖学的に一貫した定義を確保してください。
    6. 体の部位の定義は実験的な質問に最適化され、すべての動物やセッションで同一であるべきです。
  3. フレームの抽出とボディパーツのラベリング
    1. config.yamlファイル内で、動画の長さと空間レイアウトに応じてstart、stop、numframes2extract、cropping_parametersを指定します。
    2. 代表的なフレームを次のように抽出します:deeplabcut.extract_frames(config_path、『自動』、『kmeans』/『uniform』)。
    3. 抽出したフレームを確認し、記録全体で体勢、姿勢、四肢の位置、歩行位相のカバレッジに変化が含まれているか確認してください。特定の姿勢、四肢の構成、または運動相が十分に表現されていない場合は、これらの条件をよりよく表現するために追加のフレームを抽出します。
    4. 特定の歩様サイクルの段階が必要な場合は、deeplabcut.extract_frames(config_path、「手動」)を使って手動でフレームを取り出します。
    5. グラフィカルなラベル付けインターフェースは以下のdeeplabcut.label_frames(config_path)で起動します。
    6. 図2に示されたすべてのあらかじめ定義された解剖学的ランドマークにラベルを付けます。取得時の代表的なビデオフレーム(図2A)、元のフレームに重ねた自動ボディポイント検出(図2B)、および解析に用いられた定義されたボディランドマークおよびアリーナ基準点の概略図(図2C)を含みます。一貫した解剖学的基準に従うこと(例:鼻先:鼻先の前端;尾の基部:棘と尾の接合部)
    7. 4本の手足すべてに一貫してラベルを付け、各ランドマークを足底肉の接触点の中央に配置してください。
    8. ラベルを保存し、deeplabcut.check_labels(config_path)を使って確認し、必要に応じて不正確な注釈を訂正してください。
    9. 可能であれば、別の訓練を受けた評価者にフレームの一部にラベルを付けてもらい、評価者間の整合性を評価するように依頼します。
      注意:重要なステップ:不一致または解剖学的に不正確なラベル表示は、下流の追跡エラーの主な原因です。 すべてのフレームでランドマーク定義を厳格に遵守すること。
  4. ニューラルネットワークトレーニング
    1. ポーズ推定モデルを200エポックに訓練し、最終平均トレーニング誤差(RMSE)を3.27ピクセル、平均テスト誤差3.59ピクセルを得ます。これは、記述された取得条件下での安定した追跡性能に対応します。
    2. トレーニングおよび評価データセットは、deeplabcut.create_training_dataset(config_path)を用いて作成します。
    3. config.yamlのTraining Fractionパラメータを調整し、トレーニングに使用する画像の割合を定義します。
    4. GPUの可用性は、nvidia-smiを実行して確認してください。
    5. ネットワークトレーニングを開始します:deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, epochs=200)。
    6. トレーニング損失を監視し、損失値が安定し改善が見られなくなったらトレーニングを停止します。
    7. 訓練が中断された場合は、最後に保存したチェックポイントから再開します。
    8. 訓練済みモデルをdeeplabcut.evaluate_network(config_path)で評価し、平均ピクセル誤差を記録します。
    9. 誤差が実験セットアップの許容閾値を超えた場合は、追加のラベル付きフレームを追加するか、注釈を精細化して訓練を繰り返します。
      注意: 許容されるピクセル誤差の閾値はカメラの解像度やアリーナサイズによって異なりますが、実験ごとに一貫しているべきです。
  5. ビデオ解析と歩行定量化
    1. 尤度値が0.3未満の点は欠損点とみなします。
    2. 欠損点を線形補間するのは、ギャップが連続≤3フレームの場合のみです。より長いギャップは分析から除外します。
    3. 身体中心速度の閾値を10 cm/sで定義します。
    4. この閾値以下の動きや3フレーム未満の一時的な事象は除外します。
    5. 実験動画に対して次のように推論を行います:deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=True)。
    6. ラベル付き動画をdeeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path])で視覚的にトラッキング品質を確認します(図2)。
    7. config.yamlのpcutoffパラメータを0.6に設定し、トラッキングの可視化や評価時に信頼度閾値を適用します。
    8. 出力 CSVファイルを、Table of Materialsに記載された統計計算環境に、対応する解析パッケージおよび Supplementary Material 1 で提供された行動定量用のカスタムスクリプトとともにインポートします。
    9. フレームインデックスを元の動画サンプリングレートを使って時間に変換します。
    10. 既知のアリーナ寸法と追跡されたアリーナのコーナーランドマークを用いて、ピクセル座標を物理単位に変換して空間寸法をキャリブレーションします。
    11. メトリック抽出前に追跡座標の品質管理を行います。
    12. 尤度値が0.3未満の点は欠損とみなし、適切な場合は線形補間に置き換えます。
    13. 目視検査中に逸脱した軌道を特定し、必要に応じて修正または除外します。
    14. 身体の中心位置と後肢の動きに基づく同期運動学的基準を用いて歩行セグメントを定義します。
    15. 立ち上がる、回転する、グルーミングなどの非運動的な行動は除外してください。
    16. 実験条件と動物モデルに基づいて定義閾値を手動で校正・精緻化し、解析用に堅牢で連続的な運動バウトのみを保持します。
    17. フィルタリングされた連続運動セグメントを用いて、追跡されたランドマーク間の幾何学的および時間的関係から導き出された歩行指標を計算します(表1)。これには、歩幅、ケイデンス、歩幅、構え時間、スイング時間、同側振幅、四肢特有の位置変位測定が含まれます。
    18. 同じ追跡データを用いて、完全な記録からオープンフィールドの指標を抽出します(表1)。これには、総移動距離、平均速度、移動時間、移動時間の割合、ウォーキング回数と所長、中央、周辺、コーナーゾーンでの累積走行距離が含まれます。
    19. すべての出力を構造化マスターファイルにまとめて、下流の統計分析に使います。
    20. Table of Materialsに記載された計算環境および上記のプロットスクリプトを用いて、視覚的表現(例:軌道、ヒートマップ、時間ベースの変位、歩行パターン、肢間協調プロットなど)を生成します。
    21. 補 足ビデオ1 および 補足ビデオ2 では、点の信頼度、歩行バウトの検出、探索的ゾーン分類、四肢間の協調の代表的な同期可視化が提供され、解析ワークフローの解釈を容易にしています。
  6. 品質管理とデータバックアップ
    1. ラベル付きの動画のランダムな部分を視覚的に確認し、フレームやセッション間の解剖学的一貫性を確認します。
    2. 予測されたランドマーク位置と注釈付きラベルを比較し、モデルの安定性と一般化を検証します。
    3. config.yaml、元のラベル、学習済みネットワーク重み、出力ファイルを含むプロジェクトの完全なコピーを保存してください。
    4. ワークフローで使用されるソフトウェアバージョン(DeepLabCut、Python、PyTorch、CUDA、統計計算環境など)、GPU仕様書、解析日を文書化してください。
    5. evaluation-results.csvから平均エラーと処理時間の概要レポートを作成しましょう。
    6. プロジェクト全体をローカルアーカイブや機関のサーバー、または安全なクラウドストレージにバックアップしてください。
  7. 計算環境と再現性リソース
    1. オリジナルのビデオ録画を .でキャプチャMOVフォーマットは1080×1920ピクセル、約60 FPSの解像度です。
    2. 動画を.aviフォーマットにプリプロセッシングしてトランスコードしてください。
    3. この変換ステップでは、関心のある領域をトリミングし、720×720ピクセルの正方形解像度にリサイズし、フレームレートを一定の60FPSに標準化して、後の運動解析で正確な時間的定量化を確保します。
    4. DeepLabCut バージョン 3.0.0rc13 を使い、Python 3.12.12、PyTorch 2.5.1、CUDA 11.8 で構成された環境でマーカーレストラッキングワークフローを実装してください。
    5. ポーズ推定モデルを200エポックに訓練し、最終平均訓練誤差(RMSE)を3.27ピクセル、平均テスト誤差3.59ピクセルを取得します。
    6. 統計計算環境および補助 資料1 に提供されたカスタムスクリプトを用いた歩行およびオープンフィールド定量化を用いて、追跡後分析を行います。
    7. ウォーキングの動きを見分けるには、ボディセンターの速度閾値を10cm/sとしてください。運動エポック間で最大3フレームのギャップを埋め、3フレーム未満の一時的な動きを除外して連続した歩様区間を保持し、分析に用いられます。
    8. 関連するconfig.yaml設定、代表的な解析スクリプト、例動画やトラッキングファイル、モデルの重みを補 足資料1に提供してください。
    9. 該当する場合は補 足資料1で、追加の実装詳細、モデル評価指標、ハードウェア仕様、ケース固有の解析パラメータを記載してください。
      注: これらのパラメータは、各実験で使用された取得条件に応じて調整します。

figure-protocol-2
図2:ビデオ録画からのマーカーレスボディポイント追跡および歩様分析の代表的なワークフロー。(A) 捕獲中の野原アリーナ内で自由に動くマウスの代表的な映像フレーム。(B) 姿勢推定後に元のビデオフレームに自動ボディポイント検出の例を重ね、解析に用いられた解剖学的ランドマークを示す。(C) 歩行再構築、空間校正、定量的運動解析に用いられる定義された身体ランドマークおよびアリーナ基準点の回路図表現。ランドマークとアリーナの参照点:鼻先、喉、ボディセンター、ボディセンター左(BCL)、ボディセンター右(BCR)、左ヒップ(HIPL)、右ヒップ(HIPR)、尾の根元、尾の中心、尾の先端、左前足(LFP)、左後足(LHP)、右前足(RFP)、右後足(RHP)、左後足(TL)、右上右(TR)、左下(BL)、右下(BR)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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結果

追跡・解析ワークフローの適用後、自動処理により定義された身体中心のランドマークを用いて自発的な野外移動を再構築し、下流解析に適した定量的出力を生成しました。代表的な軌道プロットは、プロトコルがアリーナ全体の空間的変位、時間的占有、自由探索中の速度動態をどのように捉えているかを示しています。この節に示されたオープンフィールド変数は、全記録から計算されたものであり、代表的な記録も含めて、プロトコルによって生成される動作・歩行出力の種類やワークフローを示しています。

代表的な非Tg記録では、再構築された身体中心の軌跡がアリーナ全体で連続的にずれていることが示され(図3A)、時間密度と速度符号化された可視化により、長時間の占有や探索中の動き速度の変動領域が強調されています(図3B)。代表的な3xTg-AD録音は異なる出力パターンを示し、空間的に制限された軌道とアリーナのカバー範囲が減少し(

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ディスカッション

本研究は、標準的なビデオ取得とDeepLabCutベースの姿勢推定を用いて、アクセス可能なワークフロー内で自由に動くマウスの自発的な移動と歩行を解析するための低コストかつマーカーレスのアプローチを提示します。このワークフローにより、ビデオ記録から運動および歩行に関連する変数を抽出しつつ、自然な運動挙動を保持し、実験的干渉を低減します。この意味で、プロトコルは運動行動の前臨床研究において実用的かつアクセスしやすい代替手段を提供します。

このプロトコルは、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルで実証され、ワークフローの代表的な応用例として示されました。生成された出力は、このアプローチで得られる運動変数および歩行変数の種類を示しています 19,20,21,22。

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開示事項

著者らは、この研究は潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財務的関係が一切ない状態で行われたと述べています。

謝辞

J.J.A.-Gはメキシコ国立自治大学(UNAM)生物医学博士プログラムの博士課程学生であり、SECIHTIフェローシップ(No. 1145816)を受賞しています。さらに、著者らは技術支援をいただいたA.R.アギラル・バスケス氏、E.A.デ・ロス・リオス・アレジャーノ氏、D.ガスカ・マルティネス氏に感謝申し上げます。

資金提供:本研究はUNAM-PAPIIT(209325、IN227026)およびCiencia básica y de Fronteraの助成金番号CBF-2025-G-35によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
70% エタノール汎用N/Aセッション間のアリーナ清掃
調整可能な白色光ランプ汎用N/A一定の照度を維持する (100–150 lx)
黒いカーテン/グレア制御汎用N/A外部光/反射を減少
チェッカーボードグリッドテンプレート汎用N/A空間キャリブレーション参照画像
DeepLabCut (v3.0.0rc13)オープンソースN/Aポーズ推定ソフトウェア
デジタルビデオカメラ (HD, 16:9; ≥60 fps)汎用N/Aセッション間で固定設定
Nvidia GPUワークステーションカスタムビルドN/Aモデルトレーニング/推論用ハードウェア
ルクスメータ汎用N/Aアリーナレベルの照度を確認
PyTorchPytorch FoundationN/ADeepLabCutで必要とされるフレームワーク
透明アクリルオープンフィールドアリーナ (42 × 42 × 42 cm)カスタムメイド / 社内製N/Aオープンフィールドアリーナ
アリーナ下カメラマウント (90°ビュー)カスタムメイド / 社内製N/A下部録画用の安定マウント
CUDANvidia CorporationN/AGPU加速並列処理
Rプログラミング言語R FoundationN/Aデータ分析用プログラミング言語

参考文献

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