魚類における経口薬物投与におけるシンプルかつ正確な飼料ベースのアプローチ

サマリー

本研究は、成体ゼブラフィッシュにおける正確で非侵襲的な体質量ベースの経口薬物投与を可能にするゼラチンベースの給餌法を提示します。このプロトコルは信頼性の高い飼料受容を示し、原理実証としてMK-801の成功した配信により、期待された挙動効果が得られました。

要約

魚における薬物投与の典型的な方法(例:ビーカー投与、腹腔注射、経口ガベージ)は時間がかかり、正確さが不十分で、無駄が多いです。これらの方法は動物にとってもストレスのかかるため、繰り返しまたは長期の薬物投与や行動実験には適しておらず、取り扱いに関連する交絡に敏感なため、生物医学研究における魚モデルの有用性が制限されます。これらの障害を克服するために、ゼラチンベースの給餌法が開発され、最小限の乱れで迅速かつ正確な薬物投与が可能となりました。この方法は、ゼラチン、ブラインシュリンプエキス、スピルリナ、そして選択した薬剤から構成された個別に調整された飼料の一口を準備するものです。ゼラチンの熱可塑性により、均質な調製液を液状化し、個々の体重に応じて正確に分量し、再固化してカスタマイズされた小口にすることができます。原理実証として、NMDA受容体受容体アンタゴニストMK-801(4 mg kg⁻¹)を新しいタンク試験の前に成体のゼブラフィッシュに投与し、不安様行動の軽減と一致する行動効果をもたらしました。このアプローチは行動薬理学に非常に適しており、他の水生モデル生物にも容易に適応可能です。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、発生、生理学、行動学、薬理学の研究に広く用いられています^。1,2,3。しかし、特に成体動物における薬理学的研究におけるゼブラフィッシュの有用性は、正確かつ最小限の妨害を伴う薬物送達法の利用可能性によって制限されています^。

ゼブラフィッシュに一般的に使われる投与方法、例えばビーカー投与、腹腔内注射、経口ガベージなどは、それぞれ大きな欠点を伴います。全身浸水によるビーカー投与は薬剤の取り込み制御を限定し、大量の化合物廃棄物を生み出し、吸収率や化合物の安定性の違いによる変動^{をもたらします。}注射法や経口ガベージはより正確な投与を可能にしますが、麻酔、拘束、繰り返しの取り扱いが必要であり、これらはストレス反応を誘発するとともに、損傷や低酸素症のリスクを高め、行動的および生理学的測定を混乱させる^{可能性があります。}これらの制限は、繰り返しまたは長期の薬物投与を伴う実験において特に問題となります。

これらの課題に対処するため、ゼブラフィッシュ¹¹への迅速かつ精密かつ非侵襲的な薬物投与を可能にするゼラチンベースの給餌法が開発されました。このアプローチにより、薬理学的化合物をゼラチン、ブラインシュリンプエキス、スピルリナからなる小さく個別に調整された飼料に取り込むことができます。飼料ベースの薬物送達は、倫理的な動物研究における3R(代替、削減、精錬)の原則に沿った非侵襲的な代替手段です。過去の研究では成体ゼブラフィッシュ12,13,14における飼料ベースの薬物投与の実現可能性が示されていますが、既存のアプローチは個体体重の変動を考慮しない異質な餌マトリックスや固定された飼料量に依存しています。ここで説明する方法は、重量ベースの線量校正を可能にすることでこれらの制約を解消します。

このプロトコルは、成体のゼブラフィッシュにおけるゼラチンベースの飼料準備と投与について、詳細かつ段階的に説明しています。この方法は行動アッセイ、すなわち新しいタンクテストを用いて実証されていますが、ゼブラフィッシュ生物学の他の分野にも広く応用可能であり、他の水生モデル生物にも応用可能であると期待されています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュにおいて効率的で再現性が高く、ストレスの少ない薬物送達を目指す研究者にとって、特に精密かつ繰り返し、または長期的な薬理学的操作を必要とする研究において実用的な解決策を提供します。

プロトコル

本研究では成体の雄と雌のABおよびTLゼブラフィッシュ(4〜12か月齢)が使用されました。すべての動物はウェイン州立大学で繁殖・飼育されました。すべての手続きは、ウェイン州立大学のガイドラインに従い、施設動物ケア・使用委員会によって承認されました。魚は標準的な条件で高密度ラック(温度27.5±0.5°C、水伝導率500μS±10μS、pH7.5±0.2)で飼育され、14時間10分の明暗サイクル(08:00時に点灯)が行われました。魚は1日2回給餌され、午前中は乾餌、午後には孵化したばかりのブラインシュリンプが与えられました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 魚の計量と飼料量の計算

1. 100mLのガラスビーカーに約50mLのシステム水を入れ、デジタルスケールに置きます。天秤を脱ぎましょう。
2. 細かいメッシュの網を使って、自宅の水槽から1匹の魚を優しく網で捕まえてください。ネットを乾いたペーパータオルに軽く触れて余分な水分を取ります。
3. 魚を慎重にビーカーに入れ、水がスケールにこぼれないように注意してください。
4. 体重を記録し、この測定重量を使って、各魚の体重あたり1%の体積(V/BW)に基づいて必要な飼料量を算出します。

2. ブラインシュリンプエキスの調合

1. 塩水エビパウダーを蒸留水に懸浮させ、最終濃度250 mg/mLにします。室温で1時間かき混ぜます。懸濁液を12,50×0 g で室温で10分間遠心分離し、上清液を保持します。
2. 遠心分離をもう一度繰り返し、再び上清液を採取します。
3. 塩水エビ抽出物は−20°Cで最大6ヶ月間保存してください。

3. ゼラチン系飼料の製造

1. 調製前にブラインシュリンプ抽出物を解凍し、目標のゼラチン(12% w/v)、スピルリナ(4% w/v)、および該当する場合は希望するゼラチン飼料量に必要な薬理学的化合物の目標質量を計算します。
2. スピルリナとゼラチン粉末(豚由来;300g≈ブルーム)を別々の1.5 mLマイクロ遠心分離管に移し、各チューブ内の実際の質量を記録します。測定質量が目標質量の目標質量以上であることを確認しましょう。
3. スピルリナ入チューブに適切な量のブラインシュリンプ抽出物、薬物化合物、水を加え、最終濃度は4%のw/vスピルリナと80 mg/mLのブラインシュリンプ抽出物を達成します。
4. ボルテックスを徹底的に均質化します。前の工程で必要な混合物の体積をゼラチン入りチューブに移し、最終的なゼラチン濃度12%(w/v)を得ます。
5. チューブを事前に温めた45°Cの加熱ブロックに5分間置き、ゼラチンが完全に溶けるまで断続的に渦巻きます。溶解が不完全の場合は、均質化を助けるために無菌の木製または金属製の攪拌棒で優しくかき混ぜます。
6. 完全に均質化された混合物(1本あたり最大100μL)を標識付き1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに分割します。
7. 完全に固化し、給餌時の取り扱いを容易にするために、アリクオートは−20°Cの温度で一晩保存します。

4. 個々の飼料の形成

1. 割り当てたゼラチン混合物を45°Cまで加熱し、完全に液状化させてから給餌します。
2. 液状ゼラチン混合物を徹底的にボルテックスしてください。
3. 魚の体重の1%に相当する体積をパラフィンフィルムのシートにピペットで塗り、個々の一口を形成します(図1)。
   注意:取り扱いや保管を容易にするために、排出前にペトリ皿の中にパラフィンフィルムのシートを置いてください。これによりパラフィンは平らに保たれ、準備済みの小塊を−20°Cに移して保存しやすくなります。
4. 再固化を促すために、少なくとも−20°Cの温度で薄口を置きます。
5. 餌を与えるまで氷にかけておきます。

5. ゼラチン飼料投与

1. 魚をハウジングラックから行動室に移し、1時間慣れさせてください。
2. 給餌の2〜5分前、透明なバリアを使って一時的に水槽内の魚を隔離します。
3. 鉗子を使って、魚の体重の1%に相当する個別のゼラチン飼料を、それぞれの魚の前の水面に置きます。
4. 各魚の動作を観察し、5分以内に全ての餌を消費しているか確認してください。
5. 魚が餌を食べた後は、バリアを取り除き、魚を元の水槽に戻すか、実験的な手順を進めます。
   注:飼料の準備および目標および実際の投与量の計算を概説した実例は補 足ファイル1に掲載されており、例値も 表1に示されています。

結果

ゼラチン飼料の好みやすさ
飼料の適性を評価するために、成体のABおよびTLゼブラフィッシュに朝の餌の代わりに5日間連続でゼラチンベースの飼料を与えました(図2)。すべてのTL魚は初回曝露で5分以内に餌を摂取しましたが、AB魚は繰り返し曝露が必要で、16匹中15匹は4日連続の慣化後も一貫して餌を摂取しました(図2A)。摂食時間の三者ANOVA(性行為の株××日数)を用いて分析したところ、ストレス(F₁,₁₂₅ = 19.4、P < 0.0001)と日(F₄,₁₂₅ = 5.80、P < 0.001)に有意な主な影響が見られましたが、性行為の主な影響は見られませんでした(F₁,₁₂₅ = 0.24, P = 0.63)。株と日(F₄,₁₂₅ = 3.35, P = 0.012)および株、日、性(F₄,₁₂₅ = 2.55, P = 0.04)間で有意な相互作用が観察されました。TL魚は両性ともに最初の曝露から(4〜20秒)急速に餌を摂取しましたが、AB魚は初期摂取時間が7〜144秒に及び、日数とともに減少しました(図2B)。4日目と5日目には、1匹のABオスを除くすべての魚が10秒以内に餌を摂取しました。約95%の魚は、慣れから2〜3日経過した後、提示から30秒以内にゼラチン飼料を摂取し、以前に報告されている^15,16。

ゼラチン給餌を用いたMK-801の行動効果
ゼラチンベースの薬物送達の有効性を示すために、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)受容体MK-801をゼラチンフィードで投与しました。新型水槽の探査時の底部距離は行動指標として測定されました。MK-801は成体のゼ^{ブラフィッシュ}における移動や不安様、捕食者回避行動を変化させることが知られています。成体のABゼブラフィッシュは、薬物なしで2日間連続でゼラチンの一口を与え、確実に摂取できるようにして給餌手順に慣れさせました。3日目には、治療群に割り当てられた魚に、ゼラチン飼料に混入されたMK-801(4 mg kg⁻¹)を単回投与しました。対照魚は、同一のゼラチンを含む物質(水)のみを受け取りました。新しい水槽テストでは行動評価の30分前に給餌が行われました。

底からの距離で測定される不安様または捕食者回避行動は、2 × 2 ANOVA(性・×薬物)を用いて分析され、MK-801(図3)(F₁,₆₉ = 24.5, P < 0.001)の有意な主効果が示されました。薬物処理された魚は水槽の上部付近で過ごす時間が長くなり、これは不安様や捕食者回避行動の減少と一般的に解釈されます。性(F_1,69=2.52、P=0.12)や性相互作用による薬物(F_1,69=1.0、P=0.32)には主効果はありませんでした。FDR補正によるペアワイズt検定により、MK-801が女性(P = 0.0076)および男性(P = 0.023)の両方で底距離を増加させることが確認されました。

これらの発見を総合すると、ゼラチンベースの飼料が薬理学的化合物の効果的な経口投与を可能にし、新しいタンク試験において期待される薬物誘発性の底棲行動変化をもたらすことが示されています。

図1:ゼラチン飼料の準備。ゼラチン送料は、体重の1%に相当する個別に調整された小口にピペットでパラフィンフィルムに送られ、−20°Cで硬化させられました。 この図はOchockiら¹¹から修正されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:成体のゼブラフィッシュによるゼラチンベースの飼料摂取量。 (A) ABおよびTL魚のうち、投与後5分以内に飼料を摂取したオスメスのうちの割合。(B)ABおよびTL魚の性別別の消費量を与える時間。飼料を摂取しなかった魚は、食用時間分析から除外されました。データは平均 ± s.e.m.として示されています。 n = 系統と性別あたり8匹。この図はOchockiら¹¹から修正されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:NMDA受容体投与の行動効果。 MK-801(4 mg/kg)は、成体のABゼブラフィッシュ(両性)に対して新しい水槽試験の30分前に投与されました。水槽の底からの距離は、不安に似た行動や捕食者回避行動の指標として用いられました。データは中央値(中心線)、四分位数範囲(ボックス)、および±1.5×四分位数範囲(ウィスカー)を示すボックス・アンド・ウィスカープロットで提示されます。*P<0.05で、偽発見率補正されたペアワイズt検定に基づいています。サンプルサイズ:女性車両、n = 20;メス版MK-801、n = 19;男性車両、n = 19;オスMK-801、n = 15。ゼラチン飼料を摂取しなかったため、5頭の動物が分析から除外されました。この図はOchockiら¹¹から修正されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

構成要素	家畜の集中度	ターゲット濃度	目標質量/体積	実際の質量/体積
ゼラチン	-	12%(除注)	60mg	62mg
スピルリナ	-	4%(無投票率)	20mg	25mg
ブラインシュリンプエキス	250 mg/mL	80 mg/mL	160 μL	200 μL
薬物	10 mg/mL	0.4 mg/μL(1%体重時は4 mg/kg)	20 μL	25 μL
水	-	-	320 μL	400μL
液体供給の総体積	-	-	500 μL	625 μL
完成飼料の量	-	-	500 μL	516.7 μL

表1:ゼラチン飼料の例。 4 mg/kgの薬物投与を1%体重で投与するために用いたゼラチンベースの飼料の原料濃度、標的、および仮想の実際の質量または体積。

補足ファイル1:複数の魚のためのゼラチン系飼料の例。薬物含有飼料の配合と個々の体重に基づく個別投与量の計算を示す実例。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここで紹介するゼラチンベースの給餌法は、ゼブラフィッシュで一般的に用いられる薬物投与法の主要な制約を克服し、最小限の取り扱いで個別化された体重ベースの投与を可能にします。これにより実験の精度と再現性が向上します。ゼラチンの熱可塑性により、均質な調製物を液状化し、正確に分割し、個別の粒状に再固化させることが可能で、個体間のサイズ変動を考慮しつつ均一な薬剤分布を実現できます。さらに、ゼラチン経口投与は注射法に伴うストレスや潜在的な損傷を回避し、3Rsの枠組み4における重要な改良^{を示しています。}

このアプローチの利点は、正確な実行に依存しています。成功する実施にはいくつかの手続き上の要素が重要です。個々の体重を正確に測定することは不可欠です。なぜなら、成体のゼブラフィッシュは年齢、性別、系統の一致群内でも大きなサイズの異質さを示すことがあり、^個体間で体重がほぼ3倍に差をつけるから^です。ゼラチンマトリックス内で化合物を徹底的に均質化することも、給料部分間の一貫した投与を確保するために同様に重要です。最後に、薬物投与前にゼラチン飼料に魚を順応させることで、餌拒否が減少します。正確な投与を確保するために、飼料摂取の目視確認が推奨されます。

しかし、適切な実行があっても、飼料ベースの薬物投与にはいくつかの実用的な課題があります。一つの潜在的な問題は、飼料の小品の不適切な配置であり、水に入れた後に飼料が急速に分解してしまうことがあります。これは通常、準備中の温度管理や混合の不十分さ、長時間の加熱、または原料の繰り返しの凍結解凍サイクルが原因です。これを防ぐために、適切な加熱・混合によってゼラチンの完全な溶解を確保し、調理済みのストックは一度だけ解凍し、迅速に使用する使い捨ての部分に分割してください。敏感な調製の場合は、追加の飼料を用意し、水のビーカーに加えて適切な設定を確認してから実験を行うことが推奨されます。飼料の好みを低下させる化合物については、クラムジュース¹²˒¹³ や市販の魚誘引剤²⁰などの誘引剤を導入することで受け入れを改善できます。本研究では、ブラインシュリンプエキスを用いて味覚改善に効果が証明されました。あるいは、複数の小用量を投与することで摂取量を改善しつつ、望ましい累積曝露量を達成することも可能です。これらの実用的な考慮点に加え、飼料ベースの投与には薬理動態的な制約も存在します。すべての経口投与方法と同様に、消化管吸収は注射方式に比べて生体利用能を遅らせたり低下させたりする可能性があり、供給マトリックス内の化合物の安定性も異なる場合があります。

慣れても、ごく一部の動物はゼラチン飼料を摂取できず、期待される薬剤投与量を受けられない可能性があるため、分析から除外すべきです。拒否率は通常2.4%から6.4^%の範囲であり^、主要な方法論的障害とは言えません。飼料摂取量も品種によって異なる場合があります。このストレイン効果は、遺伝的背景^が食物に接近するまでの潜伏期に影響を与えるという以前の報告と一致しています。これらの要素は実験設計時に考慮すべきです。給餌コンプライアンスを系統識別と併せて報告することが、透明性と再現性の向上に推奨されます。

本研究のもう一つの重要な制約は、プロトコルが成魚ゼブラフィッシュのみで開発・検証されたため、幼生段階に直接移植できないことです。この方法は、個別に体重に基づいた投与と摂取を個別に行うゼラチンの一粒に依存しています。これは成虫では可能ですが、幼虫は小さな隙間、懸垂による摂食行動、そして信頼できる個体体重測定の困難さから実用的ではありません。したがって、幼虫への適応には大幅な改良が必要となります。これらの改良には、微小粒子の開発や代替的な投与戦略が含まれるかもしれません。

これまでに述べた給餌ベースの方法と比べて、この方法は優れた投与精度と使いやすさを提供します。市販のゼラチン飼料は異質な物質の分割が必要であり、投与量の精度が制限されます。¹²、他の方法はすべての動物に均一な量を与え、同じ体重を想定します。^14,21。個別投与を可能にすることで、ここで説明するゼラチンベースの給餌法は過少投与や過剰投与を回避し、実験的なコントロールを改善します。これにより、成体のゼブラフィッシュにおける薬物投与は、通常体重に基づく齧歯類のベストプラクティスと一致しています。この方法は、ストレスを最小限に抑えるため、精密かつ繰り返しの薬理学的操作を必要とする研究にも適しています。これには行動神経科学、神経薬理学、加成研究への応用が含まれます。また、麻酔薬と相互作用したり、水性環境での安定性が低い化合物にも有利です。ここでは成体のゼブラフィッシュで実証されていますが、この方法は他の水生モデル生物にも容易に適応可能です。総じて、この技術は投与の精度、動物福祉、方法論的柔軟性を高め、生物医学研究における魚モデルの有用性を拡大します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
(+) MK-801 hydrogen maleate powder	SIGMA-ALDRICH	M107-5MG
豚皮由来のゼラチン粉末	SIGMA-ALDRICH	G1890-100G	凝固力 ~300 g Bloom, タイプA, バイオ試薬
ミクロ ファイン 乾燥ブリーンシュリンプ	Brine Shrimp Direct	https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce	ファイン < 400ミクロン
スピルリナ粉末	Brine Shrimp Direct	https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz	99% 純度 青緑藻