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方法論記事

マラリア再感染時の末梢血単核細胞CD4+ T細胞の単細胞RNAシーケンス解析のための再現可能なスーラベースのプロトコル

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DOI:

10.3791/70858

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2026年7月31日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

この記事について

サマリー

ここでは、末梢血単核細胞CD4⁺ T細胞からの単細胞RNAシーケンスデータを解析し、マラリア再感染時の転写異質性と機能的免疫プログラムを特徴づけるための再現可能なSeuratベースのプロトコルを提示します。このプロトコルにより、疾患を超えた動的CD4⁺ T細胞状態および免疫応答の一貫した同定、比較、生物学的解釈が可能になります。

要約

ここでは、マラリア再感染のタイムポイントを横断したPBMC CD4⁺ T細胞単細胞RNAシーケンスデータを解析する再現可能なSeuratベースのプロトコルを提示します。本プロトコルは、マラリア再感染のタイムポイントを超えたPBMC CD4⁺ T細胞scRNA-seqデータを解析するための再現可能なSeuratワークフローを示し、その応用を示すために、代表的な公開データセットを用いています:Plasmodium特異的TCRトランスジェニックCD4⁺ T細胞データセット(GSE233703)および再感染関連タイムポイントを比較したポリクローナルCD4⁺ T細胞データセット(GSE233713;D27₍₃₎ 対 D30)。ワークフローには、統一された計算フレームワーク内で標準化された前処理、統合、クラスタリング、下流のトランスクリプトミクス解析が含まれます。この手法により、あらかじめ定義された免疫およびCD4/T細胞プログラムのモジュールスコアの体系的な計算、クラスター特異的マーカー遺伝子の同定、時間点解析による差異発現解析、そして下流の遺伝子オントロジーおよびKEGG経路の濃縮が可能となります。このワークフローの適用により、異なるCD4⁺ T細胞の機能状態を特定し、マラリア再感染のタイムポイントを通じた動的な転写変化が明らかになります。このプロトコルは標準化された可視化出力と表化された結果を生成し、パラメータ選択やトラブルシューティングに関する実践的なガイダンスを提供し、マラリアおよび関連する免疫学的文脈におけるCD4⁺ T細胞scRNA-seqデータセットの一貫性かつ再現性のある解析を促進します。このプロトコルにより、免疫応答の再現性かつ生物学的に解釈可能な解析が可能となり、免疫学研究における類似の単細胞データセットにも応用可能です。

概要

マラリアは依然として世界的な大きな健康負担であり、繰り返し感染が宿主免疫を複雑かつ不完全に理解された形で形成しています。CD4⁺ T細胞は、エフェクターサイトカイン産生の調整、B細胞の支援、炎症の調節を通じて抗マラリア免疫応答において中心的な役割を果たします2,3。マラリア再感染時、CD4⁺ T細胞は動的な転写再プログラミングを受け、エフェクター、調節、記憶、増殖、疲労状態の間の変化を反映し、寄生虫制御と免疫病理の両方に影響を与えます4,5。この異質性を正確に解明することは、免疫保護、免疫機能障害、そして自然に獲得された免疫やワクチンによる免疫の持続性を理解する上で不可欠です。ここでは、マラリア再感染のタイムポイントを超えてCD4⁺ T細胞のscRNA-seqデータを解析するための再現可能なSeuratベースのプロトコルを提示します。

単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は免疫の異質性を高解像度で特徴づけ、マラリアにおける寄生虫応答性のCD4⁺ T細胞サブセット、消耗プログラム、調節ネットワークを同定しています。しかし、品質管理、正規化、クラスタリング、統合における分析的変動は再現性を制限し、クロススタディ比較を複雑にすることがあります。10,11。しかし、マラリア再感染時のCD4/T細胞動態解析に特化した標準化され生物学的に導かれたワークフローが欠如しています。

既存のscRNA-seq解析の計算フレームワークであるSeuratやScanpyは、単一セルデータの前処理、クラスタリング、下流解釈のための包括的なツールセットを提供します12,13,14。Rで実装されたSeuratは、正規化、データ統合、可視化のための緊密に統合されたワークフローを提供し、SCTransformのような分散安定化手法を含み、異種免疫データセットでの信号検出を改善する13。Pythonで実装されたScanpyは、大規模なデータセットと効率的なメモリ使用に最適化されたスケーラブルなソリューションを提供し、特に高スループットやクラウドベースの解析に適しています(12,14)。これらの進歩にもかかわらず、感染環境における生物学的問題に明確に対処しつつ、透明性、適応性、一貫性をデータセット間で維持する標準化され再現可能なワークフローの必要性は依然として存在します。本プロトコルは、Seuratベースの前処理の堅牢性と、マラリア再感染時のCD4⁺ T細胞応答に特化した構造化された生物学的解釈を組み合わせることで、このギャップを埋めています。既存の汎用ワークフローと比較して、このプロトコルは再現性、生物学的知られたパラメータ選択、感染モデルに合わせた一貫したタイムポイント横断分析を重視しています。

このプロトコルの重要な特徴は、再現性と実用的な使いやすさに重点を置いていることです。品質管理の閾値は固定されておらず、中央値絶対偏差に基づくデータ適応的アプローチを用いて導出され、転写本の複雑度、シーケンス深度、ミトコンドリア含有量の閾値をデータセット固有の分布に合わせてスケールさせることを可能にします。この設計により、ワークフローは数千から数万のセルに及ぶさまざまなサイズのデータセットや、ドロップレットベースのscRNA-seq実験でよく見られる幅広いシーケンス深度に対応しています。ワークフロー内に組み込まれたガイダンスは、次元削減、クラスタリング分解、統合のための適切なパラメータ選択を支援し、分析が生物学的に意味を持ち、技術的に堅牢であることを保証します。それでも、ワークフローはデータの品質やシーケンスの深さに依存し、極端なスパーシティやバッチ効果のあるデータセットには調整が必要になることがあります。

このプロトコルは、Rやシングルセル解析に基本的な知識がある中級から上級者向けに設計されており、構造化された段階的な実装と完全に再現可能な出力により、意欲的な初心者にもアクセスしやすい環境を提供します。ワークフローは各段階で標準化された表や図を生成し、品質管理の要約、クラスタリング出力、差分発現結果、エンリッチメント分析などを含み、共同研究や複数研究の文脈での透明性、検証、再利用を促進します。このプロトコルは、感染や免疫学研究における時間点や状態を超えた免疫異質性の調査に特に適しています。

この手法は、マラリア再感染のタイムポイントを超えたCD4⁺ T細胞のscRNA-seq解析において、再現性のあるエンドツーエンドのSeuratワークフローを提供します。適応的品質管理、分散安定化、次元削減、クラスタリング、適切な場合の多サンプル統合を統合します13,15。生物学的解釈性を高めるため、ワークフローは免疫およびCD4⁺ T細胞サブセット遺伝子モジュールスコアリングを取り入れ、Th1、Tfh、Tr1、Treg、中央記憶、エフェクター記憶、増殖、細胞毒性、疲労などの機能プログラムを定量化します。遺伝子オントロジーおよびKEGGデータベースを用いた補完的なクラスタマーカー同定、タイムポイント差異発現解析、経路強化も含めており、T細胞状態の堅牢な注釈と比較を支援します19,20。公開されているPlasmodium scRNA-seqデータセットを用いて実証されていますが、このプロトコルはCD4⁺ T細胞の再現可能かつ解釈可能な単一細胞解析が必要な他のマラリア再感染モデルや免疫学的乱動にも広く適用可能です。総じて、このプロトコルはCD4⁺ T細胞応答の単一細胞解析のための再現可能かつ生物学的に解釈可能な枠組みを提供し、マラリアおよび関連システムにおける免疫動態の堅牢な研究を支援します。

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プロトコル

倫理声明:

本研究で使用されたすべてのデータは、公開されているデータセット(GSE233703およびGSE233713)から取得されました。元の研究は動物実験に関する制度的および倫理的ガイドラインに準拠していました。本研究は、Gene Expression Omnibus(GEO)リポジトリ(GSE233703およびGSE233713)から得られた公開および非同認化された単一細胞RNAシーケンシングデータセットの二次バイオインフォマティクス解析を含みました。本研究には新たなヒト参加者、臨床サンプル、特定可能な患者情報は含まれていません。公開されている匿名化されたデータセットに関する研究に関する機関および国家のガイドラインによれば、このバイオインフォマティクス解析には追加の倫理的承認やインフォームドコンセントは必要ありませんでした。これらのデータセットに関連する元の研究は、生物医学研究に関する関連する倫理基準および適用されるガイドラインに従って実施されました。

1. 再現可能なスーラベースのCD4⁺ T細胞scRNA-seq解析ワークフロー(GSE233703およびGSE233713

注:このワークフローは 補足ファイルS1として提供されています。また、全体のワークフローの概要を示す回路図 (図1)も参照してください。

  1. プロトコル開始前に範囲と意図するユーザーを定義してください
  2. 意図された利用者を定義してください
    1. このプロトコルは、Rおよび単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)解析に中級から高度な知識がある方に適用してください。
    2. このワークフローを、10xスタイルのマトリックス形式で生成されたマウス脾臓CD4⁺ T細胞データセットに適用してください。ステップワイズ構造と期待される出力を使って各段階を検証してから進めてください。
      注意:大規模なシーケンスデータセットを扱う際は、適切なデータ処理方法と安全な保管方法を確保してください。
  3. scRNA-seqを定義する
    1. 単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)を、個々の細胞における遺伝子発現を定量化するトランスクリプトム的手法²¹として扱います。
    2. scRNA-seqを用いて、複雑な組織内の離散的な細胞状態、遷移集団、異質な免疫プログラムを特定します。
  4. ソフトウェアおよびパッケージ要件を準備する
  5. コアソフトウェアのインストール
    1. R 4.2以降をインストールしてください。
    2. RStudioインターフェースを開きます。作業ディレクトリはsetwd()を使って設定します。
    3. source()関数を使ってスクリプトを順番に実行します。プロジェクトノートにR、RStudio、OSの正確なバージョンを記録してください。
  6. Rパッケージをインストールする
    1. 必要なCRANパッケージをインストールしてください:Seurat、Matrix、tidyverse、patchwork、pheatmap、RColorBrewer、cluster、glmGamPoi、ggplot2。
    2. 必要なBioconductorパッケージをインストールしてください:clusterProfiler、org。Mm.eg.db、enrichplot、そしてDESeq2です。
    3. 必要に応じてオプションパッケージのみインストールしてください:ダブレット除去用のDoubletFinder、軌道解析用のmonocle3。解析セッションの開始時に必要なすべてのパッケージを読み込みます。
  7. レコードバージョン
    1. ワークフローの最後に、sessionInfo() または同等の関数を使ってパッケージとセッション情報を保存してください。
    2. R版、Seurat版、DESeq2版、clusterProfiler版を含む主要な分析コンポーネントを原稿内で明示的に報告してください。
  8. 補足ファイル2に記載されている例のインストールコマンドを実行します
  9. ハードウェアとストレージの要件を確認してください
  10. 最小限のリソースを確認する
    1. 数千から数万セルのデータセットを日常的に解析するには、少なくとも16GB RAM、4つのCPUコア、20GBの空きディスク容量を持つワークステーションを使用してください。
  11. 推奨リソースを確認しましょう
    1. 統合解析、繰り返しプロット、またはオプションのダブル検出には32GB以上のRAMを使用してください。
    2. 大きなオブジェクトや統合データセットがメモリ関連エラーを発生させる場合は、future.globals.maxSizeを増加させます。
    3. 例のメモリ設定を適用する
  12. 補足ファイル2に記載されているメモリオプションを設定するには、以下のコマンドを実行してください

2. プロジェクト構造の作成

  1. ルートプロジェクトディレクトリを作成します
    1. 分析用のプロジェクトディレクトリを作成します。
    2. data/、scripts/、results_spleen_cd4/というサブディレクトリを作成します。
  2. 標準化された出力構造を使用
    1. ワークフローが出力を以下のディレクトリに書き込むことを確認してください:
      results_spleen_cd4/GSE233703/fig/
      results_spleen_cd4/GSE233703/表/
      results_spleen_cd4/GSE233703/rds/
      results_spleen_cd4/GSE233713/fig/
      results_spleen_cd4/GSE233713/テーブル/
      results_spleen_cd4/GSE233713/rds/
      results_spleen_cd4/post_markers/
  3. ファイル名を一貫して使う
    1. GEO入力ファイルの名前をスクリプトのパスに合わせて変更します。
    2. 以下の正確なファイル名を使用してください:
      データ/GSE233703_matrix.mtx.gz
      データ/GSE233703_genes.tsv.gz
      データ/GSE233703_barcodes.tsv.gz
      データ/GSE233713_d27_3_matrix.mtx.gz
      データ/GSE233713_d27_3_features.tsv.gz
      データ/GSE233713_d27_3_barcodes.tsv.gz
      データ/GSE233713_d30_matrix.mtx.gz
      データ/GSE233713_d30_features.tsv.gz
      データ/GSE233713_d30_barcodes.tsv.gz
    3. オプションのメタデータファイル名は以下の通りです:
      データ/GSE233703_cell_metadata.csv
      データ/GSE233713_cell_metadata.csv
  4. メタデータ要件を確認する
    1. すべてのメタデータファイルにバーコードの列が含まれているか確認してください。サンプル、タイムポイント、レプリケートなどのオプションの列を追加してください。
    2. メタデータ間の正確なバーコード一致とカウント行列を使いましょう。
      注意:インポート開始前に、マトリックストリプレットとメタデータファイルが期待されるパスに存在していることを確認してください。


3. インポートカウント行列と入力の整合性の検証




    
	
  1. 10xスタイル行列を読む
      
		
    1. 各matrix.mtx.gzファイルをスパースマトリックスとして読みます。
      2. 
		
    2. 対応する特徴(または遺伝子)ファイルとバーコードファイルをタブ区切られた表として読みます。
      3. 
		
    3. 利用可能な場合は特徴ファイルの2列目を使って、行列に遺伝子シンボルを割り当てます。make.unique()を使って一意な遺伝子記号を強制します。
      4. 
		
    4. マトリックス列にバーコード識別子を割り当てる。
      5. 
	
    
	
    2. 
	
  2. 例インポート関数を実行してください
      
		
    1. 補足ファイル2で言及されているコードを実行し、マトリックスをインポートし、識別子を割り当てます。
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. マトリックスの整合性を検証する
      
		
    1. 行列数が特徴数と等しいか確認します。行列の列数がバーコードの数と等しいか確認してください。
      2. 
		
    2. もし不一致が検出された場合はワークフローを停止してください。
      注意:不一致が検出された場合は、ファイルの整合性を確認し、フィーチャーファイルとバーコードファイルの正しい整合を確認してから再実行してください。
      チェックポイント:行数が特徴と一致し、列数がバーコードと一致する場合のみ進行してください。
      3. 
	
    
	
    4. 





4. マーカーおよびモジュールパネルの定義




    
	
  1. マラリア関連のCD4⁺ T細胞パネルを定義してください
      
		
    1. Th1、Tfh、Tr1、Treg、Tcm、Tem、枯渇、増殖、細胞毒性、Activation_early、Interferon_response、Immune_regulationの命名遺伝子パネルを定義します。
      2. 
		
    2. これらのパネルは、下流モジュールスコアリング用に名前のRリストに保存してください。
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. 補足ファイル2で言及されているRコードを実行して遺伝子パネルを定義してください。
    3. 
	
  3. マーカー検証遺伝子の定義
      
		
    1. Foxp3、Bcl6、Cxcr5、Il21、Ifng、Ctla4、Pdcd1、Lag3、Tbx21、Tcf7、Lef1などの標準マーカー遺伝子を含む別の検証パネルを定義します。
      2. 
	
    
	
    4. 



5. Seuratオブジェクトの作成と品質管理指標の計算




    
	
  1. Seuratオブジェクトの初期化
      
		
    1. 各データセットに対して、min.cells = 3 と min.features = 0 を使って Seurat オブジェクトを作成します。インポート時に恣意的な特徴カットオフを課さないでください。
      2. 
		
    2. データセット、サンプル、タイムポイントのメタデータを追加してください。バーコードマッチングを使って任意のメタデータを統合します。
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. 実行例 Seurat オブジェクトの初期化
      
		
    1. 補足ファイル2で言及されているRコードを実行してSeuratオブジェクトを作成し、メタデータを割り当てます。
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. 品質管理指標の計算
      
		
    1. マウスプレフィックス ^mt- を用いてミトコンドリア転写物割率を計算します。
      2. 
		
    2. 以下の指標を定量化してください
      nFeature_RNA
      nCount_RNA
      percent.mt
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. 補足ファイル2に記載されている例コードを実行してください。
    5. 
	
  5. フィルター前の品質管理を可視化します
      
		
    1. nFeature_RNA、nCount_RNA、percent.mt のバイオリンプロットを生成します。nCount_RNAとnFeature_RNA、nCount_RNA対 percent.mt の特徴散布図を生成する。
      2. 
		
    2. プリフィルタの数値は、QC_pre_filter_AllCells_vln.pngやQC_pre_filter_AllCells_scatter.pngなどの標準化された名称で保存してください。
      注意:フィルター前の分布は幅広く、低品質な尾部や高カウントの異常値が見られる可能性があります。
      3. 
	
    
	
    6. 



6. 適応QC閾値を導出し、低品質セルをフィルタリングする


    
	
  1. データセット固有の閾値を導出する
      
		
    1. 対数変換nFeature_RNA + 1 と nCount_RNA + 1。変換変数の中央値および絶対偏差(MAD)を計算します。
      2. 
		
    2. 以下の閾値を定義します。
      min_features = 10^(中央値 - 3 × MAD) - 1
      max_features = 10^(中央値 + 3 × MAD) - 1
      min_counts = 10^(中央値 - 3 × MAD) - 1
      max_counts = 10^(中央値 + 3 × MAD)– 1
      3. 
		
    3. ミトコンドリア閾値を、percent.mt の95パーセンタイルに3× MADを加え、5%から20%の間に制限を置くと定義します。
      4. 
		
    4. 関数を実行する前に、dataset_id、sample_id、out_dirが正しく指定されていることを確認してください。
      qc_thr <- derive_qc_thresholds(seu, dataset_id = "GSE233703", sample_id = "AllCells", out_dir = "results_spleen_cd4/GSE233703")
      5. 
	
    
	
    2. 
	
  2. フィルタリングを適用する
      
		
    1. すべての適応基準を満たす細胞を保持する:
      nFeature_RNA >= min_features
      nFeature_RNA <= max_features
      nCount_RNA >= min_counts
      nCount_RNA <= max_counts
      percent.mt <= max_percent_mt
      2. 
		
    2.  補足ファイル2に記載されている例コードを実行してください。
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. フィルタリング出力を保存
      
		
    1. QC_thresholds_*.csvとcell_counts_summary_*.csvを保存してください。
      一時停止点:必要に応じて中間出力や分析を再開してください。
      2. 
		
    2. フィルター後のQCバイオリンと散布図を作成・保存します。
      チェックポイント: フィルタ後の分布がよりタイトになり、複雑度の低いセルが除去され、極端な外れ値が減少することが期待されます。
      3. 
	
    
	
    4. 



7. データの正規化とPCAの実施


    
	
  1. 正規化と分散安定化
      
		
    1. 細胞周期スコアリングの前にRNAアッセイを正規化してください。有効であればセルサイクルスコアリングを実行してください。分散安定化にはSCTransform()を使ってください。
      2. 
		
    2. ミトコンドリアの内容を生物学的に正当化し、明示的に可能にした場合のみ退行させてください。
      3. 
		
    3. 研究デザインに必要な場合のみ細胞周期スコアを回帰させる。
      4. 
	
    
	
    2. 
	
  2. 補足ファイル2で述べた正規化の例を実行してください。
    3. 
	
  3. パラメータ値を定義する
      
		
    1. n_variable_features = 3000とします。
      2. 
		
    2. dims_max_for_pca = 50を用いましょう。
      3. 
		
    3. これらの価値を原稿に明示的に記載してください。
      4. 
	
    
	
    4. 
	
  4. PCAを実行し、主成分を選択します
      
		
    1. 正規化アッセイでPCAを行ってください。分散説明および主成分負荷を検査することで、PCAの成功を確実に実行します。
      2. 
		
    2. 各主成分による分散を計算します。
      3. 
	
    
	
    5. 
	
  5. 3つの基準すべてを用いてPCを選択します:
      
		
    1. 少なくとも 1% の分散を説明するPCを保持し、
      2. 
		
    2. 累積分散を約80%に保つこと、
      3. 
		
    3. 最終的な選考は10人から40人のPCに制限してください。
      4. 
		
    4. PCA_variance_table_*.csv、PCA_selection_rationale_*.csv、PCA_Elbow_*.pngを保存してください。
      5. 
	
    
	
    6. 
	
  6. PCAの例を実行してください
      
		
    1. 補足ファイル2で言及されている例。
      チェックポイント:選択したカットオフ後に限界分散利得が目に見える減少を示すエルボープロットが見られます。
      2. 
	
    
	
    7. 

















8. 近傍を構築し、解像度を選択し、セルをクラスタリングする


    
	
  1. グラフ構造の構築
      
		
    1. 選択したPCを使って共有の最近傍グラフを構築します。
      2. 
		
    2. ダブルレット検出にクラスタラベルが必要な場合は、初期の低解像度クラスタリングを実行してください。
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. オプションでダブルトを外すこともできます
      
		
    1. DoubletFinderはインストール済みかつ互換性がある場合のみ実行してください。
      注意:多重項アーティファクトが予想されるセル数が多いデータセットでのみダブルト検出を行ってください。
      2. 
		
    2. ダブレット除去後に正規化とPCAを再計算します。
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. クラスタリング解像度を選択します
      
		
    1. 解像度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2.8.3.2を評価する
      2. 
		
    2. 各テスト済み解像度の平均シルエット幅を計算します。少なくとも2つのクラスターを持つ解の中で、シルエットスコアが最も高い解像度を選択します。
      3. 
		
    3. resolution_sweep_*.csv、resolution_selection_rationale_*.csv、resolution_sweep_*.pngを保存してください。
      4. 
	
    
	
    4. 
	
  4. 補足ファイル2に記載されたコードを実行して、例解決選択を実行します
    5. 
	
  5. UMAPを実行し、最終クラスタリングを行います。
      
		
    1. 選択したPCを使ってUMAPを実行します。
      2. 
		
    2. 最近傍グラフを再構築します。選択した解像度でセルをクラスタリングします。
      3. 
		
    3. クラスタごとにラベル付けされ、サンプルやタイムポイントでグループ化されたUMAPプロットを保存してください。補足ファイル2に記載された以下のコードを実行してください。
      注意:安定したクラスター分離と主要な免疫状態に一致する解釈可能なUMAP構造を期待してください。
      4. 
	
    
	
    6. 



9. SCTベースの積分をGSE233713


    
	
  1. 別々の物を準備する
      
		
    1. D27_3とD30用の別々のSeuratオブジェクトを作成します。
      2. 
		
    2. 各サンプルごとに品質管理とフィルタリングを独立して適用してください。各サンプルをSCTransform()で個別に正規化します。
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. 統合を正当化する
      
		
    1. SCTベースの統合を用いて、時間点間の技術的差を減らしつつ、共有される生物学的構造を維持しましょう。
      2. 
		
    2. 統合が自動的に有益だと決めつけないでください。明確に検証してください。
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. サンプル積分
      
		
    1. SelectIntegrationFeatures()を使って統合機能を選択します。PrepSCTIntegration()でオブジェクトを準備します。
      2. 
		
    2. FindIntegrationAnchors(normalization.method = "SCT")でアンカーを見つけてください。データセットをIntegrateData(normalization.method = "SCT")で統合してください。
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. 補足ファイル2に記載されている統合例を実行してください
    5. 
	
  5. 統合の検証
      
		
    1. 時点ごとにグループ化された事前統合および統合後のUMAPプロットを生成します。時間点を超えた細胞混合の改善を成功した統合の証拠と解釈する。
      2. 
		
    2. 積分前後に隣接ミキシングを計算します。時間点ごとにクラスタ組成を計算し、積み重ねた組成プロットを作成します。
      3. 
		
    3. 以下の出力を保存してください:
      UMAP_preintegration_*
      UMAP_postintegration_*
      integration_diagnostics_*
      cluster_timepoint_composition_*
      注意:統合後の時間点分離の減少、隣接者の混合増加、生物学的に意味のある構造の完全な喪失なしに、ほとんどのクラスターで多時点寄与が見られることを期待してください。
      4. 
	
    
	
    6. 



10. クラスタの注釈付けとマーカー構造の検証




    
	
  1. マラリア関連モジュールのスコア
      
		
    1. あらかじめ定義されたマラリアCD4⁺ T細胞パネルに対してAddModuleScore()を実行してください。
      2. 
		
    2. クラスターレベルのモジュール平均とモジュールランキングを保存してください。
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. 補足ファイル2に記載されているモジュールスコアリングの例を実行してください
    3. 
	
  3. 予測クラスタラベルを割り当てる
      
		
    1. 各クラスタに最上位のモジュールを予測ラベルとして割り当てます。
      2. 
		
    2. セーブ:
      cluster_module_score_means_*
      cluster_module_score_rankings_*
      cluster_predicted_labels_*
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. 正準マーカーでクラスタを検証する
      
		
    1. 標準マーカーパネルを使ってDotPlotsおよびFeaturePlotsのマーカー検証を実行してください。
      2. 
		
    2. セーブ:
      DotPlot_marker_validation_*
      FeaturePlot_marker_validation_*
      注意:機能状態ごとに複数の標準遺伝子の一致発現を期待し、単独の単一遺伝子シグナルは見られません。
      3. 
	
    
	
    5. 



11. マーカーを特定し、差別表現を行う。




    
	
  1. クラスターマーカーの検索
      
		
    1. FindAllMarkers()はポジティブなマーカーのみを使って実行してください。
      2. 
		
    2. 救ってくれmarkers_all_clusters_*.csv。
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. 補足ファイルに記載されたコードを実行し、マーカーの識別例を実行してください
    3. 
	
  3. 利用可能な場合は、レプリケート認識型微分式を使用してください
      
		
    1. 有効なレプリケートメタデータが利用可能かどうかを確認してください。レプリケートが利用可能な場合は、レプリケートごとの集計カウントと条件を使い、DESeq2で擬似バルクDEを実行します。
      2. 
		
    2. セーブDE_pseudobulk_*。
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. 複製がない場合は探索的細胞レベルの差異発現を用いましょう
      
		
    1. 再現メタデータが欠如または不十分な場合は、単一セルDEを探索解析として実行します。
      2. 
		
    2. 探索状況を記録するためにDE_WARNING_*を保存してください。探索結果はDE_exploratory_celllevel_*として保存してください。
      3. 
	
    
	
    5. 
	
  5. グローバル差分式出力を生成する
      
		
    1. DEの結果のために火山プロットを作成し、Volcano_*を保存してください。
      2. 
		
    2. 重要なDE結果はフィルタリングされたテーブルとして保存してください。
      3. 
	
    
	
    6. 
	
  6. 機能的濃縮出力を生成する
      
		
    1. GOの生物学的プロセス強化を実行して、GO_BP_*を節約しましょう。KEGGのエンリッチメントを実行して、KEGG_*を節約しましょう。
      2. 
		
    2. ランク付きのlog2フォールドチェンジを使ってGSEAを実行し、GSEA_GO_*を保存してください。対応するバープロットやドットプロットを保存してください。
      3. 
	
    
	
    7. 
	
  7. クラスタ特異的な差分表現出力を生成する
      
		
    1. 各クラスタ内でDEを時点間に実行してください。
      2. 
		
    2. DE_cluster_*とDE_cluster_specific_combined_*を保存してください。
      3. 
	
    
	
    8. 
	
  8. 免疫に焦点を当てた差分発現出力を生成する
      
		
    1. Ifng、Cxcl10、Ctla4、Il10、Foxp3、Bcl6、Cxcr5、Pdcd1、Lag3、Havcr2、Il21、Tbx21など選択された免疫遺伝子のDE結果を抽出します。
      2. 
		
    2. 救DE_immune_focus_*。
      3. 
		
    3. 以下の出力を生成し保存します:
      DotPlot_selected_genes_by_timepoint_*
      Heatmap_immune_focus_*
      注意:グローバルDE、濃縮出力、クラスター特異的DE、免疫に焦点を当てたシグネチャー間の整合性が期待されます。
      4. 
	
    
	
    9. 









12. 最終出力を保存し、セッションをアーカイブする


    
	
  1. スーラオブジェクトを保存
      
		
    1. 各データセットの最終的なSeuratオブジェクトを.rds形式で保存してください。
      2. 
	
    
	
    2. 
	
  2. セッション情報の保存
      
		
    1. 出力ディレクトリのテキストファイルにsessionInfo()を書きます。
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. 補足ファイル2に記載されたコードを実行し、例のセッションエクスポートを実行してください
    4. 
	
  4. 出力完全性の検証
      
		
    1. 期待されるfig/、tables/、rds/ディレクトリに対応するファイルが含まれているか確認してください。
      2. 
		
    2. スクリプト、セッション情報、出力をまとめてアーカイブします。
      注意:QCサマリー、PCA出力、解像度選択出力、統合診断、モジュール注釈ファイル、微分データ出力、エンリッチメントファイルがすべて揃い、内部的に一貫しているまで報告書の作成を進めないでください。
      3. 
	
    
	
    5. 











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結果
シーケンシング品質および細胞レベルの品質管理(抗原特異的(PcAS反応性)TCRトランスジェニックCD4⁺ T細胞(GSE233703))


フィルター前のQC分布(図2A)では転写産物の複雑性が多様で、ほとんどの細胞は中程度の遺伝子およびUMI数を示し、少数の細胞は潜在的な多重遺伝子と一致する高カウントの外れ値プロファイルを示しました。散布図(図2B)では、124 nCount_RNAとnFeature_RNAの間に強い正の相関が示され percent.mt、総数との関連は弱く、適切なライブラリの複雑さと、フィルタリング前の広範な細胞ストレスの証拠は限定的であることを示しました。


任意のフィルタリングを避けるため、対数変換されたnFeature_RNA値およびnCount_RNA値に対して中央値絶対偏差(MA...
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ディスカッション
本研究は、マラリア再感染時のCD4⁺ T細胞転写動態を解析するための標準化かつ再現可能なシュラベースのワークフローを提示します。このプロトコルは、適応型品質管理、正規化、次元削減、クラスタリング、データセット統合、マーカー検証、モジュールスコアリング、差分表現解析を統合した統一計算フレームワーク内に機能しています。これらの分析ステップにより、抗原特異的および多クローンのデータセット13,14,15において生物学的に意味のあるCD4⁺ T細胞状態の再現性と解釈が可能となりました。


代表的な結果は、マラリア再感染に関連する協調したCD4⁺ T細胞プログラムを示し、Th1エフェクター、T濾胞ヘルパー(Tfh)、調節的、疲労関連、増殖性、インターフェロン応答性、記憶様状態を含む。IfngおよびTbx21の濃縮は寄生虫制御に関連する炎症性T...
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開示事項
著者たちは何も明かすことはありません。
材料
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マテリアル/機器名会社/情報源カタログ番号コメント/説明
10x Genomics形式のカウントマトリックスNCBI GEON/Aマトリックスマーケットファイル（matrix.mtx、features.tsv、barcodes.tsv）
clusterProfiler（Rパッケージ）BioconductorN/ARRID:SCR_016884; 機能的豊富度分析（GO、KEGG）
enrichplot（Rパッケージ）BioconductorN/ARRID:SCR_017030; 豊富度分析結果の可視化
GEOデータセットGSE233703NCBI Gene Expression OmnibusGSE233703PcAS特異的TCRトランスジェニックCD4+ T細胞scRNA-seqデータセット
GEOデータセットGSE233713NCBI Gene Expression OmnibusGSE233713ポリクローナルCD4+ T細胞scRNA-seqデータセット（D273 vs D30）
GitHub（オプション）GitHub Inc.N/ARRID:SCR_002630; バージョン管理と再現性（オプション）
glmGamPoi（Rパッケージ）BioconductorN/ARRID:SCR_021001; 加速SCTransformモデルフィッティング
Matrix（Rパッケージ）CRANN/ARRID:SCR_008389; scRNA-seqデータのためのスパースマトリックス処理
オペレーティングシステムMicrosoft / Apple / LinuxN/AWindows 10+、macOS、またはLinuxがサポートされている
org.Mm.eg.db（Rパッケージ）BioconductorN/ARRID:SCR_002643; マウス遺伝子アノテーションデータベース
patchwork（Rパッケージ）CRANN/ARRID:SCR_018787; マルチパネル図の組み立て
PDFビューア任意N/AQCプロット、UMAP、ヒートマップの表示
パーソナルコンピュータまたはワークステーション任意N/A統合用に最低16〜32 GB RAM推奨
pheatmap（Rパッケージ）CRANN/ARRID:SCR_016418; 遺伝子発現のヒートマップ可視化
R統計ソフトウェア（バージョン≥ 4.2）R Foundation for Statistical ComputingN/ARRID:SCR_001905; 核となる計算環境
RStudioデスクトップPosit SoftwareN/ARRID:SCR_000432; Rの統合開発環境
Seurat（Rパッケージ、v4以降）Satija LabN/ARRID:SCR_016341; シングルセルRNA-seq分析
tidyverse（Rパッケージスイート）CRANN/ARRID:SCR_019186; データ操作と可視化
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