腸自律神経の選択的切断のためのマウスモデル

サマリー

このプロトコルは、上腸間膜動脈を一貫した解剖学的ランドマークとして用いて、マウスの腸支配交感神経および副交感神経の正確かつ選択的な切断を可能にすることを目指し、腸の生理学と疾患の自律神経調節を研究するための焦点を絞った再現性のあるモデルを提供します。

要約

自律神経は交感神経系と副交感神経系で構成され、主に敵対的に多様な生理機能を調節します。腸の生理学および病理における自律神経支配の役割への関心が高まる中、腸を中心とした交感神経および副交感神経入力を正確に操作できる実験モデルの必要性が高まっています。ここでは、腸を支配する交感神経および副交感神経を選択的に切断する外科的プロトコルを提示します。上腸系膜動脈(SMA)を再現可能な解剖学的ランドマークとして用いることで、腸内自律神経束の信頼性を確実に特定し、その後の標的切断を可能にします。神経節切除術や横隔膜下迷走術のような広範な脱神経療法とは異なり、このアプローチは腸に指向する自律神経束の解剖学的に局所的な切断を実現し、腸外干渉の軽減に役立つ可能性があります。損傷は制御可能で、通常は最小限の出血と関連し、処置の一貫性と術後の回復をサポートします。手術には適切な顕微外科訓練が必要ですが、プロトコルは適応可能であり、ユーザーが特定の実験目的に合わせて主要なパラメータを調整できます。重要なのは、このモデルが生理的および疾患的条件下で交感神経および副交感神経が腸機能の調節に果たす役割を調査するための実用的なプラットフォームを提供していることです。本記事では、新規利用者が研究に導入しやすくするために、この手順を詳細に説明することを目的としています。

概要

消化管は自律神経系(ANS)の継続的な制御下にあり、交感神経および副交感神経経路が腸の生理学の基本的な側面、すなわち運動性、分泌物、上皮バリア機能、免疫恒常性を調整しています^1,2。大腸では、外発性交感神経入力が複数の細胞区画にまたがる領域依存的な効果を発揮することがあり、広範なANSの乱れが部位特異的な腸表現型を隠す可能性があることを強調しています^。逆に、迷走神経シグナル伝達や下流のコリン作動性機構によって古典的に媒介される副交感神経回路は、腸の免疫バランス維持や粘膜反応の形成に不可欠な存在としてますます認識されており、交感神経と副交感神経の関与を解剖学的に区別する実験戦略の推進をさらに促^{しています。}

生理的調節を超えて、自律神経活動は大腸がん(CRC)を含む腸疾患生物学の重要な修飾因子として浮上しています。CRCの最近の研究では、β2アドレナリン作動シグナル伝達とNGF発現性がん関連線維芽細胞が神経間質相互作用を強化し腫瘍進行を促進する両方向交感神経–間葉系プログラムが示されており、交感神経回路がCRCの病因に機能的に結合する直接的な証拠^{を提供しています。}同時に、コリン作動シグナル伝達は、オルトトピックマウスモデルにおけるムスカリン受容体3の薬理学的阻害や、コリン作動シグナル伝達と免疫チェックポイント発現およびその他の悪^性特徴の結びつきによって示されるように、CRCの成長および腫瘍関連免疫特徴と関連しています^4,5。重要なのは、自律神経が腸疾患に与える影響が、心理的ストレスや腸内細菌など他の調節因子とも収束する可能性があることです。腸神経系はストレス信号を腸の炎症に伝達^{でき、微生物}信号は腸-脳回路を作用させて腸外的交感神経ニューロンを調整し、神経調節が免疫および微生物生態と交差する多因子的枠組みを支持します ^6,7。

これらの収束する証拠は、生理学的および病理学的背景の両方で因果推論を支持する十分な解剖学的精度で腸内自律神経効果を分離できる実験的アプローチの必要性を強調しています。回路マッピングや神経調節の急速な進歩にもかかわらず、多くの一般的に使われる介入は臓器特異性に限界が残っています。全身薬理学的操作、化学的交感神経切除術、横隔膜下迷走切断術は広範な自律神経出力に影響を与え、腸以外の免疫および代謝のセットポイントを変化させることで、結腸特異的神経入力への因果帰属を複雑に^{します8。}例えば、迷走神経回路は炎症性サイトカ^イン産生を抑制し、迷走神経刺激は膵臓の内分泌機能やβ細胞動態を調節することがあり、上流的または非選択的介入が腸外効果をもたらし、腸^表現型の解釈を混乱させる可能性があることを示しています。これらの限界は、生理学および病理学における結腸制限自律神経メカニズムの単離を目指す研究において特に重要です。したがって、この手法の全体的な目標は、マウスにおける腸指向性交感神経および副交感神経線維の解剖学的選択的切断を可能にし、オフターゲットへの影響を抑えつつ腸の自律神経調節を検証する実用的なモデルを提供することです。

まとめると、このプロトコルは、他の腹部臓器の自律神経支配を最小限に抑えつつ、より精密なマウス腸自律神経支配アプローチを報告しており、腸外臓器の影響によるバイアスを減らして解釈性を高めています。

プロトコル

すべての動物処置は北京友好病院(首都医科大学)の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました(番号24-2026)。本研究では成体の野生型オスC57BL/6Jマウス(生後8〜10週、20〜30g)を用いました。試薬および機器に関する詳細な情報は 材料表に記載されています。

対象基準:生物学的変動を最小限に抑えるため、各実験では同じ株、性別、年齢帯のマウスを用いました。適応期間中に正常な活動、グルーミング行動、食事と水分の摂取量、便の排出を示す健康な動物のみが含まれていました。さらに、マウスは手術前に少なくとも7日間動物施設に慣れさせました。

除外基準:マウスは、手術中の制御不能な出血や重大な血管損傷、腸穿孔、生存に適さない重大な組織損傷の例を除外した。麻酔から回復しなかった動物(手術後2時間以内に歩行可能でない動物)も除外されました。追加の除外基準には、持続的な創傷裂開、重度の感染、または48時間以内に15%を超える、または72時間で20%を超える体重減少などの術後合併症が含まれていました。神経枝の外科的誤同定が事後組織学的評価で確認されたマウスも研究から除外されました。

1. 術前準備

1. すべての手術器具を滅菌しろ。
2. 痛みの感作を防ぐため、手術の30分前にすべてのマウスに予防的鎮痛を投与してください。メロキシカム(5 mg/体重体重)を皮下注射 で 投与します。
3. 温熱パッドを37°Cまで予温し、手術台の下に置いてください。
4. 手術部位(麻酔誘導室を含む)に75%エタノールをスプレーし、ペーパータオルでしっかりと拭き取ってください。誘導室の底に十分なペーパータオルを置いてください。
5. 麻酔誘導チャンバーとチューブを調べて漏れがないか確認してください。補充して、イソフルランを十分な量で確保してください。1L/min酸素で3%–3.5%のイソフルランを投与して麻酔を誘導します。マウスを継続的に監視してください。手術面は通常1〜2分以内に到達します。
6. ネズミを仰向けにして四肢を完全に伸ばし、低アレルギー性テープで固定します。ノーズコーンを取り付けて固定してください。維持のためにイソフルランを1.5%〜2.5%に減らします。足の引き込み反応がない(足の指のつまみに反応がない)と呼吸が規則的であること(55〜65回/分)によって麻酔深度を評価します。
   注:長時間の顕微外科手術中は、麻酔の深さを最初の手術面を超えて継続的に監視します。足筋の引き込み反射と呼吸数を5〜10分ごとに評価するほか、呼吸パターン(例:規則性や深さ)や心拍数を視覚観察や胸壁との接触でモニタリングします。粘膜の色(足や唇から評価)も定期的にチェックし、十分な酸素供給が確保されています。マウスに呼吸数の増加(>80呼吸/分)、自発的な動き、足反射の回復など麻酔の軽減の兆候が見られた場合、適切な手術面が回復するまで、イソフルラン濃度を0.25%〜0.5%ずつ増やし、十分な手術面が回復します。逆に、呼吸が浅くなったり不規則になったり、心拍数が著しく低下した場合は、安定した心肺機能が戻るまでイソフルランは0.25%〜0.5%減少します。この動的調整により、マウスは処置中適切な麻酔深度を維持しつつ心肺抑制を最小限に抑えます。
7. 両目に眼軟膏を塗布し、麻酔下での角膜乾燥や損傷を防ぎます。
8. 電動ヘアシェーバーを使って、恥骨結合のレベルから肋縁の下まで腹部の毛を剃ります。次に、手術用プラットフォームを立体顕微鏡で移動させます。
9. 手術部位をポビドンヨウ素綿棒で外側同心円状に(中心から周辺へ)消毒し、剣骨下から恥骨結合、そして両側側にかけて外側を覆います。これを3回繰り返します。その後、同じ方法で70%エタノールで拭きます。フィールドに抜け毛がないか確認しましょう。
10. 外科用マスクと使い捨てキャップを着用し、無菌の外科用ガウンを着用し、無菌手袋を着用してください。
11. ネズミは無菌の開口付きカーテンで覆います。開窓を約2×3cmに調整し、腹部の正中線に合わせて手術視野を完全に露出させます。カーテンの四隅を固定しろ。

2. 開腹手術と曝露

1. 滅菌鉗子を使って、恥骨結合の少しあたりの小さな皮膚のひだを優しく持ち上げます。無菌の鋭い先端ハサミで、先端に小さな切開(~0.3 cm)を開け、その後皮膚切開を中央線に沿って頭蓋状に1.5〜2.0 cm延長します。
   注意:鋭いハサミ先を最初の開口部に差し込んだ後、先端を上に傾け、皮膚の裏側に沿ってコントロールされた「プッシュカット」を行い、深く切り込みすぎて腹部の筋肉や内臓を傷つけないようにしてください。鉗子とハサミを使って、下の腹壁筋から緩んだ皮下結合組織を鈍く切り離します。皮膚切開よりやや広い切り離をして、その後の露出を容易にします。
2. 刀骨突起から約0.5cm後方に、無菌の細かい鉗子の先端を慎重に白線に挿入し、小さな組織のテントを持ち上げます。
3. 無菌の鋭い先端のハサミを使い、持ち上げた部位に小さな開口部(2〜3mm)を開けます。この時点で、滑らかな腹膜やその下の臓器(例:肝葉)が見えるはずです。
4. 無菌の鈍先ハサミの刃を腹腔に差し込み、腹壁にぴったりと近づけます。直接視覚化のもとで、白線に沿って切開を頭蓋方向に伸ばし、皮膚切開の全長と一致するまで続けます。
   注意:ハサミの先端は上向きに傾け、腸のループや血管がハサミの下にないことを確認するために、直接視線の下でのみ進めてください。

3. 上腸系膜動脈および神経切断の特定

1. 滅菌テープを使って腹壁を横方向に優しく引き戻し、腹膜腔を露出させます。
2. 腸が外に出るように、綿棒で腹壁に適度な圧力をかけてください。小腸、大腸、盲腸をマウスの左側に優しく移動させます。
   注意:露出した腸を、組織の乾燥や熱の損失を防ぐために、温かい(≈37°C)の滅菌生理食塩水で湿らせた滅菌綿パッドまたはガーゼで覆ってください。
3. 右手で、滅菌した湿らせた綿棒(または鈍先マイクロピンセット)で、胃、十二指腸、結腸を左上腹部に優しく一 括 して移動させます。この段階では脊椎の前方にある腹部大動脈がはっきりと見え、時には少量の腹膜後脂肪で部分的に覆われていることもあります。
4. 左腎静脈とセリアックの幹を特定してください。上腸間膜動脈(SMA)は、腹大動脈の前壁から単一の動脈枝として発生し、通常はセリアック幹から尾端~2〜4mm、左腎静脈のレベルまたはやや上にあります。
   注:左腎静脈は、腹大動脈の前方を水平に走り、下大静脈に流れ込む濃い暗い静脈です。セリアック幹は通常、腹大動脈の前壁から発射される最初の主要な動脈枝であり、左腎静脈の頭蓋上(上側)に位置し、肝動脈、脾臓動脈、左胃動脈に三叉化することが多いです。これに対し、SMAは肝臓や脾臓の枝を持たない単一の幹です。腸系膜の根部に入り、空腸、回腸、近位結腸に供給します。その経路をたどって間質間膜に入り込むことで、正しい同定を確認することができます。
5. SMAに平行に走る乳白色の索状の束を標的神経線維として特定します。SMAより上位に位置する神経束は副交感神経線維に対応し、SMAより下位に位置する神経束は交感神経線維に対応します(図1A)。
6. マイクロピンセットとマイクロハサミを使い、SMAを取り巻く脂肪とリンパ組織を非常に優しく分離し、神経線維を完全に露出させます。交感神経または副交感神経束をマイクロピンセプで優しく持ち上げてSMAから分離し、その後迅速かつ慎重に横断します(図1)。
   注意:解離時には、鉗子とハサミの先端を動脈の側壁に向け、器具を垂直に深い面に向けないようにしてください。もし重大な出血(例:SMAや腹部大動脈からの出血で滅菌綿棒で圧迫しても30秒以内に制御できない場合)が発生した場合、処置は直ちに終了されます。動物は麻酔下で人道的に安楽死され、その後のすべての分析から除外されます。このエンドポイントは、IACUC承認の人道的エンドポイントに従ってあらかじめ定義されており、不必要な苦痛を防ぐためです。一般的な術中合併症に関する追加のトラブルシューティングガイダンスは補足ファイル1に記載されています。

4. 腹腔の閉鎖

1. 腹部内のガーゼや綿パッドはすべて取り除いてください。腹腔内に活動的な出血がないか注意深く検査し、特にSMA解離野、神経切断部位、腹壁の切断面に注意を払ってください。
2. 温かい無菌生理食塩水(0.5〜1.0 mL)を少量で優しく腹腔を洗浄し、その後無菌のドライコットンスワブで余分な液体を慎重に吸い取ります。
3. 器具を使い、ガーゼや綿のカウントを行い、腹腔内に異物が残っていないか確認してください。
4. 6-0吸収性縫合糸を使い、切開の一端から連続したランニングステッチで腹膜と筋肉層を閉じます。各噛み合わせには腹膜と腹壁の筋肉が両側に含まれている必要があります。
   注意:傷の縁を鉗子で持ち上げ、各目を直接視覚化して置くことで、下の腸や網膜を引っかかないようにしてください。必要に応じて、湿らせた綿棒を使って腸を切開部から優しく離して移動させます。
5. 5-0の非吸収性シルク編み縫合糸で断続縫合で皮膚を閉じます。縫合糸は~2mm間隔で設置し、結び目は中程度の張力で結び、皮膚の縁を近似(窒息させないように)して虚血を防ぎます。
   注意:創傷の接合不良は切開ヘルニアを引き起こす可能性があります。筋肉層がしっかり密封され、皮膚の縁がきちんと整っていることを確認してください。
6. 閉じた皮膚の切開部をポビドンヨウ素綿棒で優しく再度洗浄します。
7. ネズミ(耳や尾)に手術日を印付けしてください。
8. ノーズコーンを外し、37°Cのウォーミングパッド(シングルハウジング)の上に置かれた清潔で柔らかいリカバリーケージに移します。誤嚥のリスクを減らすために、動物を横方横たわりの状態に保ちます。
   注意:低体温症を防ぐために、暖房パッドが37°Cで安定していることを確認してください。必要に応じて、体積維持のために1mLの温かい無菌生理食塩水を皮下投与します。
9. マウスが完全に意識を取り戻し、自立して伏せ姿勢を維持できるまで継続的に観察してください。
   注:術後鎮痛はメロキシカム(5 mg/kg、皮下投与、手術後最大48時間間隔24時間ごとに1回)で継続され、持続的な痛みや苦痛の兆候が認められた場合は追加の獣医による評価を受けました。

5. 術後モニタリングパラメータ

注:術後モニタリングは最初の72時間は1日2回、その後は研究期間中は毎日行われました。評価されたパラメータには以下が含まれます:

1. 全体的な外見、グルーミング、被毛の状態、姿勢、活動量などを監視してください。
2. 毎日体重を測ること;術前体重の48時間以内に15%以上、または72時間以内に20%の減少を人道的エンドポイントと定義します。
3. 手術部位を感染、裂孔、分泌物の兆候がないか検査してください。
4. 自発的な動き、扱いへの反応、苦痛の兆候(例:発声や落ち着きのなさ)などの行動を監視してください。
5. 獣医スタッフによる鎮痛にもかかわらず持続的な痛みや苦痛の兆候を示す動物を評価し、必要に応じて安楽死させてください。

結果

SMAを一貫した解剖学的ランドマークとして用いると、腸の自律神経束は血管に沿って走る細く真珠のような白色の構造として識別できます。SMAに対する解剖学的位置に基づき、上束が推定副交感神経束、下束が交感神経束と推定されました(図1A,D)。標的束が明確に可視化され、完全に中断され、残留線維が交差面を介さない状態で、術中で陽性の結果が得られます。切断部位で時折観察される乳白色または白っぽい液体は、周囲のリンパ組織や結合組織の破壊によって類似した外観が生じる可能性があるため、成功した神経切断の確認的証拠とはみなされませんでした。したがって、脱神経化の成功は解剖学的観察と下流検証を組み合わせて評価されました(図1B、C、E)。最適でない術中予帰には、束と周囲の結合組織の区別が困難、切断端に残留線維が残留している不完全な切断、または手術視野を遮る出血があり、これらはいずれも部分的な脱神経化や下流...

ディスカッション

小鼠SMAは腹大動脈の前壁(セリアック幹の下)から発生し、腸を含む主要な腹部内臓への動脈流入を供給^します。SMAの前方には結腸とその腸間膜があり、後方には左腎静脈および腹大動脈と密接に関連しています。上腸間膜は通常、右側に沿って走っています。マウスでは、SMAは非常に繊細で、重要な臓器や主要な血管に囲まれています。重要なのは、同じく細い交感神経線維と副交感神経線維がSMAに密接に付着し、その横を走っていることです。したがって、交感神経幹または副交感神経幹の切断には高い精度が必要です。

この手術中に2つの大きな課題に直面します。1つ目は、SMAおよびそれに伴う交感神経・副交感神経線維の術中信頼性の高い同定です。第二に、神経が血管壁と密接に対峙しているため、神経切断はSMA損傷や出血を引き起こしやすいことです。このリスクを最小限に抑えるために、ガラスプローブを用いて神経束をSMAおよび隣接結合組織から~3〜5mmの距離で慎重に分離してから切断します。すべての動作は神経への...

材料

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この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-0 シルク編組非吸収性縫合糸	Ethicon	W500
6-0 PGA 縫合糸	Jinhuan	CR631
麻酔誘導チャンバー	RWD Life Science	V100
動物麻酔機	RWD Life Science	R500IP
抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体	Abcam	ab181023
人工涙液潤滑剤眼科軟膏	Akorn	59399-162-35
C57BL/6Jマウス	上海モデル生物学技術センター	SM-001
コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、アレキサフルオアTM 555コンジュゲート	Thermo Scientific	C34776
複合顕微鏡	Yuyan Instruments	512
DAPIおよびホエヒスト核酸染色	Invitrogen	D3571
ファストグリーン	Thermo Scientific	F7252
精密止血用鉗子	Jinzhong 外科器具	JCG020
低アレルギー性手術用テープ	3M Blenderm	70200419342
イソフルラン	RWD Life Science	R510-22-10
マイクロ鉗子（湾曲）	Jinzhong 外科器具	WCC200
マイクロ鉗子（直線）	Jinzhong 外科器具	WCC190
マイクロ針ホルダー	Jinzhong 外科器具	WBA050
マイクロはさみ	Jinzhong 外科器具	Y3F010
マイクロシリンジ	Hamilton	7632-01
眼科はさみ（先端）	Jinzhong 外科器具	JC2303
眼科はさみ（丸みを帯びた先端）	Jinzhong 外科器具	JC2303
ポビドンヨウ化学綿棒	Winner Medical	206
組織と細胞固定液（4％パラホルムアルデヒド、PFA）	MedChemExpress	HY-DY3003
組織OCT冷凍培地	Sakura	C2077
チロシンヒドロキシラーゼ（E2L6M）ウサギモノクローナル抗体	Cell Signaling Technology	58844S

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