持続的な生理的機械的ストレス下でのライブセルイメージングのための汎用圧力負荷装置

Summary

ここで説明する圧力負荷装置は、培養細胞のタイムラプス光学イメージングを可能にし、標準的な細胞培養皿や逆さ顕微鏡と互換性があります。この装置を用いて、腫瘍静水圧微小環境がカルシウムシグナル伝達を促進することが確認され、腫瘍微小環境における機械的シグナル伝達の研究に現実的なプラットフォームを提供します。

Abstract

このプロトコルは、持続的な静水圧刺激中に粘着細胞のリアルタイム顕微鏡観察を可能にする静水圧負荷装置を説明しており、3.5cmの市販細胞培養皿と互換性があります。装置はアルミニウムベースから作られた気密培養室、光学的に透明なポリ(メチルメタクリレート)カバー、カバーに統合されたガス入口・出口ポート、そして密閉された観察窓で構成されています。調整されたガス源に接続することで、装置は安定した静水圧(0–200 kPa、可変)を維持しつつ、連続的な位相差または蛍光イメージングを可能にします。この圧力負荷装置を用いることで、形態、増殖、移動などの細胞表現型や行動に対する圧力誘導による線量依存的な影響を記録できます。さらに、蛍光信号はリアルタイムで記録することも可能です。ここでは、乳がんMDA-MB-231細胞および子宮頸がんHeLa細胞における圧力誘発Ca^2⁺ シグナル伝達の異質性と動態を、タイムラプスイメージングを用いた逆蛍光顕微鏡で観察・定量化しました。このプラットフォームは、機械的負荷とライブセルイメージングを統合し、従来のエンドポイントシステムの制約を克服することで、機械生物学的研究における汎用的なツールを提供します。

Introduction

多くの細胞、組織、臓器は、その^{生理機能の一部}として持続的または断続的な圧縮力を経験します。例えば、肺胞細胞は呼吸中に周期的加圧を受ける^{のに対し、}膀胱上皮細胞は尿貯留時に機械的負荷に耐^えます。固形腫瘍などの病理学的文脈では、がん細胞は空間的閉鎖や間^質液圧の上昇に由来する圧縮力に継続的に曝露されます。同様に、半月板変性や肺線維症などの他の疾患でも、半月板細胞⁵ や肺胞上皮細胞⁶ も、張力やマトリックス剛性由来の圧力による持続的な機械的応力を受けます。

機械的圧力が細胞表現型と挙動の強力な調節因子であることを裏付ける証拠が増えています^7,8。非悪性細胞では、圧縮ストレスが歯周幹細胞の増殖を促進し、侵襲的突出物を通じて破骨細胞融合を誘発します。逆に、がんモデルでは圧縮がjanus効果を示します。メラノーマ細胞の増殖と移動を抑制しつつ、同時にトランスクリプトムの再プログラミングを活性化し、化学抵抗性を促進する^10,11です。さらに、高浸透圧による体積圧縮は細胞内の混雑を誘発し、液体-液体相分離(LLPS)を通じてタンパク質濃度とイオン強度の再分布を刺激し、細胞の挙動や運命を大きく変えます。この物理的摂動は活性化されたWnt/β-カテニンシグナル伝達を通じて腸オルガノイドの増殖を促進し、腸幹細胞の自己更新を促進します¹²。さらに、細胞核では体積変化によって誘導されるLLPSが転写開始、伸長、終了の協調を通じて遺伝子転写制御に関与しています(^13,14)。

これらの圧力誘発的な生物学的効果を定量的に調査するためには、明確に定義された均一な圧縮刺激を適用できる実験システムが不可欠です。水培地に囲まれた体 外培養細胞では、静水圧が圧縮力を加える主要な生理学的に重要な手段として機能し、細胞メカノトランス^{デューション}の研究に広く採用されています。静水圧は、骨誘導因子の補足なしにヒト脂肪由来間葉幹細胞のアルカリ性リン酸活性を高め、骨形成を加速させることができます¹⁶。非アルコール性脂肪肝疾患では、静水圧のような機械的な力が中心的な線維化なしに門脈高血圧症に寄与し、組織多様性におけるその役割を強調しています¹⁷。静水圧は病態生理学的調節に重要な役割を果たしますが、静水圧の機構的研究には重大な制約があります。従来の圧力チャンバーでは刺激中の生細胞のリアルタイム観察が困難であるのです。ほとんどの実験システムはエンドポイント解析のみを許可しており、ピエゾ1メカノ活性化、Ca²⁺フラックスの異質性、細胞骨格再編成などのメカノトランスデューションイベントの空間的・時間的ダイナミクスを隠しています。このギャップは、静水圧が腫瘍や他の組織における表現型の多様性をどのように駆動するかの理解を制限しました。

この技術的ギャップを埋めるために、光学イメージングを通じて細胞の反応をリアルタイムで観察できる新しい実験プラットフォームが開発されました。このシステムは3つの主要な機能を統合しています:(1) 可変気圧コントローラー を介して 0–100 kPaの範囲内で持続静水圧を適用します(圧力計は0–200 kPaの範囲を持ち、生理的パラメータに基づいて加圧を選択できます)。例えば、報告されたさまざまな細胞タイプの圧縮ストレスに基づくと、ヒト骨髄間^質細胞で8-16 kPa、血管平滑筋細胞で¹²–24 kPa、ヒト乳腺上皮細胞で0–15 kPa²⁰.)。(2) 静水圧の適用時に高い時間分解能を持つ連続ライブセルイメージング;(3) 長期実験を通じて生理学的培養条件を維持すること。このアプローチにより、機械的刺激に反応して起こるPiezo1チャネルのリクルートメントと活性化、カルシウムシグナル伝達波、細胞骨格の再構築など、動的プロセスの直接的な可視化が可能になります。さらに、この装置は市販のほとんどの培養皿や逆立型顕微鏡に対応しており、実験室での使用が非常に便利です。これらの細胞内生化学的イベントをリアルタイムで監視する能力は、細胞がどのように静水圧を感知し適応するかについて前例のない洞察を提供します。力の初期感知、下流のシグナル伝達、表現型の変化を含む機械的伝達の時間的シーケンスを捉えることで、このプラットフォームは生理学的および病理学的文脈で静水圧が細胞行動にどのように影響するかの基本的なメカニズムを調査する強力なツールを提供します。

Protocol

1. 材料

1. デバイス仕様( 図1参照)
   1. 以下に記載した仕様に基づいてコンポーネントを準備します。
      台座:アルミニウム(Ø 56 mm、高さ 15 mm)、中央窓 Ø 40 mm。
      カバー:PMMA(Ø 56 mm)、6× M3ネジ穴、ルアーロックガスポート、シリコーンガスケット(内径25mm、外径32mm、厚さ0.8mm)
      圧力調整器:(0–200 kPa範囲)
2. 細胞と試薬
   1. 本研究ではMDA-MB-231とHeLa細胞を使用します。L-15培地、RPMI 1640培地、新生児乳牛血清(NCS)、1%抗生物質・抗菌液、そしてカルシウムイメージングプローブを用いて細胞培養と^Ca2+標識を行います。

2. デバイス準備

1. 製造
   1. カスタムデザインはこの研究の中心的要素です。仕様に従ってアルミニウムベースとPMMAカバーを精密加工します( 図1 および 補足図1参照)。
   2. シリコンガスケットを切り取り、必要なサイズに加工します。
      注:PMMA材料の光透過率は標準的な透過光イメージングに十分です。すべての成分は滅菌可能で、その後の細胞培養実験に適合していました。このチャンバーの製造公差には特別な要件は課されていません(本研究では±0.1 mmの公差が採用されました)。
2. 不妊手術
   1. ベース(アルミニウム)を滅菌するには、121°Cで20分間オートクレーブ処理します。
   2. カバー(PMMA)を滅菌するには、75%エタノールで拭き、その後30分間UVで消毒します。
   3. シリコーンガスケットを121°Cで20分間オートクレーブして滅菌します。

3. 細胞処理

1. 細胞培養
   1. 35mmの皿に種子細胞を30%〜70%の濃度で配置します。細胞をRPMI-1640またはL15培地(NCS10%を補給)で24時間、_CO2 インキュベーターで37°C、5% CO₂で培養します。
   2. 細胞の伝達には、0.25%のトリプシンで細胞を解離し、完全な培地で消化を終了させます。細胞が70%〜80%の合流に達したら再シードに使用します。
2. Ca²⁺ 染色
   1. 培地を取り出し、その後、バイオセーフティキャビネット内で事前に温めたハンクスバランスソルト溶液(HBSS)で細胞を2回洗浄します。
   2. 細胞間^Ca2+ を5μMカルシウムイメージングプローブで血清フリー培地に染色します。細胞を光の遮られた環境で37°Cで20分間孵育します。
   3. 染料を除去し、HBSSで細胞を3回洗浄し、その後血清不使用培地で30分間エステル除去します。

4. デバイスアセンブリ(図2)

1. 培養皿を圧力チャンバーの中央窓に移し、培地を取り出します。
2. 滅菌ガスケットを培養皿に入れます。
3. カバーを皿のガスケットスタックの上に重ね合わせます。
4. まず手で締めて抵抗を感じるまで締め、その後トルク制御ドライバーを使ってさらに1.5回回締めます。
5. シリコーンガスチューブをルアーロックポートに接続し、混合ガスをデバイス内に注入して漏れを確認します。
6. シリコーンガスチューブを外し、5mLの滅菌シリンジを使ってルアーロックポートから細胞培養皿に新鮮培地を注入します。

5. 圧力負荷とイメージング

1. シリコーンガスケットのルアーロックポートから、内径4mmのシリコーンガスチューブをデジタル圧力計とガスタンクに接続します。
2. 組み立てた装置を顕微鏡ステージに取り付けます。
3. 圧力を調整してください。
   1. ゲージを用いて0–200 kPaの範囲の安定性を検証します。
      注:HeLa細胞培養には、窒素75%、酸素20%、二酸化炭素5%を含む混合気体が使用されます。MDA-MB-231細胞培養には、窒素80%、酸素20%を含む混合ガスが使用されます。圧力負荷実験で使用されるガスの種類は、セルの種類、培地の種類、または特定の実験要件に応じて交換可能です。どの部品もモデル特有ではなく、圧力検出モジュールおよびその入口チューブの寸法は必要に応じて選択可能です。
4. デジタル圧力レギュレーターを使って目標圧力(例:100 kPa)を設定します。
5. 目標圧力に達したら画像診断を開始します。
6. イメージング
   1. ステージを調整し、撮影エリアを確認し、セルがピントが合っているか確認してください。
   2. 20×対物レンズを備えた逆形蛍光顕微鏡を用いて染色細胞の蛍光画像を取得します。以下のパラメータで、露光時間は400ms、5秒のタイムラプス間隔、総撮影時間は10分(FITCフィルター:Ex/Em = 490/525 nm、カットオフ = 515 nm)。
   3. システムの正常な動作と基準信号データの取得のために、非加圧状態で10分間画像を撮影します。
   4. ガスバルブを負荷圧力に開けた後、段高を調整してセルがピントを合わせ、動的カルシウム信号の撮影を開始します。
   5. 培養皿の底面の厚さと対物レンズの作動距離に基づいて対物レンズを選びます。過度の光漂白や光損傷を避けつつ、カルシウム信号の振動を監視できる露出時間を選択します。
   6. 他の動的信号を観測する際は、プローブの種類や実験要件に応じてパラメータを調整します。

6. トラブルシューティング

1. トラブルシューティングのアドバイスは 表1 を参照してください。

7. 統計解析

1. すべてのデータは平均±標準偏差(SD)として提示してください。GraphPadプリズムソフトウェア(米国)は、ペアなしの学生t検定による2つのグループ間の結果を比較するために使用されました。**p < 0.01、***p < 0.001、または****p < 0.0001 のとき、差を統計的に有意とみなします。

Results

この静水圧負荷装置のリアルタイムイメージング機能を検証するため、静水圧を加えた後の腫瘍細胞内のカルシウム信号の動態を観察しました。合流したMDA-MB-231、HeLa、A549細胞を35mm培養皿にシードし、その後の使用に備えました。カルシウムイメージングプローブで染色された後、血清を含まない培養細胞は40 kPaの静水圧にさらされました。10分間の静水圧負荷後、がん細胞内の総カルシウムレベルが上昇しました(図3A、Bおよび補足図2A、B)。カルシウム振動を誘発するために、血清フリー培地に10%のNCSを加えました。40 kPaの静水圧が、振動セルの割合が高いMDA-MB-231およびHeLa細胞のカルシウム振動を促進したことが示されています(図3C、ビデオ1、ビデオ2、ビデオ3

Discussion

このプロトコルは、調整可能な静水圧下での機械伝達動態をリアルタイムで観察できる、普遍的に適応可能な圧力負荷装置を示しました。光学的に透明なPMMAカバーと精密加工されたアルミニウムベースを統合することで、従来型チャンバーがエンドポイント解析のみを行うという重要な制約を克服します。この圧力負荷装置は標準的な逆立顕微鏡と連携し、タイムラプスイメージングを通じて動的情報を提供できます。標準的な35mm培養皿との互換性と簡単な組み立てプロセスが、デバイスの広範な普及を可能にしています。

この装置を用いて機械的圧力に応答するカルシウムシグナル伝達動態をリアルタイムで観察することは、機械的力と腫瘍病理生物学の分子関係を調査する貴重なツールを提供します。機械的圧力は腫瘍微小環境における固体応力の重要な要素であり、悪性進行の重要な調節因子としてますます認識されています。例えば、固形腫瘍における機械的混雑は異常なカルシグナル伝達を引き起こし、CamK-A-PNCK軸を通じてNF-κB経路を活性化し、乳

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗生物質・抗菌薬(100倍)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	15140122	完全培地中の濃度1%です
オートクレーブ	パナソニック、日本	MLS-3751-PC	アルミベースとシリコンガスケットの滅菌用
バイオセーフティキャビネット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	1300シリーズ A2 クラスII、タイプA2生物安全キャビネット	細胞取り扱いに適した無菌環境を提供します
Cal-520 AM、細胞貫通カルシウム指標	AATバイオクエスト、アメリカ	21131	生細胞内のカルシウムイオン濃度の動的検出のために
細胞培養皿(35mm)	BIOFIL、中国	TCD010035	細胞のシーディングに使われる標準的な35mmディッシュ
チャンバーベース(アルミニウム)	全義、中国	/	カスタムデザインØ56mm、H15mm、中央窓とOslash;40mm
チャンバーカバー(PMMA)	Quanyi、nbsp;中国	/	カスタムデザインØ56mm、6&時間;M3ねじ穴、ルーアロックガスポート
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	ヘラセル3111	培養条件は37度維持;Cは5%CO2
HBSS(ハンクスのバランスソルトソリューション)	ビヨタイム、中国	C0219	染色の前後のセル洗浄用
HeLa細胞株	中国、基礎医学科学研究所細胞資源センター、CAMS/PUMC	CRM-CCL-2	ヒト子宮頸がん細胞
逆形蛍光顕微鏡	ニコン、日本	エクリプス Ti2	蛍光イメージング用
ライボヴィッツのL-15中型	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	41300039	MDA-MB-231細胞培養について
MDA-MB-231細胞株	中国、基礎医学科学研究所細胞資源センター、CAMS/PUMC	CRM-HTB-26	ヒト乳がん細胞
新生児子牛血清(NCS)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	16010142	完全培地中の濃度10%です
圧力調整器	中国、洪潤	DP20	射程:0-200 kPa
RPMI 1640 ミディアム	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	31800022	MDA-MB-231細胞培養について
滅菌注射器(5 mL)	KDL、中国	1101010198	ルアーロックポートを通じて培地や試薬を注入する場合
トリプシン(0.25%)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	2520056	通過のための接着細胞の解離