方法論記事

酸誘発性Het-1A細胞モデルの確立およびmiR-107/FGFRL1軸の機能解析

DOI：

10.3791/70874

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2026年5月29日

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1Department of Gastroenterology, Longyan First Hospital, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated TCM Hospital of Guangzhou Medical University, 3Department of Gastroenterology, The Affiliated TCM Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 4Department of Gastroenterology, Jiaozhou Central Hospital of Qingdao, 5Clinical Nutrition Department, Jiaozhou Central Hospital of Qingdao, 6Department of Gastroenterology, People's Hospital of Wenshang County

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここでは、Het-1A細胞を用いたHCl誘発性食道炎細胞モデルを構築し、分子および細胞アッセイを用いてmiR-107/FGFRL1軸を調査するプロトコルを提示します。

要約

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豊富な証拠によれば、マイクロRNA(miRNA)が消化管の病態生理過程において重要な役割を果たしていることが示唆されています。しかし、逆流性食道炎(RE)におけるこれらの特異的なメカニズムは依然として十分に解明されていません。ここでは、酸誘発性REモデルを確立し、分子および細胞アッセイを用いてmiR-107/FGFRL1軸を調査するプロトコルを提示します。臨床サンプル解析を行い、RE(n=94)および健康対照群(n=94)患者からの血清採取を行い、その後RT-qPCRによる定量的検出を行いました。in vitroでは、Het-1A細胞を塩酸にさらすことを用いて酸誘発損傷モデルが確立されました。さらに、MTT細胞生存能力アッセイおよびデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて細胞の機能検証も実施されました。代表的な結果は、miR-107がRE患者の血清および酸処理されたHet-1A細胞でダウンレギュレーションされたことを示しています。miR-107はFGFRL1を直接標的化することでHet-1A細胞の生存率と炎症レベルを塩酸誘発的に変化させ、FGFRL1標的化を通じて細胞生存率と炎症の変化と関連しています。このプロトコルにより、reにおけるmiR-107/FGFRL1媒介機構の調査が可能になります。このアプローチは、REにおける分子メカニズムの研究に再現可能なプラットフォームを提供します。

概要

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逆流性食道炎(RE)は、胃酸や胃内容物が繰り返し食道に逆流し、食道粘膜の炎症、侵食、さらには潰瘍を引き起こす消化器疾患です。その重症度は逆流物質の性質、逆流の頻度、食道粘膜の抵抗性に関連しています1,2.胃食道逆流症(GERD)の非常に一般的なタイプとして、REは発生率が着実に増加し、世界的影響も徐々に拡大しています。REの非特異的な臨床症状は誤診や過小診断につながることが多いです。さらに、病気の再発はより深刻な消化器系合併症へと進行し、影響を受けた人々に大きな生理的・社会経済的負担をもたらすこともあります。REの標準的な臨床管理は通常、薬物療法(プロトンポンプ阻害剤など)、低侵襲内視鏡手術、または外科的治療を含みます。しかし、治療効果は薬物関連の副作用や手技上の罹患率によって制限されることが多いです。REの分子病因の理解が不完全であることから、その基礎となるメカニズムの解明は新たな治療標的を明らかにし、REはより効果的で患者特異的な治療戦略の開発に役立つ可能性があります。本プロトコルは、分子および細胞アッセイを用いてmiR-107/FGFRL1軸の調節役割を調査し、in vitro REモデルを確立することを目的としています。

マイクロRNA(miRNA)は、配列特異的結合を通じてmRNAの翻訳を調節する能力を通じて、多くのヒト疾患の病因に関与することが広く記録されています。例えば、miR-3682-3pはFHL1発現を調節することでWnt/β-カテニン経路に影響を与え、食道がんの進行を引き起こします8。miR-21-5pおよびmiR-223-3pは、下流標的遺伝子の発現を媒介することで好酸球性食道炎(EOE)の経過に影響を与えます9。miR-107はヒトの染色体10にコードされているmiRNAであり、さまざまな腫瘍形成過程(10,11,12)への関与から大きな研究の注目を集めています。現在の証拠は、miR-107が胃がんおよび食道がんにおけるホットスポットメディエーターであることを示しています(13,14)が、非腫瘍性消化器疾患におけるその病態生理的機能および調節機構については徹底的に調査する必要があります。しかし、miR-107機能のREにおける適切なin vitroモデルや統合解析的アプローチは依然として限られています。

胃酸逆流はRE15における食道粘膜損傷の主な病因因子として広く認識されています。最近の研究では、REの病因メカニズムは胃液による直接的な粘膜損傷ではなく、食道上皮細胞からのケモカイン放出の刺激によって炎症性組織損傷の連鎖が始まると提案されています16。この過程の分子メカニズムを調べるため、Het-1A細胞に塩酸を処理し、酸逆流による上皮損傷の主要な病理的特徴を再現する体外酸損傷モデルを構築しました。このアプローチは、体外での酸誘発性上皮損傷を模倣するための制御され再現可能なシステムを提供します。私たちは、miR-107がRE関連炎症およびアポトーシスにおける調節役割、ならびにその診断的可能性を体系的に探求しました。このプロトコルにより、食道上皮細胞におけるmiRNA媒介による炎症およびアポトーシス経路の調節の研究が可能となります。従来の in vivo 動物モデルや一次細胞培養と比較して、HCl誘導Het-1AモデルとmiR-107機能アッセイの組み合わせは、卓越した安定性、制御可能性、再現性を提供し、酸誘発性による上皮損傷、miRNA介在の転写後調節、食道細胞における炎症反応の研究に特に適しています17.この方法は、酸誘発性上皮損傷の分子メカニズムやmiRNA媒介による調節の研究に特に適しています。患者の臨床解析と組み合わせることで、このアプローチは臨床データと組み合わせてREの機構的研究を支えることができます。

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プロトコル

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1. 患者募集

  1. ヘルシンキ宣言に従って調査を行う。
  2. 青島交通中央病院倫理委員会(承認番号:2023033-01)から研究プロトコルの承認を取得してください。
  3. 研究開始前にすべての参加者が署名済みのインフォームドコンセントを提供していることを確認しましょう。
  4. 青島交通州中央病院の逆流性食道炎(RE)患者94名を特定し、登録します。
  5. 対照群として健康なボランティア94名を含めます。
  6. すべてのRE患者を胃鏡検査で診断し、食道粘膜の病変や侵食を確認します。患者をロサンゼルスの分類基準に従ってグループ化します。18。
  7. 消化器系の不快感が3か月以上続き、上部消化管手術の既往がなく、本研究に対して署名済みのインフォームドコンセントを提供したRE患者を含みました。
  8. 胃鏡検査によるバレット食道、食道静脈瘤、食道狭窄、深部潰瘍、悪性腫瘍病変の患者は除外します。

2. 血清サンプルの採取

  1. 8時間以上の夜間断食後、午前8時から10時の間に各参加者から5mLの空腹静脈血を採取します。
  2. 採取した血液を4°C、3000 g で15分間遠心分離×
  3. 遠心分離後は上清液を慎重に採取してください。
  4. 分離した血清は-80°Cの冷凍庫で次の測定まで保存してください。
    注意:サンプルは長期保存のために−80°Cで保管し、後で処理することができます

3. 細胞培養

  1. 市販の細胞バンクからヒト食道扁平上皮細胞株Het-1Aを購入してください。細胞は37°Cの水浴で1〜2分以内に素早く解凍します。
  2. Het-1A細胞を蘇生させ、RPMI-1640培地で培養し、胎児用牛血清10%とペニシリン/ストレプトマイシン1%を補足します。
  3. 細胞培養維持のためにインキュベーターのパラメータを37°C、CO₂5%に設定します。
  4. 培地を2日ごとに交換し、80〜90%の合流率で細胞を0.25%トリプシンEDTAを用いてパスジします。

4. 細胞誘導

  1. Het-1A細胞を6ウェルプレートに接種し、細胞密度を2×105 mLの完全培地に調整 します。
  2. 濃塩酸(HCl)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と希釈し、pHを4.0に調整します。
    注意:塩酸は腐食性があり刺激性があります。適切な個人用防護具(安全ゴーグル、手袋、白衣など)を使って塩酸を扱い、化学換気フードで作業してください
  3. 各ウェルに2mLの塩酸溶液を加えて細胞を誘導します。
  4. HCl溶液を廃棄し、各時点で事前に温めたPBSで細胞を2回洗浄してからアッセイを行います。
  5. 0分、10分、20分、30分でMTTアッセイを用いて細胞生存率を測定します。

5. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)

  1. フェノールクロロホルム試薬を用いてHet-1A細胞から総RNAを抽出します。
  2. ナノドロップ分光光度計を用いてRNA純度と濃度を評価し、A260/A280比率が1.8から2.0の間であることを確認します。
  3. 逆転写キットを使って逆転写増幅システムを構成します。
  4. PCRマシンで37°Cで逆転写を15分間、85°Cで5秒間、その後4°Cで保持します。
  5. 逆転写を通じて環状DNA(cDNA)を生成する。
  6. SYBR Green PCRマスターミックスを用いて、20μLの反応体積でRT-qPCR反応を行います。
  7. PCRサイクル条件を以下のように設定します:初期変性は95°Cで10分間、その後95°Cで15秒、60°Cで1分間40サイクルします。
  8. miR-107およびFGFRL1の内部対照として、グリセラルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)および小細胞核RNA(U6)を使用します。
  9. 2-ΔΔCt法を用いてデータを計算します。
  10. RT-qPCRを用いて炎症因子(IL-6、IL-8)およびアポトーシス関連調節分子(Fas、p53)のmRNA含有量を定量します。

6. 細胞トランスフェクション

  1. Het-1A細胞を6ウェルプレートで静的培養し、密度2×105 セル・ウェル-1で対数成長相に達するまで培養します。
  2. 合成オリゴヌクレオチド(miR-107 mimic/ov-FGFRL1; 50 nM)、ダウンレギュレーションされたプラスミド(miR-107阻害剤; 100 nM)、およびそれに対応する陰性対照断片を商業サプライヤーから入手します。
  3. 上記の断片をリポフェクタミン試薬を用いて48時間細胞にトランスフェクトします。

7. 細胞生存率

  1. Het-1A細胞を1ウェルあたり100μL培地に5×10の密度で96ウェルプレートに種付けし、一晩培養します。
  2. メチルチアゾリルテトラゾリウム(MTT)溶液(20μL、5mg·mL-1、最終濃度0.5mg·mL-1)をHet-1細胞に加え、37°Cで4時間培養します。
  3. ジメチルスルホキシド(DMSO、150 μL)を加え、混合物を10分間渦巻きます。
  4. 各ウェルの吸収度値(490 nm)をマイクロプレートリーダーで測定します。
  5. 各グループに3つの複製井戸を設定し、3回独立に繰り返します。

8. ELISAアッセイ

  1. 製造元の標準作業手順に従い、ELISAキットを使用してセル内のIL-6およびIL-8を検出します。
  2. この手順を独立して3回繰り返します。

9. ターゲット予測およびルシフェラーゼ活性アッセイ

  1. miRDBおよびENCORIデータベースを用いてmiR-107の潜在的標的を予測する。重なり合う標的を特定し、補完的な結合部位を確認します。
  2. miR-107とFGFRL1間の補完結合部位を特定します。
  3. 野生型FGFRL1 3'UTR含有miR-107結合部位(wt-FGFRL1)をクローニングし、獲得しました。特定の結合部位変異体(mut-FGFRL1)を生成します。
  4. Het-1A細胞をwt/mut-FGFRL1およびmiR-107と模倣・阻害剤(またはNC対照)と共トランスフェクトします。
  5. デュアルルシフェラーゼリポーターアッセイシステムを用いてルシフェラーゼ活性を測定します。

10. 統計解析

  1. GraphPad Prismを用いてROC解析を行うには、式データを入力し、ROC曲線関数を選択し、結果をエクスポートします。
  2. グループ間の違いは、学生のt検定(2グループ)または一方の分散分析(ANOVA;複数グループ)で評価し、その後Tukeyのポストホック検定を行います。
  3. p < 0.05を統計的に有意なものと考えます。
  4. 元の詳細なデータは補足表1にまとめられています。

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結果

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患者募集とベースラインの特徴 これらの結果は、生殖内消化症患者におけるmiR-107の発現および診断性能を示しています。 表1は 健康な対照群およびRE患者の一般的特徴を示しています。結果は、性別、年齢、基礎疾患の面で両群間に統計的に有意な差は見られず(p > 0.05)、比較可能性を示しています。

血清miR-107の発現と診断性能

血清miR-107のレベルはRE群で対照群に比べて有意に低かった(図1A)。ROC曲線解析により、miR-107がRE患者と健康対照群を区別することが示されました(AUC = 0.895;図1B)。さらに、RE患者では血清中のIL-6およびIL-8のレベルが増加し(

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ディスカッション

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REは胃食道逆流によって引き起こされる食道粘膜の炎症性疾患で、生活の質に影響を与え、重篤な合併症を発症するリスクを伴う幅広い症状があります。通常の生理的条件下では、胃は内在する防御機構により胃酸や胆汁から守られています。一方、強固な粘液バリアを欠く食道はこれらの因子による損傷を受けやすいです。したがって、REの病理的メカニズムを探る上で、非侵襲的マーカーの発現を検出することでREの発生を評価することに熱心です。このプロトコルは、in vitroでREを再現し、miRNA媒介の調節機構を解析する再現性のある方法を提供します。成功するための重要なステップには、塩酸濃度と曝光時間の正確な制御、一貫した細胞培養条件の維持、トランスフェクション効率の検証が含まれます。一般的な課題には、酸処理後の細胞生存能力の変動やトランスフェクションの結果の不一致があり、これらは処理期間や試薬条件の最適化によって最小限に抑えられます。生 体内 モデルと比較して、この方法は再現性と実験...

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開示事項

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著者たちは競合する利害関係がないと宣言しています。

謝辞

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広州伝統中医および中西医学統合技術プロジェクト(助成金番号:20242A011007)。広東省中医科学研究プロジェクト(助成番号:20262041)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アメリカタイプカルチャーコレクション マナッサス、アメリカ合衆国商業セルバンク
ジメチル硫酸およびnbsp;シグマ、ドイツD4540
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキットプロメガ、アメリカE1910年デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム
FastStart ユニバーサルSYBRグリーンマスターキットドイツ、ローシュ4913850SYBR グリーンPCRマスターミックス
胎児用牛血清ギブコ、ニューヨーク州、アメリカ合衆国10100147C
ジーンファーマ社上海、中国
塩化水素シグマ・オルドリッチ、ミズーリ州、アメリカ合衆国1099730001
IL-6 ELISAキットR&Dシステムズ、アメリカD6050ELISAキット
IL-8 ELISAキットR&Dシステムズ、アメリカD8000CELISAキット
インキュベーターForma Scientific、MA、アメリカ合衆国311 S/N29035
リポフェクタミン3000インビトロジェン、アメリカ合衆国L3000015リポフェクタミン試薬
メチルチアゾリルテトラゾリウムシグマ、ドイツM5655
マイクロプレートリーダーバイオテック、バーモント州、アメリカ合衆国ELx808
ナノドロップ分光光度計サーモ(マサチューセッツ州、アメリカ合衆国)ND-1000
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコ、ニューヨーク州、アメリカ合衆国15070063
PrimeScript RTキット宝(日本)DRR047A逆転記キット
トリゾール サーモ(マサチューセッツ州、アメリカ合衆国)10296010フェノール・クロロホルム試薬
超低温冷凍庫 中国、青島、海爾DW-86W100

参考文献

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Het 1AmiR 107RT qPCR

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