CRISPR/Cas9を媒介したカエノラブディティス・エレガンスにおける生殖細胞特異遺伝子の内因性蛍光タグ付け

サマリー

Caenorhabditis elegansの生殖細胞における内因性蛍光タグ付けのためのCRISPR/Cas9マイクロイン注射ワークフローで、in vivoタンパク質局在解析のためのホモ接合ノックインラインを得るためのものです。

要約

Caenorhabditis elegans(C. elegans)生殖細胞におけるタンパク質の局在は、配偶子形成中の遺伝子機能の解釈において中心的ですが、従来のトランスジーンアプローチでは発現がばらつき、生殖細胞内で沈黙させることもあります。ここでは、内因性遺伝子座に蛍光タグを挿入する実用的なCRISPR/Cas9ワークフローを説明し、自然制御下でタンパク質分布を報告する安定したノックイン対立遺伝子の生成を可能にします。プロトコルは、標的タンパク質に適したタグ付け戦略の選択、若年成人雌雄同体へのCRISPR試薬の生殖腺顕微注射による投与、注射された動物のスクリーニング回収など、手技の主要な段階をカバーしています。ノックイン候補は、PCRベースのゲノタイプ解析によって2世代にわたるホモ接合虫を分離し、編集された対立遺伝子を検証します。最後に、共焦点顕微鏡法を用いて生殖細胞の蛍光を検証し、生体内で細胞内局在を評価します。このワークフローは再現可能で、生殖細胞系強化遺伝子に広く適用可能であることを前提としており、発生解析や細胞生物学的解析のためにホモ接合型タグ付き株を簡単に確立する道筋を提供します。

概要

Caenorhabditis elegans (C. elegans)は、その短い生活環、透明な体、高い遺^伝的可扱性により、生殖発生と配偶子形成の研究に確立されたモデルです。 C. elegans は主に自家受粉の両性具有者として存在し、その生殖腺はまず精子生成を経て、その後卵形成に切り替わります。この生殖モードは系統維持を簡素化し、ホモ接^合系2の取得を簡単にします。最近の空間トランスクリプトミクスにより、性腺で豊かにされる遺伝子のリストが大幅に拡大し、 C. elegans³では生殖系全体で顕著な性特異的発現パターンが明らかになりました。近年では、単細胞RNAシーケンシングにより生殖細胞の発生軌跡の再構築や精子形成を支配する遺伝子調節ネットワークの推定が可能^{になりました。}これらのデータセットを合わせると豊富な候補リストが生成されますが、機能的解釈にはしばしば生 体内でのタンパク質挙動を観察する必要があります。具体的には、対応するタンパク質がいつどこで局在し、生殖細胞の発生過程でそのパターンがどのように変化するかを定義することです。

C. elegansの従来のトランスジェネシスは、しばしばプラスミドDNAの性腺マイクロ注射に依存しており、これにより多重コピーの染色体外配列が容易に生成されます⁵。しかし生殖細胞内では、これらの配列はしばしば強固に沈黙されており、これは反復DNAからの発現を制限することで生殖細胞の完全性を維持するのに役立つと考えられ^{ています。これにより}生殖細胞の機能と世代間の遺伝情報の安定性が保たれます。その結果、体細胞組織で容易に発現する遺伝子転換遺伝子発現構造は、生殖細胞内で弱いまたは不整合になることがあります。発現が検出可能であっても、コピー数効果や設計された調節要素によってタンパク質の用量やタイミングが変化し、ネイティブの局在や動態に関する結論を混乱させる可能性があります。これらの制限に対処するために、微小粒子爆撃法およびMos1媒介の単一コピー挿入法(MosSCI)が広く用いられ、低/単一コピーの統合トランスジェニック系統^8,9,10の生成に使われています。これらのアプローチは生殖細胞内での発現を改善することができますが、コスト、スループット、内因性調節の再現度には異なります。CRISPR/Cas9ゲノム編集は、ホモロジー指向修復を通じて内因性遺伝子座に蛍光タグを挿入し、タンパク質の局在と動態を報告する安定したノックイン対立遺伝子を生成するより直接的な方法を提供します。11,12,13,14。

ここでは、C . elegans におけるCRISPR/Cas9介有内因性蛍光タグ付けの実用的なワークフローを説明し、報告された生殖細胞系豊化発現パターンに基づいて選択された遺伝子に適用します。プロトコルは標的選択、ドナーテンプレートとRNA設計ガイド、ゴナドラマイクロ注射、下流スクリーニングをまとめてホモ接合ノックインラインを単離し、その後ジェノタイピングによる検証を行います。このアプローチは発生段階を超えた生殖細胞系発現遺伝子に広く適用可能であり、タンパク質の局在およびダイナミクスの定量的解析を可能にします 。 このワークフローは、生殖系統で発現した遺伝子のタグ付けや、ネイティブ 制御下でのタンパク質局在および動態の分析のための実用的な戦略を提供します。

プロトコル

カ エノラブディティス・エレガンスを対象としたすべての実験は、北京師範大学の実験室生物の管理・利用に関する機関ガイドラインに従って実施されました。

図1: C. elegansにおけるCRISPR/Cas9介在性内因性蛍光タグ付けの概要。 内因性蛍光ノックイン生成と検証の主な段階を示す回路図的ワークフロー。設計および構築段階では、生殖細胞系豊富なターゲット遺伝子と挿入部位が選定され、pDD162はCas9のCRISPR/Cas9プラスミドとして使用されRNA発現を導き、pPD95.75は蛍光タグ(例:GFP)および左右ホモロジーアームのサブクローニングをサブクローニングするドナーバックボーンとして使用されます。微小注射段階では、CRISPR/Cas9注入混合物(gRNA/Cas9プラスミド、ドナーテンプレート、共注射マーカーを含む)が若齢雌雄同体の生殖腺に注入され、その後シードプレート上で回収されます。検証段階では、マーカー陽性の子孫が下流の遺伝子型解析のために選抜され、PCRベースのノックイン事象の同定やDNAシーケンシングによる確認が行われ、成功したノックイン系統は蛍光顕微鏡で検出され、タグ付けタンパク質の生殖細胞内発現と細胞内局在が評価されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. 生殖細胞系強化ターゲット遺伝子を選択する

1. 公開データベースや公開文献を用いて、性腺や生殖細胞で優勢な発現を持つ候補遺伝子を特定します。
2. タンパク質の特徴に基づいて適切なタグ付け部位を選択してください。選択されたアイソフォームとタグ挿入位置を記録し、下流のガイドRNAおよびドナーテンプレート設計を行います(図1)。

2. ガイドRNAおよびドナーテンプレートの設計

1. プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の上流に20 ntのガイドRNA(gRNA)配列を特定する。NGG)、Cas9認識に必要なシーケンスを指定し、タグ挿入地点にできるだけ近づけます。
2. C . elegansのゲノムを選択し、オンライン設計ツール(例:IDT CRISPR設計ツール)を用いて候補gRNAを評価します。高い予測目標切断効率があり、高リスクのオフターゲット部位が予測されていないガイドを選びましょう。
3. gRNA配列をU6プロモーターとCRISPR発現プラスミド骨格内のgRNAスキャフォールドの間の領域にクローニングします。
   注意:gRNA配列をオーバーハングとして組み込むプライマーを設計してください。PCR増幅を行い、その後ホモログ組換えに基づく組立法を行います。これは結合に依存しないクローニング法で、制限酵素の消化を排除し、発現ベ^クター15への一段階のクローニングを可能にします。
4. サンガーシーケンスで正しい挿入を確認してください。
5. 標的遺伝子座から派生した約1,000 bpの左および1,000 bpの右ホモロジーアームに挟まれた蛍光タグを用いてドナープラスミドを構築します。
   注:プロテイナーゼK消化を用いて、N2ゲノムDNAを虫解体として調製したホモロジーアームを増幅してください。15〜20塩基のプライマーは線形化ベクターと蛍光タグと重なり合います。ホモロジーアームを組み立て、ホモロジー組換え を経て単一反応で骨格にタグを組み込む。N末端タグ付けの場合はATGスタートコドンの直後、C末端タグ付けの場合は停止コドンの直前に蛍光タグを挿入してください。適切なタンパク質の折りたたみと機能を維持するために、標的遺伝子と蛍光タグの間にリンカー配列を含めること。リンカーを使って融合パートナー間の立体干渉を減らし、リンカーとタグの両方が符号化シーケンスとともにフレーム内に挿入されるようにします。既知または予測される機能ドメイン、シグナルペプチド、または膜貫通領域を破壊しないよう、挿入部位を慎重に選択してください(補足ファイル1)。
6. タンパク質配列を変えずにPAMまたはガイド結合配列を破壊し、統合後のCas9再切断を防ぐために、ドナー相同型型配列にサイレント置換を導入します。
   注意:同義の点突然変異をホモロジーアーム増幅に用いるプライマーに組み込み、PAM領域内のコドンを標的とすること。
7. サンガーシーケンシングにより、両ホモロジーアームおよびタグ接合部のドナー配列の完全性を確認します。
   注意:検証済みプラスミドは短期保存は−20°C、長期保存は−80°Cで保存してください。

3. 注射混合物を準備する

1. CRISPR発現プラスミド、ドナープラスミド(pPD95.75に基づいて構成)、および共注射マーカーを無菌ddH₂O中に組み合わせ、 表1に記載された濃度で最終体積10 μLに注入ミックスを組み立てます。
   注:マーカーの可読性、候補回収率、注射後生存率のバランスを取るために、濃度を経験的に最適化してください。
2. 注入混合物を10,000 × gで10〜20分間遠心分離し、粒子状物質をペレット化し、マイクロインジェクション毛細管の詰まりを防ぎます。

構成要素	機能	作動濃度(ng/μL)
pDD162	CRISPR/Cas9プラスミド(Cas9およびgRNA発現)	50-100
ドナープラスミド(pPD95.75 骨格)	蛍光タグを持つHDRドナーテンプレートは、~1 kbのホモロジーアームに挟まれています	50-100
pRF4	共注入マーカー(ローラー表現型)	50-100
pPD122.11	共注入マーカー(GFP発現)	5-10
無菌DDH2O	最終巻に持ち込む	–

表1:注入ミックス組成およびプラスミド機能。 注射混合物にはCRISPR発現プラスミド、ドナープラスミド、pRF4、pPD122.11が指定濃度で含まれており、合計10μLの容量です。

4. 注入針を装填し準備する

1. ガラス毛細血管をマイクロインジェクション針に引き込み、鋭い先端を持つ長いテーパーを作るよう設定された針プラーで、生殖腺注入に適しています。
   注意:プーラーパラメータは経験的に最適化してください。例として、起動パラメータ:熱=540、プル=20、速度=100。
   注意:刺し傷を避けるために、抜かれた針は慎重に扱ってください。針を扱うときは鉗子を使い、使い終わった針はシャープス容器に捨ててください。
2. マイクロキャピラリーピペットを加熱し、2つに割ってローディングツールを作ります。
   注意:商業用ローディングチップは代替として使用される場合があります。
3. 短縮されたマイクロキャピラリーピペットの広い端にゴム製の吸引バルブを取り付けます。
4. 約1μLの精製注入ミックス上清液をローダーに吸引します。
   注意:正確な音量は重要ではありません。溶液が針先にしっかりと満たされていることを確認してください。
5. ローダーを注射針の後端に差し込み、注射ミックスを優しく注ぎます。
6. 装填した針を水平に10分間置き、溶液が先端に沈殿し連続カラムを確認します。
7. 注射顕微鏡に針を取り付け、明視野光学で先端をピント合わせします。
8. ハロカーボン油に浸したカバースリップの縁で優しく針先を開けて流量を試します。
   注:注入圧力(30–80 psi)を調整し、1秒¹⁶以内に性腺直径とほぼ等しい気泡を生成してください。

5. ミミズの注射準備

注意^:前述の線虫成長培地(NGM)プレートとM9バッファーを準備してください。ミミズは大 腸菌 OP50(以下OP50)をシードしたプレートに保管し、N2背景で注射を行います。

1. 健康な培地からL4両性体を選び、20°Cで10時間孵育することで、発達した生殖系列を持つ若年成人を得ます。
2. 細菌の残留を減らすために、ミミズを種付けされていないプレートに移します。
3. ガラススライドの上に乾いた2%アガロースパッドを用意し、ハロカーボンオイルを一滴滴塗ります。
4. まつげピッカーを使ってミミズをアガロースパッドに移します。
5. 寄生虫を固定し、生殖腺を注射のために位置付けてください。
   注意:乾燥を防ぐため、20〜30分以内に注射を完了してください。

6. 性腺顕微注射を行う

図2:若齢成虫C. eleganshermaphroditesにおける顕微注射のための遠位性腺シンシチウムの局在。(A) 装着された若い成虫雌雄同体の低倍率明視野画像。両腕の生殖腺が見えます。代表的な例として、1本の腕(矢印)で注射部位が示されています。ボックス領域はパネルBで高倍率で示された領域を示します。(B) パネルAのボックス領域に対応する遠位性腺の高倍率DICビュー。矢印は注射混合物が投与される遠位性腺合胞体内の注射位置を示しています。スケールバー:100μm(A)および20μm(B)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。 

1. 動けなくなったミミズを見つけ、低倍率の対物レンズで生殖腺を特定します。
2. マイクロマニピュレーターの操作で針を位置決める。
3. ワームを針に対して20〜40°の角度で配置します。
4. 高倍率で遠位生殖細胞に集中してください。
5. ワームを針に向かって前進させ、先端を性腺合胞体内に位置させます(図2)。
6. 溶液を注射し、目に見える性腺の腫れで出産を確認してください。
   注意:注入圧力(30–80 psi)、補償圧力(0.1–0.5 psi)、注入時間(0.1–0.3秒)を最適化してください。
   注意:過剰な圧力や体積はミミズの破裂を引き起こす可能性があります。
7. 針を抜き、次の注射のために位置を戻してください。
   注意:生存率を最大化するには片側注射、編集効率を高めるために両側注射を行う。
8. M9バッファーを追加してワームを解放し、それぞれのワームを個別のリカバリープレートに移します。
9. 20〜25匹の寄生虫に繰り返し注射します。
   注意:針が詰まったり損傷した場合は交換してください。
10. 20°Cで注入したミミズを2〜3日間培養し、回復を促します。

7. F1候補者のスクリーニングで正のノックラインを特定する

1. F1子孫を共注射マーカーでスクリーニングし、マーカー陽性動物を選択。
   注:異なる組織特異性およびスペクトル特性を持つ代替蛍光共注入マーカーの例は補 足表1に示されています。
   注意:信頼性を高めるために両方のマーカーを発現する動物を選択してください。マーカーの頻度が高い繁殖(「ジャックポット繁殖」)を優先しましょう。
2. 各F1ミミズを個別のプレートに移し、1〜2日間卵を産みます。
3. 各F1ミミズをプロテナーゼKバッファーで溶除し、PCRテンプレートを準備します。
   注意:すぐに処理しない場合、溶解液は−80°Cで保存してください。
4. ホモロジーアームの外側にゲノムプライマー1つ、内部タグプライマー1つを用いて接合PCRを行います。
   注意:PCR陽性のF1動物の対応プレートを保持してください。

8. ホモ接合ノックインラインのF2子孫をスクリーニングし、統合を確認する

1. PCR陽性のF1系統からF2子孫を個々のプレートに分離します。
2. F2ワームが子孫を産み、成虫を溶菌して遺伝子型解析を行うことを許可します。
   注意:必要に応じて解体液を−20°Cで保存してください。
3. ホモロジーアームの両側にプライマーを配置して、生成物サイズで野生型対立遺伝子とノックイン対立遺伝子を区別するPCRを行います。
4. 両方の挿入接合部でサンガーシーケンスによる正しい統合を確認してください。
5. 蛍光顕微鏡を用いて生殖細胞の蛍光発現と局在を確認します。
6. 確認されたホモ接合系統を拡大し、株価を維持しましょう。
   注:Cryopreserveは長期保管用の認証済みラインです。

結果

プロトコルに従い、若年成人雌雄同体はCRISPR/Cas9プラスミド(pDD162)、約1 kbのホモロジーアーム(pPD95.75)に挟まれたGFPノックインタグをコードするプラスミドドナー、および共注射マーカー(pRF4およびpPD122.11)を性腺マイクロインジェンダーで投与されました。生殖細胞系強化の標的遺伝子が代表例として用いられ、安定したホモ接合のノックイン対立遺伝子を生成し、この遺伝子は天然の調節制御下でタンパク質の局在を報告しました。

2回の注射セッションで30個のP0両性具有体を注入し、20個のF1動物を遺伝子型解析し、2つの接合PCR陽性系統が特定され、その後ホモ接合体ノックインワームの分離に用いられました。F1動物はまず単一化されてF2プレートを確立し、対応するF1成体は遺伝子型解析のために溶解されました。ノックイン陽性ラインは、選択されたホモロジーアームの外側に1つのゲノムプライマー、GFPタグ内に1つの内部プライマーを配置した片側接合PCRアッセイを用いて同定されました。

ディスカッション

このワークフローは、内因性遺伝子座に蛍光タグを挿入して、自然制御制御^下のタンパク質局在を報告する安定したホモ接合ノックインラインを生成するよう設計^{されています。}実際には、単一の結果よりも連続的な検証チェーンによって成功を判断するのが最善です。すなわち、F1 PCRスクリーニングによるノックイン候補の同定、F2遺伝子型PCRによるホモ接合体の決定、DNAシーケンシングによる編集された対立遺伝子の確認、そして共焦点顕微鏡による生殖細胞線蛍光の可視化です。この段階的な戦略は、内因性タグ付けが成功裏に達成されたかどうかを評価するための明確な運用枠組みを提供します。従来の外因性プロモーター...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガー	北京Lablead Biotech Co., Ltd.	QZ02	NGMアガープレートを調製するためのコンポーネント
アガロース	NOVON	ZZ14011	2%アガロースパッドを調製
線虫Caenorhabditis elegans 株N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		注射バックグラウンド株
遠心機	Eppendorf	5425	注射ミックスを澄清
コレステロール	北京化学試薬会社	57-88-5	NGMアガープレートを調製するためのコンポーネント
共注射マーカープラスミドrol-6 (su1006) (pRF4)	Guangshuo Ouラボ		候補を豊富にするローラーマーカー
共焦点顕微鏡	ZEISS	LSM880 + Airyscan	GFP発現/局在を検証
二リン酸カリウム（K2HPO4）	Sinapharm	CAS: 7758-11-4	NGMアガープレートを調製するためのコンポーネント
二リン酸ナトリウム（Na2HPO4）	Sinapharm	CAS: 7558-79-4	M9バッファーを調製するためのコンポーネント
DNAラダー	Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.	MF288-01	アガロースゲルのサイズリファレンス
ドナープラスミドバックボーン（pPD95.75）	Addgene	1494	HDRドナー構築のバックボーン
電気泳動システム	北京Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	112-0630	結合部スクリーニングおよび接合型の決定のためのアガロースゲル上PCR増幅物の分離
Escherichia coli OP50株	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		ワームの食物源
蛍光共注射マーカープラスミド（pPD122.11）	Fireラボ		候補を豊富にするGFPコマーカー
蛍光ステレオ顕微鏡	SOPTOP	SZX12-HT	蛍光共注射マーカーの生ワームスクリーニング
GelRed核酸ゲル染色	Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.	MF079-plus-01	DNAバンドの可視化
ガラスキャピラリー	World Precision Instruments	1B100F-4	ニードルプーラーで注射針を作成するために使用
ハロカーボンオイル700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	注射中の乾燥を防ぐ
インキュベーター	武漢Ruihua器械設備有限公司	HP400S	標準温度でワームを維持
硫酸マグネシウム（MgSO4）	Sinapharm	CAS: 7487-88-9	NGMアガープレートとM9バッファーを調製するためのコンポーネント
マイクロキャピラリーピペット	KIMBLE	71900-50	加熱してスナップし、ローディングツールを作成
マイクロインジェクターユニット	Eppendorf	FemtoJet 4i	マイクロ注射針を介して遠位性腺に注射ミックスを制御圧力パルスで送り、フットペダルでトリガー
顕微鏡用カバーガラス	Fisherbrand	12545A 22×30-1	マイクロ注射用に2%アガロースパッドを準備し、マイクロ注射中にワームを固定およびマウントします; カバースリップのエッジに注射針先を開く
マイクロ注射用顕微鏡	ZEISS	Axio Observer.A1	注射用顕微鏡
ニードルプーラー	Sutter Instrument Company	Model P97	ガラスキャピラリーを注射針に引っ張る
PCRサーモサイクラー	Bio-Rad	C1000 Touch Thermal Cycler	PCR増幅
pDD162（Peft-3::Cas9 + 空のsgRNA）	Addgene	47549	Cas9 + sgRNA発現
ペプトン	Gibco	308723	NGMアガープレートを調製するためのコンポーネント
リン酸二カリウム（KH2PO4）	Sinapharm	CAS: 7778-77-0	NGMアガープレートとM9バッファーを調製するためのコンポーネント
塩化ナトリウム（NaCl）	Sinapharm	CAS: 7647-14-5	NGMアガープレートとM9バッファーを調製するためのコンポーネント
ステレオ顕微鏡	Motic	K400L	アガロースパッド上にワームをピックし、マウントし、注射後の回復ステップを実行