研究記事

ヒト変形性関節症モデル軟骨細胞におけるSPRY2およびmiR-590-5p発現の調節がオートファジーに与える影響

DOI：

10.3791/70883

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2026年7月31日

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1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IL-1β誘導のC28/I2軟骨細胞モデルにおける炎症ストレスはmiR-590-5pを増加させ、SPRY2の発現を減少させました。この軸を調節することで、Beclin-1、LC3-II、Bcl-2の発現が変化し、miR-590-5p/SPRY2調節経路が、変形性関節症におけるオートファジー関連反応や軟骨細胞生存に影響を与える可能性が示唆されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

変形性関節症(OA)は、軟骨の進行性破壊と軟骨球の恒常性喪失を特徴とする、広く見られる変性関節疾患です。調節不全のオートファジーはOAの病因に寄与しますが、軟骨細胞におけるオートファジー関連応答を支配する分子メカニズムはまだ完全には解明されていません。本研究は、IL-1β誘導のC28/I2ヒト軟骨細胞を用いて、炎症性OA微小環境におけるmiR-590-5p/SPRY2調節軸の役割を調査しました。in vitro のOAモデルは、IL-1βでC28/I2細胞を処理することで確立されました。miR-590-5pおよびSPRY2の発現は定量PCRおよびウェスタンブロッティングを用いて評価されました。機能の増減と低下アプローチを用いて、SPRY2とmiR-590-5pがオートファジー関連マーカーであるBeclin-1およびLC3-II、ならびに生存関連タンパク質であるBcl-2に与える影響を評価しました。バイオインフォマティクス解析および救助実験を用いて、miR-590-5pとSPRY2の調節関係を調査しました。IL-1β処理はmiR-590-5pの発現を有意に増加させ、SPRY2 mRNAおよびタンパク質レベルを低下させました(P < 0.05)。SPRY2の過剰発現は、ベクリン-1およびLC3-IIの発現を著しく減少させ、それぞれ約65%と77%の減少を示しました(P < 0.05)。対照的に、miR-590-5pの過剰発現はBeclin-1、LC3-II、Bcl-2の発現を増加させ、miR-590-5pの阻害はこれらの効果を逆転させ、SPRY2の発現を回復させました。機能分析により、SPRY2はmiR-590-5pの下流規制ターゲットとして推定されていることが支持されました。これらの発見は、miR-590-5p/SPRY2軸が炎症性条件下でオートファジー関連マーカーの発現および軟骨細胞生存の重要な調節因子であることを示し、OAにおける治療標的としての潜在的な関連性を示唆しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

世界中で最も多い関節炎の形態である変形性関節症(OA)は、痛み、移動障害、身体障害の主な原因であり、医療システムや社会に大きな負担をかけています。病理学的には、OAは関節軟骨の進行性変性、滑膜炎症、軟骨下骨1の病理的再構築を特徴とします。疫学的推計によると、世界中で約3億300万人がOAの影響を受けており、人口の高齢化や肥満率の増加に伴いこの数は増加すると予想されます2。中国では、症状を伴う膝関節関節症の有病率は8.1%と推定されており、特に女性や農村部の人口で不釣り合いに高いです。3.高い有病率にもかかわらず、現在の治療選択肢は主に非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)による症状管理や進行疾患に対する外科的介入に限られています。変形性関節症治療薬(DMOADs)が存在しないことは、軟骨細胞の恒常性と生存を調節する分子メカニズムの理解が不完全であることを反映しています5。

関節軟骨の構造的および機能的完全性は、同化作用と分解活性のバランスを通じて細胞外マトリックス(ECM)の回転を維持する常駐軟骨細胞に依存しています6。OAの進行過程で、軟骨球は異常な機械的ストレスや炎症促進メディエーター、特にインターロイキン1β(IL-1β)や腫瘍壊死因子α(TNF-α)にさらされ、これらはマトリックス合成からマトリックス分解へのシフトを促進します。IL-1βマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)および凝集酵素の産生を刺激し、タイプIIコラーゲンおよびプロテオグリカンの合成を抑制することで軟骨破壊に寄与します7。さらに、IL-1βは酸化ストレスやミトコンドリア機能障害を誘発し、軟骨細胞のアポトーシスや老化を引き起こします。したがって、炎症状態下で軟骨細胞の生存を調節する細胞内シグナル伝達経路の特定は、OA研究の優先事項であり続けています。

オートファジーは、損傷した小器官やタンパク質集合体の除去とリサイクルを通じて細胞の恒常性を維持する進化的に保存されたリソソーム分解経路です。基礎オートファジーは細胞の生存とエネルギーバランスに不可欠です。しかし、調節不全のオートファジーは疾患の進行に寄与することがあります。OAにおいて、オートファジーは一般的に軟骨細胞が細胞ストレスに適応しアポトーシスに抵抗する保護反応と考えられています10。過去の研究では、特に進行期疾患において、OA進行中にオートファジ活性が低下し、細胞の質管理が損なわれ、軟骨細胞の喪失が増加することが示唆されています11。オートファジー関連活性の指標として一般的に用いられるタンパク質はいくつかあります。ベクリン-1はオートファゴソーム開始に関与し、微小管関連タンパク質1のライトチェーン3(LC3-IからLC3-IIへの変換)は自己食体形成のマーカーとして広く用いられています。対照的に、B細胞リンパ腫2(Bcl-2)はベクリン1依存性オートファジーを阻害しつつ、抗アポトーシス効果も発揮します13。しかしながら、LC3-IIおよびベクリン-1の静的測定では、自己ファゴソーム形成の強化とリソソーム分解の障害を独立して区別できないため、オートファジアム関連マーカーの解釈には注意が必要です。これらの限界にもかかわらず、オートファジー関連経路の調節はOAに対する有望な治療戦略として残っています。

マイクロRNA(miRNA)は、標的メッセンジャーRNAの3′非翻訳領域(3′-UTR)内の補完配列に結合することで転写後に遺伝子発現を調節する短い非コードRNAであり、mRNAの分解や翻訳抑制を引き起こす14。異常なmiRNA発現は、炎症、アポトーシス、ECM再構築への影響を通じてOAの病因に関与していることが示されています15。これらの分子の中で、miR-590-5pは骨代謝やその他の病理学的過程における調節役割から注目を集めています。過去の研究では、miR-590-5pが間葉幹細胞における骨形成分化を促進し、脂肪形成を抑制することが示されています16。がんモデルにおいて、miR-590-5pは文脈依存的な機能を示し、がん原性または腫瘍抑制調節因子として機能します17。さらに、miR-590ファミリーを含む微小RNA発現プロファイルの変化が、OA18中の関節組織の病理的再構築に関与していることが示唆されています。しかし、幹細胞やがんモデルから得られた証拠は、成熟した関節軟骨細胞に直接外挿することはできません。したがって、miR-590-5pが炎症性OA微小環境下で軟骨細胞応答を調節する役割は、まだ完全には解明されていません。

OAにおけるmiR-590-5pの潜在的な下流メカニズムを調査するため、 インシリコ ターゲット予測解析を行い、Sprouty2(SPRY2)を推定下流ターゲットとして特定しました。SPRY2はSproutyファミリーのタンパク質に属し、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達を負の方向性で調節し、RAS/MAPK/ERK 経路の活性化を抑制します19。MAPKシグナル伝達は軟骨細胞の分化、炎症反応、オートファジーに影響を与えるため、SPRY2はOA病態生理における重要な調節ノードとなる可能性があります。過去の研究では、SPRY2はリウマチ性関節炎モデルにおける炎症反応を抑制し、上皮系のアポトーシス関連調節に関与し、虚血性損傷モデルではオートファジー関連の応答とも関連していることが示されています。これらの観察はSPRY2がアポトーシスとオートファジーの両方の調節に関与していることを示唆していますが、関節軟骨細胞におけるその役割は依然として十分に解明されていません。したがって、miR-590-5pとSPRY2が炎症ストレス下の軟骨細胞生存に影響を与える調節軸を形成すると仮説が立てられました。

これらの観察に基づき、miR-590-5pは軟骨細胞におけるSPRY2発現を調節することでオートファジー関連応答を調節することが提案されました。miR-590-5pおよびSPRY2は他の生物学的文脈で個別に研究されていますが、OA軟骨細胞における機能的関係はまだ確立されていません。本研究では、C28/I2ヒト軟骨細胞におけるIL-1β誘導OAモデルを用いてmiR-590-5pおよびSPRY2の発現パターンを調べ、Beclin-1、LC3-II、Bcl-2の発現に与える影響を評価しました。miR-590-5p/SPRY2の調節軸を調査することで、軟骨細胞生存のエピジェネティックメカニズムを明らかにし、OAの治療対象となる可能性のある標的を特定します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は市販のヒト軟骨細胞株C28/I2のみを用いて実施されました。この研究には人間の参加者、人間の組織サンプル、患者由来の材料、または生きた動物は関与していません。したがって、機関および国のガイドラインに従い、機関審査委員会(IRB)および施設動物ケア・利用委員会(IACUC)の承認は必要ありませんでした。プロトコルで使用される工具、化学薬品、キット、試薬は 材料表に記載されています。

1. 細胞培養とOAモデル構築

ヒト軟骨細胞株C28/I2(詳細は材料表に記載)は商業供給者から入手されました。実験的再現性を確保するため、細胞はショートタンデムリピート(STR)プロファイリングで認証され、マイコプラズマ汚染の有無を確認するために定期的に検査されました。3番から8番の間の細胞がすべての実験で使用されました。細胞はDMEMで、胎児用牛血清(FBS)10%とペニシリン-ストレプトマイシン1%(すべての培養試薬は材料表に詳細記載)を37°Cで5%CO2を含む加湿大気で維持しました。

in vitro変形性関節症(OA)モデルを確立するために、C28/I2細胞に組換えヒトIL-1βを刺激しました。確立された文献6,7に基づき、過剰な即時細胞毒性を伴わずに強靭な異化状態を誘導するための予備的線量応答最適化実験を用いて、細胞は24時間にわたり20 ng/mLのIL-1βで処理されました。

2. 実験的グルーピングとトランスフェクション

メカニズム的経路を明らかにするために、研究は3つの主要な実験モジュールに分けられ、それぞれに最低3つの独立した生物学的複製が設けられました。

  1. SPRY2の機能増減:
    細胞は制御、OAモデル、OA+空ベクター(NC)、OA + SPRY2過剰発現プラスミド(OE-SPRY2)、および対応する小さな干渉RNA基(si-NCおよび3つの特定のsi-SPRY2構成要素:si-695、si-800、si-896)に割り当てられ、干渉効率をスクリーニングしました。
  2. miR-590-5p変調:
    細胞は対照群、OAモデル、OA + mimic NC、OA + miR-590-5p mimic、OA + 阻害剤 NC、OA + miR-590-5p 阻害菌群に分けました。
  3. miR-590-5p/SPRY2の調節関係の機能的検証:
    miR-590-5pとSPRY2の提案された調節関係をさらに評価するため、細胞はmiR-590-5pの模倣および阻害剤条件を受け、miR-590-5pの調節がOAモデルにおけるSPRY2発現を変化させるかどうかを調べました。
    トランスフェクションでは、C28/I2細胞を6ウェルプレートに2×10個5 セル/ウェルでシードしました。70%–80%のコンフルエンスに達した時点で、製造元のプロトコルに従い、軟骨細胞における小RNA送達手順を確立した市販の脂質系トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションを実施しました。簡単に言えば、プラスミド(OE-SPRY2およびNC;2 μg/ウェル)およびオリゴヌクレオチド(miR-590-5p mimic/inhibitorおよびsiRNA;50 nM)を還元血清培地で希釈しました。脂質-DNA/RNA複合体は室温で15分間インキュベートされた後、血清フリーDMEM内でドロップ段階で細胞に追加されました。トランスフェクション後6時間で培地を10%FBSを含む完全なDMEMに置き換え、細胞をさらに48時間培養してからRNAとタンパク質抽出を行いました。

3. qPCR検出

全RNAとmiRNAは、製造元のプロトコルに従い専用のmiRNA抽出キットで単離されました。RNA純度と濃度はUV-Vis分光光度計で評価され、A260/A280比が1.8–2.0のサンプルを下流解析に使用しました。市販の逆転写試薬を用いてcDNAを合成しました。qPCRのサイクル手順は以下の通りです:95°Cで10分間;95°Cで10秒、58°Cで30秒、72°Cで30秒の40サイクル。続いて、プライマー特異性とプライマー二量体の不在を確認するための融解曲線解析を行います。βアクチンとU6はそれぞれmRNAとmiRNAの内部対照として機能しました。相対的な遺伝子発現は2-ΔΔCt法を用いて計算されました。Col-II、SPRY2、Beclin-1、LC3、Bcl-2、miR-590-5p、および参照遺伝子を含むすべてのプライマー配列は表1に記載されています。

プライマーネーム 前方プライマー(5′-3′)逆プライマー(5′-3′)
U6ATTGGAACGATAGAGAGAGATのGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
βアクチンTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATのTGGAAGGTAACACCATAAACAAG
Bcl-2TGGGATTCCTGGAGGATTGACTCAGTCTACTCTCTCTGTGATGTGTG
ベクリン-1TCCCGTGTGGAATGAGAGGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-IIカッカアッカグトGAGCTGTAAGCGCCTTCTTAA

表1:定量PCR(qPCR)解析に使用されるプライマー配列。 qPCRによる標的転写本および内部参照対照の増幅および定量に用いられる順方向および逆プライマー配列。

特に指定がない限り、データは平均±標準偏差(SD)として表されます。統計的有意性は一方向ANOVAを用いて、その後S-N-K事後検定を行った。記号は以下の通りです:*P 0.05 対 コントロール<;#P < 0.05 と示されたモデルまたは陰性対照群の比較;そしてPはOA+阻害剤NCに対して0.05<。

4. ウエスタンブロット検出

細胞は、確立されたタンパク質抽出および免疫ブロッティング手順の後に、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを補足したRIPAバッファーを使用して細胞を収集・溶解しました。細胞の残骸を除去するために14,000 × g で15分間遠心分離した後、上清液を採取し、BCAタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を定量しました。同量のタンパク質溶解液(30μg)を変性させ、SDS-PAGで1.5時間分解消し、300 mAのPVDF膜に1.5時間26分移送しました。膜は、0.1%Tween 20(TBST)を含むTrisバッファード生理食塩水に5%無脂肪ミルクを室温で1時間ブロックし、その後4°Cで16時間、特異的一次抗体(例:anti-SPRY2、1:1000希釈)を用いて16時間潜伏しました。TBSTで3回洗浄した後、室温で適切なHRP結合二次抗体とともに膜を2時間インキュベートしました。タンパク質バンドはECL検出システムで可視化され、ImageJソフトウェアで定量化されました。

5. 統計分析

データは統計解析ソフトウェアを用いて分析されました。すべての実験は少なくとも3つの独立した生物学的複製(n≥3)で行われ、定量データは平均±標準偏差(SD)として示されています。パラメトリック検定の前は、データの正規性をシャピロ・ウィルク検定を用いて評価し、分散の均一性を評価しました。複数グループ間の統計的有意性は一方向分散分析(ANOVA)を用いて評価し、その後、Student-Newman-Keuls(S-N-K)の事後検定で複数比較を行いました。P < 0.05は統計的に有意とされました。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vitro軟骨球炎症モデルの確立

変形性関節症病理の分子メカニズムを調査するため、IL-1βで刺激されたC28/I2ヒト軟骨細胞を用いた in vitro 炎症モデルが確立されました。このモデルの妥当性は、ヒアリン軟骨細胞外マトリックスの主要成分であり、健康な軟骨細胞の特徴であるコラーゲンタイプIIアルファ1鎖(Col-II)の発現評価によって確認されました。定量解析により、IL-1βへの曝露は対照群に比べてCol-II mRNA発現が統計的に有意に減少していることが明らかになりました。この表現型の変化は、変形性関節症微小環境に似た異化的状態への初期シフトを示し、後の機構的研究の基礎モデルを提供します(図1)。

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図1:C28/I2ヒト軟骨細胞における in vitro 変形性関節症(OA)モデルの確立。 細胞は24時間にわたり20 ng/mLのIL-1βで処理されました。Col-IIの相対mRNA発現はqPCRで決定され、βアクチンが正規化対照として用いられました。データは3つの独立した生物学的複製(n=3)からの平均±標準偏差(SD)として提示されます。統計解析は一方向ANOVAを用いて実施されました。*P<対照群と比べて0.05 。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

C28/I2細胞におけるSPRY2過剰発現効率の検証

このモデルにおけるSprouty2(SPRY2)の機能的役割を評価する前に、SPRY2オーバーエクスプレクションベクターのトランスフェクション効率が検証されました。軟骨細胞は過剰発現プラスミド(OE)または陰性対照の空ベクター(NC)でトランスフェクトされました。qPCRおよびウェスタンブロット解析の両方で、OE群のmRNAおよびタンパク質レベルでSPRY2の強力なアップレギュレーションが、NC群および未処理対照群と比較して示されました。 図2に示されたこれらのデータは、実験システムがSPRY2レベルを高値で維持していることを確認し、その特定の生物学的影響の調査を可能にしています。

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図2:C28/I2軟骨細胞におけるSPRY2過剰発現の検証。 細胞は空ベクター(NC)またはSPRY2過剰発現プラスミド(OE)でトランスフェクトされました。SPRY2の相対的なmRNAおよびタンパク質レベルは、それぞれqPCR と ウェスタンブロットで評価されました。βアクチンは内部負荷制御として使用されました。データは平均 ± SD(n = 3)として表されます。*Pて0.05 です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

SPRY2の過剰発現は、炎症状態においてオートファジーを減弱し、アポトーシスマーカーを調節します

その後の実験では、SPRY2が炎症の文脈でオートファジーおよびアポトーシスの調節因子として機能するかどうかを明らかにしようとしました。OAモデル確立後、IL-1β治療単独でオートファジーマーカーのベクリン-1およびLC3-IIが著しく増加し、炎症ストレスに対する補償的オートファジー応答を示唆しました。同時に、モデル群ではBcl-2の発現が上昇していました。しかし、SPRY2過剰発現ベクターの導入によりこのプロファイルは大きく変化しました。 図3に示すように、モデル+OE-SPRY2群はモデル群およびモデル+NC群と比較してベクリン-1およびLC3-II mRNAレベルが有意に減少しました。さらに、SPRY2の過剰発現は炎症誘発性のBcl-2上昇を弱めました。これらの発見は、SPRY2が炎症性軟骨細胞におけるオートファジー関連マーカーの発現を負の調節していることを示唆しています。

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図3:SPRY2の過剰発現はIL-1β誘発炎症条件下でオートファジーを減弱し、アポトーシスマーカーを調節します。 SPRY2、Bcl-2、Beclin-1、LC3-IIの相対mRNA発現レベルは、対照群、モデル群(IL-1β処理)、モデル+NC、モデル+OE-SPRY2群においてqPCRにより定量化されました。βアクチンは内部統制を担当しました。データは平均標準差(SD)± n = 3として提示されます。統計的有意性は一方向ANOVAとS-N-Kの事後検定で決定されました。*Pは対照群と比較して0.05< ;#P<モデル+NCグループと比べて0.05 です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

miR-590-5pはオートファジー関連マーカーをアップレギュレートし、軟骨細胞の生存を促進します

次に、miR-590-5pがオートファジー関連および生存関連マーカーに与える機能的影響を調査しました。 図4に示すように、OAモデルにおけるmiR-590-5p模倣株を用いたトランスフェクションは、SPRY2過剰発現後の抑制効果とは対照的に、Bcl-2、ベクリン-1、LC3-IIの発現を有意に増加させました。逆に、miR-590-5pの阻害はBcl-2およびBeclin-1の発現を著しく減少させた一方で、LC3-IIの減少は統計的有意には達しませんでした。これらの結果は、miR-590-5pが軟骨細胞におけるオートファジー関連マーカーおよび生存関連Bcl-2の発現を増加させることを示唆しており、その下流の調節標的についてさらなる研究が検討されるべきです。

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図4:miR-590-5pはオートファジー関連マーカーの発現および生存関連のBcl-2発現を増加させる。 miR-590-5pミミック、阻害剤、またはそれぞれの陰性対照(NC)を用いたトランスフェクション後、OAモデルのBcl-2、ベクリン-1、LC3-IIの相対mRNA発現レベルはqPCRで測定されました。βアクチンが正規化制御として機能しました。データは平均 SD ± (n = 3) として示されます。*P<モデル+ミミック-NC群と比べて0.05 ;#P<モデル+阻害剤-NC群(Bcl-2およびベクリン-1)と比較して0.05 です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

IL-1βはmiR-590-5p/SPRY2軸およびオートファジー関連マーカーの発現を調節します

SPRY2を制御する上流の調節機構とmiR-590-5pとの関係を明らかにするため、炎症状態下でその発現プロファイルを調べました。IL-1β誘導のC28/I2細胞モデルの形態学的観察(図5A)に基づき、SPRY2遺伝子操作におけるトランスフェクション効率が検証されました。qPCRおよびウェスタンブロット解析の両方で、過剰発現(OE)群における強力なSPRY2アップレギュレーションと、小干渉RNA(siRNA)群でのノックダウンがそれぞれの対照群と比較して成功していることが確認されました(図5Bおよび5C)。逆に、miR-590-5pのレベルはIL-1β治療後に有意に上位調節されました。

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図5:SPRY2トランスフェクション効率の形態学的観察と検証。 (A) IL-1β処理後のC28/I2細胞の形態学的観察(20×、位相差顕微鏡写真)。(b) 対照群、NC群およびSPRY2過剰発現(OE)群におけるSPRY2の相対的なmRNAおよびタンパク質発現レベル。(C) 対照群と比較して、SPRY2の過剰発現(左)およびSPRY2ノックダウンを特定siRNA(si-896、si-800、si-695)で確認した代表的なウェスタンブロット画像。βアクチンは内部負荷制御として機能しました。データは平均 ± SD(n = 3)として表されます。*P<対照群と比べて0.05。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

この逆発現パターンが調節関係を反映しているかどうかを明らかにするため、TargetScan Human 7.1を用いてヒトSPRY2(ヌクレオチド236–243)の3′-UTR内にhas-miR-590-5pの8mer推定結合部位を特定しました。 図6 の配列アラインメントは、予測されるシード領域の相補性を示しています。その後、miR-590-5p変調がOAモデルにおけるSPRY2発現を機能的に変化させるかどうかを解析する救助実験が行われました。miR-590-5pミミックおよび阻害剤のトランスフェクション効率が確認された後(図7A、B)、救済アッセイによりmiR-590-5p阻害がOA関連のSPRY2 mRNA発現抑制を逆転させることが示されました(図7C)。miR-590-5pミミックはIL-1βによる顕著な抑制以外にSPRY2発現をさらに減少させなかったのに対し、miR-590-5p阻害は阻害剤陰性対照群に比べてSPRY2発現を有意に増加させた。これらの発見は、炎症性軟骨細胞におけるmiR-590-5pとSPRY2の間に逆の仮定的な調節関係があることを支持しています。

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図6:miR-590-5p/SPRY2調節相互作用の推定されるシリコでの予測。 TargetScan Human 7.131,32を用いてバイオインフォマティクス解析を行い、推定されるmiRNA結合部位を特定しました。この回路図は、has-miR-590-5pとヒトSPRY2(ヌクレオチド236–243)の3′-UTRとの間の予測される配列アライメントおよび種子領域の相補性を示しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図7:軟骨細胞におけるmiR-590-5p調節がSPRY2発現に与える影響。 miR-590-5pミミック(A)および阻害剤(B)のトランスフェクション効率は、それぞれの対照群と比較してqPCRにより確認されました。(C) OAモデルにおけるmiR-590-5p変調後の示された実験群間で、SPRY2 mRNAの相対発現を測定した。U6とβアクチンはそれぞれmiRNAおよびmRNA定量の内部対照として用いられました。データは平均±標準差(n = 3)として示されます。*Pは対照群と比べて0.05<;#P < それぞれのMimic-NC群または阻害剤NC群と比べて0.05;およびPはOA+阻害剤-NC群と比較して0.05<。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4の結果と一致して、オートファジー関連マーカーの変化はSPRY2発現低下による効果と並行しており、miR-590-5pがSPRY2介在の阻害を緩和することで発現を強化する可能性が示唆されました。これらの発見を総合すると、IL-1βがmiR-590-5pをアップレギュレーションし、miR-590-5pがSPRY2発現を抑制し、SPRY2の減少がBeclin-1およびLC3-IIマーカーの発現増加と関連しているという推定シグナル伝達軸を支持しています。

データの利用可能性:

本研究のデータは 補足ファイル1に記載されています。

補足ファイル1:本研究で使用されるデータセット(qPCRソースデータ、ウェスタンブロットソース画像、統計解析出力を含む)。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去の研究では、miRNAが開始、小胞伸長、成熟を含む複数の段階でオートファジーを調節することが示されています27。miRNAのOA病因への関与は、炎症、アポトーシス、細胞外マトリックスリモデリング、オートファジー関連経路への影響を通じてますます記録されています。miR-590-5pは細胞の恒常性およびがん関連プロセスと関連しています 28,29,30。骨格および軟骨関連の文脈では、miR-590-5pはヒト間葉幹細胞の軟骨形成分化を促進することが報告されています16。一方、OA軟骨細胞モデルでは、FGFを標的とすることで増殖、アポトーシス、炎症反応を調節できます。18,24。しかし、miR-590-5pがOA軟骨細胞におけるオートファジー関連反応に影響を与えるかどうかは依然として不明です。

そのため、RNAInterとTargetScanを用いて潜在的な下流媒介物質を探り、両解析ともSPRY2をmiR-590-5p関連標的として示唆しました。TargetScan Human 7.131,32はSPRY2 3′-UTRのヌクレオチド236–243に予測される8mer種子領域結合部位を特定しました(図6)。SPRY2は受容体チロシンキナーゼ/MAPKシグナル伝達の負の調節因子であり、複数の組織で発現しています19。関節内SPRY2遺伝子移動は、ラットにおける補助剤誘発性関節炎の軽減効果が報告されています21。SPRY2の過剰発現はHGF/SF媒介の細胞成長、侵入、移動、細胞分裂を抑制することがあります。一方、Spry2の機能喪失はMAPK-ERKの過剰活性化およびB細胞増殖の増加と関連しています。34。SPRY2はまた、アポトーシス関連の調節22、miRNA関連の移動制御35、および虚血モデル23におけるオートファジー関連応答にも関与しています。これらの研究は、SPRY2を炎症シグナル伝達、生存関連経路、オートファジー関連応答を結びつける調節結節として支持しています。

OA軟骨細胞におけるmiR-590-5pとSPRY2のこれまで報告されていなかった関係を踏まえ、それらの相互作用の可能性に関する生物情報学的予測がさらなる実験的研究を促しました。本研究結果は、IL-1β刺激のC28/I2軟骨細胞ではSPRY2が有意にダウンレギュレーションされる一方で、miR-590-5pが上流されていることを示しており、この軸が炎症性軟骨細胞応答に関与していることが示されました。機能的には、SPRY2の過剰発現はBeclin-1およびLC3-IIの発現を減少させ、オートファジー関連マーカー発現への抑制効果を支持しました。逆に、miR-590-5p阻害はベクリン-1およびBcl-2の発現を減少させ、SPRY2の発現を回復させ、推定される逆調節関係と一致しました。Bcl-2はベクリン1依存性オートファジーを阻害しつつ、抗アポトーシス効果も発揮できるため、Bcl-2とベクリン1およびLC3-IIの同時上昇は文脈特有の解釈が必要です。この炎症性OAモデルでは、Bcl-2のアップレギュレーションは主に生存関連の抗アポトーシス応答を反映している一方で、ベクリン-1およびLC3-IIの発現増加はSPRY2関連抑制の緩和を反映している可能性があります。これらの発見は、miR-590-5pが炎症ストレス下でSPRY2を抑制することでコンドロサイト生存関連シグナル伝達とオートファジーマーカーの発現を協調させるモデルを示唆しています。

本研究はmiR-590-5p/SPRY2軸に関する貴重な機構的洞察を提供しますが、いくつかの限界を認めるべきです。まず、すべての実験は不死化されたC28/I2細胞株を用いた2次元 in vitro システムで実施されました。この簡略化されたモデルでは、 生体内で関節軟骨の生体力学的ストレス、多細胞相互作用、炎症性微小環境を完全に再現できず、発見の即時の翻訳応用性を制限しています。第二に、バイオインフォマティクスの予測やレスキューアッセイはmiR-590-5pとSPRY2の間に推定される調節関係を支持していますが、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイの不在により、miR-590-5pとSPRY2 3′-UTR間の直接的な物理結合の決定的な確認は困難です。第三に、ベクリン-1およびLC3-IIの静的測定では、オートファゴソーム形成の増加と自己リソーム分解の障害を区別できません。したがって、今後の研究ではバフィロマイシンA1治療や蛍光レポーターアッセイの併用などのアプローチを用いてオートファジスフラックスを評価するべきです。今後の研究では、より広範なOA表現型マーカー(例:MMP13およびADAMTS5)、一次ヒト軟骨細胞、3D軟骨移植モデル、内側半月板の不安定化などの in vivo OAモデルも含め、miR-590-5pおよびSPRY2調節の長期的影響を評価する必要があります。

開示事項

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著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、広西中国医薬大学瑞康病院老年医学科に、本研究のために実験施設と技術的支援を提供してくれたことに感謝します。著者らはまた、データ収集と解析に協力してくれた研究室スタッフや同僚に感謝の意を表します。この研究は広西中医薬大学自然科学研究プロジェクト(助成金番号2022MS039)の支援を受けました。LncRNA-GAS5はマウス膝関節軟骨細胞におけるSPRY2発現を媒介し、オートファジーを阻害する:華雨曲石処方薬のメカニズム研究および早期介入効果)および中国国家自然科学基金(地域財団)(助成金番号82160912;Skp2のユビキチン化分解、FoxO1の降解、膝のOA軟骨細胞オートファジーの阻害、華雨曲石処方の早期介入効果に関するメカニズム議論)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Anti-β-actin抗体Proteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938ウェスタンブロット分析の内部ローディングコントロール
Anti-SPRY2抗体Proteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324SPRY2タンパク質発現の検出
BCAタンパク質アッセイキットThermo Fisher Scientific23225総タンパク質濃度の測定
C28/I2ヒト軟骨細胞株PunocelCP-H107変形性関節症研究用in vitro軟骨細胞モデル
完全DMEMKeyGen BiotecKGM12800S日常的な細胞培養用基礎培地
CWBIO超純miRNA抽出キットCWBIOCW0627S総RNAとmiRNAの分離
ECL検出システムThermo Fisher Scientific32106タンパク質バンドの化学発光による可視化
胎児ウシ血清 (FBS)Gibco1891605細胞培養増殖サプリメント
GraphPad Prismバージョン9.0GraphPad SoftwareN/A統計解析とグラフ生成
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01mRNAからcDNAへの逆転写
ImageJソフトウェア米国国立衛生研究所N/Aウェスタンブロットバンド強度の定量
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015プラスミドとオリゴヌクレオチドのトランスフェクション
miR-590-5pミミック、阻害剤、およびNCRiboBioカスタム合成miR-590-5p発現の調節
miRNA 1st ストランドcDNA合成キットVazymeMR101-02miRNAからcDNAへの逆転写
Opti-MEM培地Gibco31985-062トランスフェクション錯体の調製
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140122細胞培養における細菌汚染の防止
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルMedChemExpressHY-K0010抽出中のタンパク質の保護
PVDFメンブレンMillipore SigmaISEQ00010免疫ブロッティング用タンパク質転写メンブレン
組換えヒトIL-1βMedChemExpressHY-P78459OA様炎症条件の誘導
RIPAバッファーBeyotimeP0013B細胞溶解とタンパク質抽出
si-SPRY2コンストラクトとsi-NCGenePharmaカスタム合成SPRY2発現のノックダウン
SPRY2過剰発現プラスミド (OE) と空ベクター (NC)GeneChemカスタム構築SPRY2過剰発現効果の評価
UV-VIS分光光度計 (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000RNA濃度と純度の測定

参考文献

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233233C28 I2OAmiRNA 590 5pBeclin 1LC3IIBcl 2

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