分離ブロッコリーRNAレポーターを用いた in vitro RNAクラスターにおける分子間RNA塩基対の可視化および定量化

Summary

本プロトコルは、分割ブロッコリーRNAリポーターを用いた視覚的アッセイを用いて、in vitroでRNAクラスター内の分子間塩基対を検出・定量することを目的としています。

Abstract

多価分子間RNA–RNA相互作用によって駆動されるRNAクラスタリングは、タンパク質が存在しなくてもin vitro で起こることがあります。化学プローブや計算シミュレーションはこれらの相互作用を予測するために用いられていますが、RNAクラスター内の分子間塩基対を直接評価する方法は限られています。本研究は、目的の蛍光標識RNAに結合した分裂したブロッコリーRNAレポーターを用いた視覚的アッセイを提示します。このアッセイにより、RNAクラスター内の分子間塩基対の検出と定量が可能になります。分裂したブロッコリー系は、二量体化してブロッコリーRNAアプタマーを形成する補完的なリポーター配列を含みます。その結果得られた二量体化されたRNA構造は、結合時に緑色蛍光を発する蛍光体DFHBI-1Tと結合します。RNAクラスタリング時に緑色蛍光の出現は、関心のあるRNA間の補完的なリポーター配列によって媒介された塩基対を報告します。DFHBI-1T蛍光の測定により、 in vitro RNAクラスタリング条件がこれらのレポーター配列間の分子間塩基対にどのように影響するかを定量的に評価することが可能になります。

Introduction

in vitro で転写されたRNAは、塩や分子クラウディング試薬^{1、2、3、4、5}を加えることで目に見えるクラスターに自己組み立てることができます。特に、これらのRNAクラスターはタンパク質を含む他の細胞成分が存在しなくても形成されることがあり、特定の条件下では分子間RNA–RNA相互作用が vitroでのRNA凝縮を駆動するのに十分であることを示しています。

分子間RNA–RNA相互作用のさまざまなタイプの中で、分子間塩基対は凝^{縮液フィールド}1,2,4,6,7,8,9,10で大きな注目を集めています。これらの相互作用は、フィラメント菌Ashbya gossypii²におけるBNI1とSPA2 mRNAの共クラスタ化や、ショウジョウバエ・メラノガスターにおけるオスカーmRNAのオリゴマー化によって示されるように、転写本間の露出した相補配列(「郵便番号」)によって促進されます.あるいは、RNAの二次構造を再構築することで、構造的に埋め込まれている補完配列を露出させることで分子間塩基対を促進することもできます。このメカニズムは、サイリコ⁹のリピートRNAやvitro¹⁰のグアニジンリボスイッチで観察されています。露出した補完配列とRNA構造の再構築は、化学的プロービング^11,12またはシミュレーションアプローチ4,9,13,14を用いて測定可能です。しかし、in vitro RNAクラスタリングアッセイで分子間塩基対を直接可視化する方法は限られています。

塩基対抗架橋剤15,16,17およびゲル電気泳動^4,6,7を用いたRNAプルダウンアッセイは、in vitroで分子間RNA塩基対を研究するために一般的に用いられます。しかし、これらの手法はクラスタ内の塩基対を外部と区別する空間解像度を欠いています。さらに、下流解析のためにRNAクラスターを分離することは技術的に難しく、クラスタの安定性を維持しつつ、後続のアッセイとのバッファ互換性を確保する必要があります。

対象の蛍光標識RNAに結合した分裂したブロッコリーRNAレポ^ーター18 を用いた視覚アッセイは、in vitro⁴におけるRNA縮合中の分子間塩基対の直接検出に用いられてきました。この文脈で、分割ブロッコリーシステムは、定義された in vitro クラスタリング条件下でリポーター間またはそれを運ぶRNA間の分子間相互作用の可能性を報告します。したがって、このアッセイはRNAクラスター様環境下で、配列の文脈や環境要因がどのように分子間塩基対対の傾向に影響するかを探ります。

分裂したブロッコリーシステムは、 上部 と 下部の2つの補完的なRNA配列からなり、これらが二量体化してブロッコリーRNAアプタマーを再構成します(図1A–C)¹⁸。二量体化後、アプタマーはフルオロフォアDFHBI-1Tに結合し、緑色蛍光を生じさせます(図1A–C)¹⁸。このシステムを用いると、RNAクラスター内の報告者補完配列間の分子間塩基対の程度がRNAの折りたたみに依存することが示されました。異なる実験条件下でDFHBI-1T蛍光とRNAレベルの比率を比較することで、 in vitro 条件がRNAクラスター内のレポーター介在分子間塩基対に与える影響を定量的に評価できます。

このアッセイは、RNAクラスター内の分子間塩基対を研究するためのRNAプルダウンおよびゲル電気泳動の手法を補完します。しかし、堅牢なシグナル検出には分子の混み合い試薬が必要になることがあり、感度はブロッコリーの 上部 および 底部 RNAの二量体化および折りたたみ効率によって制限されます。

Protocol

このプロトコルは、このアッセイを実装するためのステップバイステップの方法を提供し、その応用について解説します。使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. in vitro RNA転写のためのDNAテンプレートの準備

1. 各DNAテンプレートの5′端に、分離したブロッコリーアプタマー配列を含むT7プロモーター配列を付加し、in vitro RNA転写を行います。分割されたブロッコリーアプタマー配列(上部 と 下部)単体を使用するか、T7プロモーターの下流の任意の位置に挿入しても、追加の興味のあるRNA配列の有無にかかわらず適用してください。
   注: T7プロモーター、分割ブロッコリーリポーター、DNAテンプレート増幅に用いられるプライマーの配列は 表1に記載されています。
   注: T7 RNAポリメラーゼは+1位置の「G」で転写を開始することを強く好みます。+2および+3位置に直下の追加のGが存在することで、転写収量¹⁹が増加します。しかし、下流の配列がGで始まる場合、例えば2つのGで始まる 上 および 下 の構成では、転写は異なる位置²⁰で開始されることがあります。その結果、転写本の5′端に1、2、または3G(例:GATCC、GGATCC、GGGATCC)が含まれることがあり、設計された構成要素における塩基対の解釈に影響を与えることがあります。
2. 市販の遺伝子ブロック、プラスミド、DNA断片をPCRのテンプレートとして使用してください。元のテンプレートにT7プロモーターが含まれていない場合は、5′のT7プロモーターオーバーハングを持つ前方プライマーと適切なリバースプライマーを使用してください。
3. 200μLのPCRチューブに50μLのPCR反応を準備し、その間に10μMの順方向および逆プライマーそれぞれ2.5μL、20 ngのDNAテンプレート、25 μL 2×高精度マスターミックス、ヌクレアーゼフリー水を含みます。ピペットで上下に混ぜ、2,000 × g で2秒間遠心分離機で混ぜます。
4. PCR反応を熱サイクラーで以下のプログラムで実行します:98°Cで30秒(1サイクル)、98°Cで10秒、最適化アニーリング温度で30秒、72°Cで30秒あたり30秒(35サイクル)で加熱しました。72°Cで2分間(1サイクル)。
   注: 最適なアニーリング温度を、Tm計算機などのオンラインツールで決定します。PCR製品は完成後、4°Cで保存することができます。
5. 2 μL PCR産物を8 μLのヌクレアーゼフリー水および2 μL 6×ローディング染料と混ぜます。混合物を1%アガロースゲルに乗せて電気泳動を行います。
   注: PCR産物は単一のバンドとして現れるべきです。複数のバンドが検出された場合は、適切なバンドを切除し、ゲル抽出キットで精製してから進行してください。
6. PCR産物またはゲル抽出DNAをDNA精製キットで精製し、20〜30μLのヌクレアーゼフリー水で1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに溶出します。
7. マイクロボリューム分光光度計を用いてDNA濃度と純度を測定します。A260/A280がおよそ1.8、A260/A230が2.0より大きいことを確認してください。
   注: A260/A230が2.0未満の場合は、追加の精製工程を行います。
8. 使用までDNAテンプレートは−20°Cで保存してください。

2. in vitro RNA転写反応の調製

1. 作業面、チューブラック、ピペットをRNase除染液で拭き取ってください。RNaseを含まないフィルター入りチップを使いましょう。
2. 解凍反応バッファーおよびヌクレオチド溶液(ATP、CTP、GTP、UTP)はT7転写キットに付属し、UTP-Cy5も氷上で使用されました。使用前にすべてのチューブを2,000 × g で2秒遠心分離してください。
   注: UTP-Cy5を光から守りましょう。
3. DNAテンプレート内のチミン塩基数(T7プロモーターを除く)を計算し、20μL転写反応に必要なUTPおよびUTP-Cy5の体積を決定します。RNA種間で一貫した標識密度を維持しましょう。
   注: 例えば、100塩基からなるRNAに約3つのCy5標識尿路酸を標識するには、1 mM UTP-Cy5 4.5 μLと75 mM UTP 1.9 μLを加えます。
4. ATP、CTP、GTPをそれぞれ2μL、UTPの計算体積(キットに付属)、UTP-Cy5、2μL 10×反応バッファー、2μL酵素混合物、200ng ng DNAテンプレート、ヌクレアーゼフリー水を組み合わせて、20μLの転写反応を準備します。ピペットで上下にピペットし、 2,000 × g で2秒間遠心分離機でよく混ぜます。
5. 反応を37°Cで6時間培養します。
6. キットに付属の1μLのDNaseを追加します。ピペットで上下にピペットでよく混ぜ、遠心分離機で2,000 ×g で2秒間加熱します。
7. さらに37°Cで15分間培養します。
8. 反応(~20 μL)を1.5 mLのチューブに移します。キットに付属する115μLのヌクレアーゼフリー水と15μLの酢酸アンモニウムストップ溶液を加えます。ピペットで上下にピペットでよく混ぜ、2,000 × g で遠心分離機で2秒間かけます。
   注: 市販のRNA精製キットがステップ 2.9から3.7の代わりに使用されることもあります。
9. フェノール/クロロホルム150μLを加え、優しく混ぜます。
   注意: フェノール/クロロホルムは化学換気フードで扱いましょう。
10. 遠心分離機で16,000 × g 、4°Cで10分間。
11. 上部水相を新しいチューブに移す。
    注: 間期を乱さないように注意し、下層は染料が混ざっていないため青く見えることがあります。
12. 同じ量のクロロホルムを加え、十分に混ぜます。
    注意: クロロホルムは化学換気フードで取り扱いましょう。
13. 遠心分離機は16,000 × gで4°Cで2分間加熱します。
14. ステップ2.11–2.13を繰り返します。
15. 水層(~100–150 μL)を新しいチューブに移します。イソプロパノール900μLを加え、十分に混ぜます。
16. 3つの等量の容器に分けて別々のチューブに入れます。
    注: 各アリコートは複数のRNAクラスタリング反応に十分です。
17. −20°Cで一晩または最大1か月間保存してください。

3. in vitro で転写されたRNAの精製

1. RNAサンプルを16,000 × g の4°Cで15分間遠心分離します。
2. RNAペレットを乱さずに慎重にイソプロパノールを除去してください。
3. ヌクレアーゼフリー水で調製した70%エタノール1mLを加えます。
4. 遠心分離機は 16,000 g× 4°Cで2分間加熱します。
5. エタノールを除去し、 ステップ3.3–3.4を繰り返します。
6. 最終エタノール洗浄時には、1000μLピペットを使ってほとんどのエタノールを除去します。2,000 × g でベンチトップのミニ遠心分離機で2秒間短時間遠心分離し、残ったエタノールは20 μLピペットで除去します。
7. RNAペレットを室温(RT)で1〜2分間自然乾燥させます。
8. RNAペレットを20μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁させます。サンプルは氷に保管し、光から守ってください。
9. マイクロボリューム分光光度計を用いてRNA濃度と純度を測定します。A260/A280がおよそ2.0、A260/A230が2.0以上であることを確認しましょう。

4. in vitro RNAクラスタリング反応の調製

注:このプロトコルでは、RNAクラスタリングの誘導にはスパーミンとPEG 8000が必要であり、これは^{以前の研究2,4,5}に基づいている。具体的には、ヌクレアーゼフリー水で調製した100 mMの精子塩素溶液を複数の1.5 mLマイクロ遠心分離機管に分割し、−20°Cで保存しました。

1. 100 mMの精液と50% PEG 8000を氷で溶かします。
   注: 開封後は、劣化の可能性があるため50%のPEG 8000は2か月以内に使用すべきです。
2. 500μLの新造10×RNAリフォールディングバッファーを調製するには、50μL 2M KCl、50μL 1M_MgCl2、50μL 1M Tris(pH 7.0)、および350μLのヌクレアーゼフリー水を組み合わせます。ピペットで上下にピペットしてよく混ぜます。ベンチトップのミニ遠心分離機で2秒の遠心分離機 × 2秒。
   注: リフォールディングバッファーはRNAクラスタリング実験当日に準備しておくべきです。
   注:ステップ4.3〜4.4は実験条件に依存し、必要に応じて調整可能です。本研究で用いられたRNAクラスタリングの2つの例を以下に示します。共折りたたみ条件は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをRNA²にアナールする手法から応用されています。この方法では、RNAを塩バッファー内で混合し、互補的な配列を持つRNA間の分子間塩基対合を促進するために加熱します。対照的に、別々の折りたたみ条件では、各RNAを個別に折りたたんでから混合します。この条件は、RNAが相互作用する前に折りたたまれる細胞のシナリオを近似することを意図しています。
3. 共折りたたみ
   注: この条件は 、上 位配列と 下 位配列を含むRNA間の分子間塩基対を促進します。RNAクラスタリング条件下で、レポーター駆動の分子間塩基対の正の対照として機能します。
   1. 200μLのPCRチューブで、上配列または下配列を持つin vitro転写RNAそれぞれ16pmol、10μL×折りたたみRNAバッファー2μL、ヌクレアーゼフリー水を最終体積14μLに混ぜます。ピペッティングで上下に十分に混合します。2,000 g× 遠心分離機を2秒間、ベンチトップのミニ遠心分離機で操作します。
      注: 16 pmolに対応するRNA質量を計算するために。
   2. RNAサンプルを90°Cで2分間加熱します。
   3. すぐにサンプルをRTに移し、光から守ってください。反応をRTで1時間培養します。
4. 別々の折りたたみ
   1. RNAサンプルを90°Cで2分間加熱し、その後すぐに氷に冷やして少なくとも15分間保存します。
   2. 200μLのPCRチューブ内に、トップまたはボトム配列を持つin vitro転写RNA16pmol、10×折りたたみRNAバッファー1μL、ヌクレアーゼフリー水を組み合わせて最終体積7μLにします。
      注: 16 pmolに対応するRNA質量を計算するために。
   3. 反応をRTで30分間、光から守って孵育させます。
   4. 上部と下部のRNAサンプルを1本のPCRチューブに結合します。ピペットで上下にピペットしてよく混ぜます。2,000 g× 遠心分離機を2秒間、ベンチトップのミニ遠心分離機で操作します。RTで30分間孵化させます。
5. 100 mMの精子と50%PEG 8000の1:2(v/v)プレミックスを6 μL加えます。ピペットで上下にピペットしてよく混ぜます。ベンチトップのミニ遠心分離機で2秒間、2,000g × 遠心分離機。
   注: 50%のPEG 8000は非常に粘度が高いです。ピペットはゆっくり慎重に使いましょう。
6. 反応に1 mM DFHBI-1Tを2 μL加えます。ピペットで上下にピペットしてよく混ぜます。ベンチトップのミニ遠心分離機で2秒間、2,000g × 遠心分離機。反応は黄緑色に見えるはずです。
   注: 1 mgのDFHBI-1T(MW: 320.21)凍乾染料から20 mM DFHBI-1Tストック溶液を製製するには、分子生物学グレードの無水DMSOを156 μL加えます。ストックを少量ずつ複数のマイクロ遠心分離機管に分割し、-20°Cで保存します。 染料の冷凍解凍の繰り返しは避けてください。新たに希釈した1 mM DFHBI-1Tの作動溶液を、20 mMのストックをヌクレアーゼフリーの水で希釈し、氷上に保存して準備します。
7. 反応をガラスチャンバー付きのカバーグラスに詰めます。
8. 蒸発を最小限に抑えるために、カバーをつけたまま暗闇で4時間培養します。

5. 画像診断の準備

1. 適切なレーザーと対物レンズを備えた構造化照明顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて三次元画像を取得します。
   注: ピントの合わない光を最小限に抑えるためには、共焦点顕微鏡検査が必要です。
2. 各注目領域(ROI)を各z平面でまずCy5チャネルで撮像し、その後GFPチャネルで同じROIを撮像するように顕微鏡を設定します。
3. 全チャンネルの露光時間を500msに設定してください。GFPはレーザー出力を80%、Cy5は40%に設定してください。
4. RTの反応液滴外側のカバースリップ領域を、zステップサイズ150nmでイメージしてください。

6. 分子間塩基対の定量化

1. 画像を画像解析ソフトにインポートする²¹.GFP(DFHBI-1T)およびCy5(RNA)チャネルを特定します。
2. RNAクラスター内で5ピクセル×5ピクセルのROIを描き、同じz平面上で両チャネルの積分密度を測定します。各画像で異なるRNAクラスターから5〜8個のROIを選択します。
   注: カメラのセットアップに応じてROIのサイズを調整しつつ、実験ごとに一貫性を保つことが大切です。
3. バックグラウンド測定のために反応液滴外の5〜8個のROIを選択し、両チャネルの平均積分密度を計算します。
4. 各ROIの正規化DFHBI-1T強度を以下を用いて計算します:
   

7. よくある問題とトラブルシューティング

1. 遠心分離後にRNAペレットが検出されない場合は、RNA分解、転写時間不足、不活性ポリメラーゼ、残留塩、または低RNA濃度を考慮します。RNaseフリー試薬を使用し、転写時間を延長し、新鮮な酵素を使用し、テンプレートを精製します。
2. Cy5標識されたRNAクラスターが観察されない場合は、RNA分解やPEG 8000、UTP-Cy5の分解を考慮してください。新鮮な試薬とRNaseフリーの条件を使いましょう。
3. 共折りたたみ条件下でDFHBI-1Tシグナルが観察されない場合は、色素の質が悪く、ブロッコリー構造形成が欠如している、または転写産物が切断されていると考えられます。新しい染料を使用し、適切なバッファー組成を確認し、転写本のサイズをゲル分析で確認してください。
4. 蛍光信号が漂白する場合は、レーザー出力と露光時間を減らし、画像処理を最小限にし、培養中のサンプルを光から守ります。

Results

この実証実験では、上部および下部RNAレポーター単独で塩基対を形成しブロッコリー構造を形成する能力が、先に述べたin vitro RNAクラスタリングプロトコル⁴を用いて初めて評価されました。上下の塩基対により、2つのブロッコリーアームが生成され、それぞれ1つのDFHBI-1T分子を挿入できます(図1A–C)^18,22。

RNAが精精とPEG 8000でクラスタリングを誘導すると、両方のRNAは個別または一緒にクラスターを形成しました(図1D–Eii)。 上部 または 下 部RNAを単独で調べたところ、RNAクラスター内のDFHBI-1T蛍光は、熱変性と再折り返しの前に2つのRNAが結合された共折りたたみ状態よりも大幅に低かった(図1F)。共折りたたみ条件下では、DFHBI-1T(0.1 mM)と 上 (0.8 μM)および 下( 0.8 μM)のモル比は125:1:1と推定されました。これは、潜在的なブロッコリー構造の最大数に対してDFHBI-1Tが約62.5倍過剰に相当します。

上下単独で観察された低くゼロではないDFHBI-1Tシグナルは、各レポーターが個別に発現した場合にDFHBI-1T蛍光が最小であることを示す過去の報告と^{一致しています。}また、RNAがない場合でも非常に低いが検出可能な背景蛍光を示しました(図1F)。これらの結果を総合すると、DFHBI-1Tはin vitro RNAクラスタリングアッセイと適合し、共折り合いがトップとボトムRNA間の分子間塩基対を強化することを示しています。

RNA強度への正規化後、共折りたたみ条件下の正規化されたDFHBI-1T蛍光強度は1.03に達し、これは上下単独の水準(それぞれ0.054および0.023)を有意に高くした(図1D、図1Ei、図1F)。クラスタリング前に別々に折りたたまれた上部と下部RNAを混合して形成されたRNAクラスターを調査しました(図1D、図1Eii、図1F)。この別折りたたみ条件下では、正規化されたDFHBI-1T信号は0.031であり、負の対照群(上または下)で観察された基準レベルと同等でした(図1F)。これらの結果は、コフォールディングがトップとボトムRNA間の分子間塩基対を促進する一方、分離フォールディングはそのような相互作用を制限することを示しています。

次に、上部および下部配列は、生殖顆粒mRNA^であるショウジョウバエメラノガスター閉鎖(shu)の3′未翻訳領域(UTR)およびそのアンチセンス対応物(shu^anti)に挿入されました。シュウ3′ UTRが選ばれたのは、これまでの研究でこのRNAが主にショウジョウバエのメラノガスターにおいてモノマーとして存在し、RNAゲル^アッセイ^4,24では高モル濃度でも二量体化しないことが示されたためです。さらに、シュウ・トップおよびシュ・ボトムはRNAゲル4でホモダイマーを形成^せず、トップとボトムの分子間相互作用やシュウから派生したフランディング配列の影響をより直接的に評価することが可能です。
シュウトップ、シュウボトム、シュアン^チトップ、シュアン^チボトムのDNAテンプレートは表2に記載されています。上部および下部配列はシュウまたはシュアン^チ3′UTRの中央に挿入され、相互作用を促進し、通常は相互作用領域が転写本内に埋め込まれる生理学的RNA–RNA相互作用をよりよく模倣するために構造的再編成が必要でした^。

RNAクラスタリングを誘導すると、シュウトップ、シュウボトム、シュアン^チトップ、シュアン^チボトムはそれぞれトップとボトムと同様の最小限のDFHBI-1T蛍光を示しました(図2Aおよび図2B)。一貫して、シュウトップとシュウボトムの共折り、またはシュアン^チトップとシュアン^チボトムのアンチボトムは、個別のフォールディングよりも高いDFHBI-1T信号を生み出しました(図2CiおよびCii)。RNA強度への正規化と陰性対照(各RNA単独の平均正規化されたDFHBI-1Tシグナルと定義)を行った後、シュウトップとシュウボトムの共折り合わせにより、正規化されたDFHBI-1T蛍光が5.63倍増加しました(図2Diおよび2Dii)。一方、個別の折りたたみは1.04倍の増加にとどまり、個別にシュウトップとシュウボトムで観察された基準値と同等でした。同様の傾向は、共折りと別々の折りたたみ条件下でシュアン^チトップおよびシュアン^チボトムの両方で観察されました(図2Diおよび2Dii)。これらの結果は、分離折りたたみはシュウトップとシュウボトム、またはシュアン^チトップと^{シュアンチ}ボトム間の分子間塩基対を促進しず、共フォールディングはこれらの相互作用を促進することを示しています。これは挿入されたレポーター配列によると考えられます。

シュとシュ^アンチが塩基対になるかどうかをテストするために、シュトップとシュアン^チボトムを、シュアン^チトップをシュボトムと混ぜました。両組み合わせは、共折りたたみおよび分離折りたたみ条件下で、シュウトップとシュウボトムまたはシュアン^チトップとシュアン^チボトムと比べて高いDFHBI-1T蛍光を示しました(図2Ciおよび2Cii)。正規化後、シュウトップとシュアン^チボトム、シュアンチトップとシュウボトムの共折り合わせにより、DFHBI-1T蛍光はそれぞれ61.86倍と82.60倍増加しました(図2Diおよび2Dii)。一方、個別の折り返しはそれぞれ2.69倍と4.94倍の増加しか得られませんでした(図2Diおよび2Dii)。共折りたたみ条件下よりは大幅に低かったものの、これらの値はシュウトップとシュウボトム、またはシュアン^チトップとシュアン^チボトムで観察された値(それぞれ1.04と1.16)より高くなっています。

これらの結果を総合すると、追加の補完配列を持つレポーターは、そうした配列を持たない者よりも塩基対の能力が高いことが示されています。この効果は、共折りたたみ条件の下でさらに強化され、分子間相互作用を促進します。

図1:in vitro RNAクラスターにおけるトップおよびボトムRNAの予測される二次構造および分子間塩基対の定量化。 (A–B)RNAfold²⁵で予測されるように、上部(A)と下部(B)の二次構造が個別に折りたたまれた例。別々に折りたたむと、上下はブロッコリーアプタマーを再構成せず、DFHBI-1T(灰色星)はほとんど蛍光を発生しません。 (C) RNAcofold²⁵によって予測される塩基対のトップおよびボトムRNAの二次構造の例。2つのRNA間の分子間塩基対により2つのブロッコリーアーム¹⁸が再構成され、DFHBI-1T結合が可能となり、強い緑色蛍光(緑色の星)が得られます。 (D) DFHBI-1T単独(染料のみ対照)およびDFHBI-1Tの存在下で上下RNAによって形成されたin vitro RNAクラスター(マゼンタ)の画像(緑色)。 (Ei, ii) DFHBI-1T(緑)が存在する下で、上および下のRNAが共折りたたみ(i)および別々の折りたたみ(ii)条件下で形成されるin vitro RNAクラスター(マゼンタ)。パネルDおよびEでは、RNAにCy5が標識されており、平均して約3分の1のRNAに単一のCy5標識ウラシルが含まれ、残りの3分の2は標識されていない状態です。画像は、150 nmのステップサイズで取得された27枚のスライスの平均Z射影を表し、すべての条件下で同じ露光とレーザー出力を各チャネルに用いています。DFHBI-1T蛍光は、条件ごとに同じ強度範囲に正規化されました。スケールバー:2μm(F)のDFHBI-1T強度は、Cy5蛍光で測定されたRNA量に正規化されました。データはSEM±平均として提示されています。両側t検定(****対共折り)のP値は、染料のみ×1.0 × 10⁻²²、上半²² 2.3、下×4.9 10⁻²³、7.0 × 10⁻²³(別々の折りたたみ)です。n = 染色素のみ状態では30領域、その他の条件では30〜31のRNAクラスターがあります。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:シュウおよび^シュウ抗保有型トップおよびボトムのレポーターにおける分子間塩基対の代表画像および定量化。 (A) DFHBI-1T単独(染料のみ対照)およびDFHBI-1Tが存在する下で、shu-top、shu-bottom、^{shu anti-top}、shu anti-bottom RNAによって形成されたin vitro RNAクラスター(マゼンタ)の画像(緑色)。RNAはCy5で標識され、in vitro転写中に平均して3つのUTP-Cy5ウラシルが組み込まれました。画像は、150 nmのステップサイズで取得された27枚のスライスの平均Z射影を表し、すべての条件下で同じ露光とレーザー出力を各チャネルに用いています。DFHBI-1T蛍光は、条件ごとに同じ強度範囲に正規化されました。スケールバー:2 μm(B)のDFHBI-1T強度はCy5蛍光で測定されたRNA存在量に正規化されました。データはSEM±平均で示されており、有意ではありません。二側t検定のP値(染料のみと比べて):3.1 × 10⁻³(**;シュウトップ)、1.7×10^⁻1(新暦;シュウボトム)、2.9×10⁻³⁵(***; シュウ^アンチトップ)、および2.2×10⁻²(;シュウ^・アンチボトム。n = 染料のみの状態では30領域、その他の条件では30〜32のRNAクラスターがあります。 (Ci, ii) DFHBI-1T(緑)を共折り(i)および分離折りたたみの下で、シュウトップとシュウボトム、シュアンチトップとシュアン^チボトム、シュアン^チトップとシュウボトムを混ぜて形成したin vitro RNAクラスター(マゼンタ)の画像(ii) 条件。画像は、150 nmのステップサイズで取得された27枚のスライスの平均Z射影を表し、すべての条件下で同じ露光とレーザー出力を各チャネルに用いています。低域では、DFHBI-1T蛍光が図1D–Eiiおよび図2Aと同じ強度範囲に正規化されました。高範囲では、DFHBI-1T蛍光はパネルCiおよびCiiのすべての条件下でより高いが一貫した強度範囲に正規化されました。スケールバー:2 μm(Di, ii)DFHBI-1T強度は、まずRNA強度に正規化され、その後陰性コントロール(各RNA単独の平均正規化されたDFHBI-1Tシグナル)に正規化されました。データはSEM±平均で示されており、有意ではありません。(i) 二尾t検定(**** vshu-top + shu-bottom)のP値:1.1 × 10⁻³¹(シュアン^チトップ + ^{シュアンチ}ボトム)、1.1 × 10⁻²²(シュウトップ+^{シュアンチ}ボトム)、4.3 × 10⁻²⁷(シュ^アンチトップ+シュウボトム)。(ii) 二尾t検定のP値(対shu-top+shu-bottom):2.2 ×10⁻¹(n.s.;シュアン^チトップ + シュアン^チボトム)、1.9 × 10⁻⁹(;シュウトップ+シュアン^チボトム)、そして1.3×10⁻¹⁵(;シュアン^チトップ+シュボトム)。n = 29–32個のRNAクラスターがすべての条件下で存在します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

名称	シーケンス(5′-3′)
T7プロモーター	タータックガクトカクタグ
トップ	ガットガグク CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGGGGGG
底	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
トップT7フォワード	タータックガクトカクタグ ガットガ
トップリバース	ATCCGCATCATCTGGACCC
ボトムT7フォワード	タータックガクトカクタグG GATCCGCATCATCTGTCGA
ボトムリバース	GGATGATGGAGCCACACT(ガートガットガッカカクト)
前方プライマーにはT7プロモーター配列のオーバーハング(太字)があり、その後にRNAの5′端を標的とした配列が続きます。

表1:T7プロモーター、分裂ブロッコリーレポーター、およびT7転写用DNAテンプレート増幅に用いられたプライマーの配列。 これらのプライマーは、上部および下部RNAのin vitro転写のためのDNAテンプレートの生成に用いられ、その後、本研究で述べたRNAクラスタリングアッセイに用いられました。

名称	シーケンス(5′-3′)
シュウトップ	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTATTATTATTTACTACCAAAAAGGATGAGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGAGGGGGGGGTCCAGAGATGGGGGG tcagagatgggga TAAAAAACATACCAAACATGAATTTAGTTCCAAGTTCTAGTAGGAAGCAGTATCATTT AGTTATTTCGATATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAACCAATAAAAGTAATGCGGACCTACTACAT
シュウボトム	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTATTTCATATCTTACTCAAAAAGGATCCGCATCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTGCATGTGTGTGTGTGTGTCAACCACACTCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCAAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTAGAGAGCAGTATCATTAGTTATTTCGATTAGTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTTTAGTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTTTTAA AAACCAATAAAAGTAATGCAGGCACTACATAT
蜀のアンチトップ	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTATTGTGGTTTTATAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTACCTTCATGTTTTTTTGTGTGTATGTTTTTGGA TGATGGAGAGGGTGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGAGAGGGTGTCCAGAGATGATG GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATGAATGAATGGGGGGTTTTTAGTAAGC
蜀反底	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTATTATTGTGGTTTTATAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTaattaccttcatgtatttt GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTGCTGCCATGTGTGTGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCTCTTTTTGAGTAA GATATGAATATGAATACTGGGGGGCTTTTTAGTAAGC
シュウトップまたはシュウボトムT7フォワード	タータックガクトカクタグGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
シュウトップかシュボトムか裏面	ATGTAGCTGCCGTGTGTGTATTAC
シュアンチトップまたはシュアンチボトムT7フォワード	タータックガクトカクタグGGATGTAGCTGCCGTGTGTGTCATTA
シュアンチトップかシュアンチボトムか裏面	GCTTACTAAGAAGCCCCACCAGTA
前方プライマーにはT7プロモーター配列のオーバーハング(太字)があり、その後にRNAの5′端を標的とした配列が続きます。T7プロモーターとシュウトップおよびシュウボトム、またはシュアンチトップとシュアンチボトムの間に1つまたは2つの追加のGが含まれていました。これは、Gが+2および+3の位置にあることで転写収率を大幅に増加させるためです。しかし、これらの追加のGは設計された構成要素における塩基対の解釈に影響を与える可能性があります。ステップ1.1の注記を参照してください。

表2:T7転写のためのDNAテンプレート増幅に用いられたシュウトップ、シュウボトム、シュアン^チトップ、シュアン^チボトム、およびプライマーの配列。これらのプライマーは、トップおよびボトムレポーターを持つシュウおよび^シュウ抗RNAのin vitro転写用DNAテンプレートの作成に用いられ、本研究で記述されたRNAクラスタリングアッセイに使用されました。

Discussion

本研究では、分離したブロッコリーアプタマー系¹⁸を、in vitro RNAクラスタリング条件下での分子間塩基対の直接的な可視化と定量に応用しました。このアプローチにより、異なるin vitro条件下での分子間塩基対の評価が可能となり、塩基対交差剤^15,16,17やゲル電気泳動^4,6,7を用いたRNAプルダウン実験などの下流の生化学的アッセイを補完します.これらの生化学的手法は、RNAクラスター内の塩基対を外部で起こる塩基対を空間的に区別できないのに対し、このアプローチはクラスター内の相互作用を直接空間的に可視化することを可能にします。具体的には、定義されたRNAクラスタリング条件下で、トップとボトムRNA、すなわちこれらのリポーターを持つRNAの塩基対を監視することを可能にします。さらに、架橋やRNA抽出を必要とせずに、リポーターRNA間の塩基対をリアルタイムで定量的に読み出しできるため、サンプル損失やバッファー不適合性を最小限に抑えます。

蛍光顕微鏡を用いて、分裂したブロッコリーアプタマー配列間の分子間塩基対をDFHBI-1Tシグナルを通じて定量的に測定し、in vitro RNAクラスタリングプロトコルとの適合性を示しました。分子間塩基対の程度はRNAの折りたたみ条件によって異なり、共折りと別々の折りたたみ条件で観察されました(図1F および 図2Di–2Dii)。これらの発見は、RNAフォールディング条件が分子間RNA相互作用に重要な影響を与えることを示しており、実験結果の解釈時に慎重に考慮すべきです。

このアッセイはまた、上位および下部レポーターの両側にある配列が分子間塩基対を促進するかどうかを評価するプラットフォームを提供し、SHUを用いて示されています。DFHBI-1T蛍光は、シュウトップとシュアン^チボトム、シュアンチトップとシュウボトムの方が、シュウトップとシュウアンチボトム、またはシュアンチトップとシュアン^チボトムの方が高く、シュウとシュ^{アンチボト}ムの分子間相互作用が存在していることを示していますブロッコリー信号をさらに強化します。これらの観察は、上位と下部のレポーターの共折りたたみだけで得られるDFHBI-1T蛍光シグナルはアッセイの上限を代表しないことを示唆しています。

これらの実験で測定されたDFHBI-1T蛍光は、1.04倍の増加( 別々の折りたたみ下でのシュウトップと シュウボト ム)から82.60倍の増加(共フォールディング条件下でのシュ^アンチトップ と シュウボトム )まで幅広く広がりました。このダイナミックレンジにより、これらのリポーターを持つRNA間の分子間RNA相互作用の違いを検出することが可能になります。

このプロトコルのいくつかのステップは、RNAクラスター内の分裂したブロッコリー のトップ および ボト ムRNA間の分子間RNA塩基対を成功裏に検出するために重要です。PEG 8000の新鮮なアリコートを使用して確実にRNAクラスタリングを誘導し、試薬の不安定性のため繰り返しの凍結・融解サイクルを最小限に抑えるべきです。DFHBI-1Tは蛍光特性を保つために−20°Cで分割して保存する必要があります。in vitro 転写産物はクラスタリング前に変性RNAゲル上で分析し、正しい転写本サイズを確認する必要があります。さらに、RNA滴は画像撮影前に室温で長時間培養されるため、RNaseフリーの状態、清潔な作業環境やイメージングチャンバーの維持が不可欠です。

このアッセイの制約の一つは、DFHBI-1Tがトップ配列とボトム配列による分子間塩基対を特異的に報告していることです。異なるRNA領域で起こる他の分子間塩基対の事象は検出できません。さらに、上部と底部の鎖の塩基対によって形成されるブロッコリー構造は熱力学^{的に安定しており}、ショウジョウバエの胚粒mRNAクラスターで観察されるような、散在した表面露出塩基による弱いまたは一時的な相互作用を完全には反映しない^{場合があります。}

さらに、分子間RNA–RNA相互作用は多発的かつ非特異的であり、上位および下位レポーターの両側にある配列がDFHBI-1T蛍光に影響を与える可能性があります。これらの側面領域はリポーター配列と直接相互作用し、ブロッコリー形成を阻害したりRNA構造を変化させたりして、リポーターを運ぶRNA間の相互作用に影響を与える可能性があります。したがって、このアッセイはRNA構造、上下塩基対、両側配列間の相互作用、そして両側配列とリポーター間の相互作用の複合的な効果を反映しています。

このアッセイは将来の調査の機会を提供します。例えば、リポーター側のRNA配列を改変したり、RNAヘリカーゼやシャペロンを導入したり、塩分条件を修飾したりすることで、RNAクラスター内の分子間塩基対に影響を与えることがあります。これらの効果は、共折り合い条件と別々の折りたたみ条件下でDFHBI-1T信号を測定することで評価できます。類似のRNAアプタマーが細胞、細菌、酵母26,27,28,29,30で用いられていることから、このアプローチはセルロ系やモデル生物においても拡張され、mRNAクラスター内の分子間塩基対を調査することができる。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	ミリポール・シグマ	M1028	10×の準備に使用されます。RNAリフォールディングバッファー。
2M KCl	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	AM9640G	10×の準備に使用されます。RNAリフォールディングバッファー。
50% PEG 8000	NEB	M0204S	T4 RNAリガーゼキットの構成要素;分子混み試薬としてRNAクラスタリングを誘導するために使用されます。
絶対エタノール、200プルーフ	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	T038181000CS	RNAウォッシュバッファーの調製に使用されます。
酸性フェノール:クロロホルム、pH 4.5(IAA付き、125:24:1)	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	AM9722	RNA精製に使われます。
アミノアリル-UTP-Cy5	イェナ・バイオサイエンス	NU-821-CY5	in vitro転写中のRNA標識に使用されます。
チャンバー付きカバーガラス	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	155409PK	RNAクラスタリング反応のためのイメージングチャンバー。
クロロホルム	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	C298-500	RNA精製に使われます。
DFHBI-1T	ルセルナ	410	ブロッコリーRNAアプタマー検出のための蛍光団として使用されました。
DMSO	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	D12345	無水;分子生物学のグレード;DFHBI-1Tの調製に使用され、
DNAクリーン&コンセントレーターキット	ザイモ	D4014	T7転写前のDNA産物のクリーンアップに使用されます。
DNAゲル抽出キット	NEB	T1020L	ジェル抽出に使われます。
ドライバス	ベンチマーク・サイエンティフィック	BSH1001	マイクロ遠心分離管内でRNAサンプルを加熱するために使用されます。
フィジー/イメージJ	国立衛生研究所(NIH)	該当なし	オープンソース画像解析ソフトウェア、蛍光強度の定量化およびROI解析に使用されます。
ゲル電気泳動システムおよびnbsp;	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	B2-BP	DNAゲル電気泳動の実施に使用されます。
ジェルローディング染料、紫色(6回以上)	NEB	B7024S	DNAゲル電気泳動のローディング染料として使用されます。
即時構造化照明顕微鏡	VisiTechインターナショナル	VT-iSIM	GFPおよびCy5蛍光を撮像できる共焦点顕微鏡。
イソプロパノール	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	327272500	RNA精製に使われます。
MEGAscript T7 文字起こしキット	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	AM1334	in vitro T7転写に使用されます。キットにはヌクレオチド溶液(ATP、CTP、GTP、UTP)およびDNaseが含まれています。
マイクロ遠心分離機チューブ	ジェネシー・サイエンティフィック	22-284	1.5mLチューブ;in vitro転写、RNA産物、スペルミンおよびDFHBI-1T のアリコット用DNAテンプレートの保存に使用されます。
ミニ遠心分離機	ベンチマーク・サイエンティフィック	Z763845	短時間の遠心分離に使われます。
ナノドロップワン分光光度計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	13-400-518	DNAおよびRNAの濃度と品質を測定するためのマイクロボリューム分光光度計。
ヌクレアーゼフリーの水とnbsp;	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	AM9937	RNAペレットの再懸濁、RNAウォッシュおよびリフォールディングバッファーの調製、およびスパーミンおよびDFHBI-1Tの希釈に使用されます。
オンラインモル質量計算機	ニューイングランド・バイオラボ(NEB)	該当なし	モル数からRNA質量を計算するためのオンラインツール(例:pmol)。
ポリプロピレンPCRチューブ	コーニング	3745	200 & mu;PCR、in vitro転写、RNAクラスタリング反応に用いられるL型PCRチューブ
パワーパック基本電源	バイオラッド	1645050	DNAゲル電気泳動の実施に使用されます。
Proflex PCRサーマルサイクラー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	44-840-73	PCR、in vitro転写、PCRチューブ内でのRNAサンプル加熱に使用されます。
Q5 ハイフィデリティ2×マスターミックス	NEB	M0492S	2×として使用されました。ハイファイ・マスターミックス。
冷蔵遠心分離機およびnbsp;	エッペンドルフ	5424R	RNA精製およびペレット化に使用される。
RNase除染溶液	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	AM9782	RNase汚染を最小限に抑えるために、実験台や表面の清掃に使用されます。
スパーマイン テトラ塩酸塩	シグマ・オルドリッチ	S1141-1G	RNAクラスタリングを誘導するために使われます。
トリス・ベース	ミリポール・シグマ	T1503-1KG	トリスバッファー(pH 7.0)の調製に使用されます。
超純粋なアガロース	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック	16500500	DNAゲル電気泳動に使用されます。