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研究記事

オリーブオイル系脂質エマルジョンは、NF-κB/NLRP3/IL-1β経路の阻害を通じて免疫チェックポイント阻害剤誘発性心筋炎を緩和します

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DOI：

10.3791/70887

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2026年6月2日

 ,  , 
1Department of Oncology, Guangzhou Fuda Cancer Hospital, 2Department of Oncology, Guangzhou Geriatric Hospital

この記事について

サマリー

オリーブオイル系脂質エマルジョンは、NF-κB/NLRP3/IL-1β経路を標的とすることで免疫チェックポイント阻害剤誘発性心筋炎を軽減し、炎症性カスケードを抑制する可能性を示しています。これらの発見は、免疫関連心疾患に対する補助療法としての可能性を示しています。

要約

本研究は、イピリムマブ(IPI)およびニボルマブ(NIVO)によって引き起こされる免疫チェックポイント阻害剤(ICI)誘発性心筋炎を軽減するオリーブオイル系脂質乳化(OOLE)の治療効果および基礎メカニズムを調査することを目的としました。炎症性心筋細胞の in vitro モデルは、ICI処理マウスから単離したCD4⁺/CD8⁺ T細胞とHL-1細胞を共培養することで確立されました。細胞は10% OOLE処理を行い、その後アポトーシスのためのフローサイトメトリー、サイトカインプロファイリングのためのELISA(TNF-α、IL-1β、IL-6)、および経路解析のためのウェスタンブロット/qPCR(NF-κB、NLRP3、IL-1β)を行った。 生体内では、マウスにIPI/NIVO投与によって心筋炎が誘発されました。心エコー検査で心機能が評価され、血清および心筋組織で炎症マーカーが評価されました。結果は、OOLEがHL-1細胞におけるT細胞誘発性アポトーシスを有意に減少させ、炎症性サイトカイン産生を抑制し、NF-κB、NLRP3、IL-1βの発現がダウンレギュレーションされていることを示しました。 in vivo.では、OOLEは左心室機能パラメータを改善し、全身炎症を軽減しました。分子解析により、これらの保護効果はNF-κB/NLRP3/IL-1βシグナル伝達軸の阻害を介して媒介されることが確認されました。結論として、OOLEはNF-κB/NLRP3/IL-1β経路を標的とすることで急性ICI誘発性心筋炎を緩和し、初期の炎症カスケードを抑制し迅速な心臓保護を提供する可能性を示しています。これらの発見は、免疫関連心疾患に対する補助療法としての可能性を示しています。

概要

プログラム細胞死1(PD-1)や細胞毒性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)を標的とする免疫チェックポイント阻害剤(ICI)は、さまざまな悪性腫瘍の治療の風景を一変させました。しかし、ICIsの広範な臨床応用は、しばしば免疫関連の有害事象(irAE)によって複雑化します。これらの中でも、ICI誘発性心筋炎は稀であり、臨床経過が急激で死亡率が25%から50%に及ぶ高い死亡率を特徴とする、まれながら致命的な合併症です1,2。その重症度にもかかわらず、ICI誘発性心筋炎に対する現在の治療選択肢は主に高用量コルチコステロイドおよび非特異的免疫抑制剤に限られています3,4。これらの従来の介入はしばしば最適でない反応を生み出し、ICIs1の抗腫瘍効果を損なう可能性があり、全身免疫抑制なしに心臓炎症を軽減できるより安全で標的を絞った心臓保護戦略の模索において重要な知識の空白を生み出します。

NF-κBシグナル伝達経路を通じて活性化されるNOD様受容体タンパク質3(NLRP3)インフラマソームは、ICI誘発性心筋炎5,6で観察されるサイトカイン嵐の中心的なドライバーとして浮上しています。特にIL-1βおよびIL-6などの炎症性サイトカインの過剰産生は、重度の心筋細胞損傷や心不全を引き起こします7。心血管疾患におけるいくつかの脂質ベースの介入が検討されていますが、この特定の文脈におけるオリーブオイル系脂質乳化(OOLE)の可能性はまだ未だに探求されていません。OOLEはオレイン酸を豊富に含み、膜の流動性を調整し炎症カスケードを抑制する独特の能力で知られる一価不飽和脂肪酸です8,9。しかし、OOLEがICI誘発性心筋炎に特徴的な過炎症状態を特異的に改善できるかどうかはまだ確立されていません。

本研究では、OLEの治療可能性を調査することでこのギャップを埋めることを目指します。我々は、OOLEがNF-κB/NLRP3/IL-1βのシグナル伝達軸を阻害することで強力な心臓保護効果を発揮し、炎症の急増を抑制し心臓機能を維持すると仮説を立てます。HL-1心筋細胞とT細胞の in vitro 共培養モデルとin vivo 。ICI誘発性心筋炎のマウスモデルを組み合わせることで、OOLE介入が迅速な機能回復をもたらし、心筋損傷を軽減することを示しました。本研究は、ICI関連心毒性管理における新規かつ標的的を絞った栄養薬理学的アプローチとしてのOOLEの初の証拠を提供します。

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プロトコル

すべての手技は広州マイルズバイオテクノロジー有限公司動物倫理委員会の承認を受けており、承認番号はIACUC-MIS2023076です。その会社は動物実験センターであり、動物実験はここで行われており、センターの倫理委員会による審査の対象となります。

動物と実験設計
30匹のBALB/cマウス(オス、生後8週、体重22 ± 2g)が商業的に購入されました。モデル導入および検証基準:免疫チェックポイント阻害薬(ICI)誘発性心筋炎モデルを、イピリムマブ(5 mg/kg)およびニボルマブ(10 mg/kg)を2週間連続で静脈注射することで確立されました。投与は3日ごとに行われ、モデル化期間は合計2週間でした。このプロトコルはこれまでに有意な免疫介在心損傷を誘発することが示されています10。最終注射から24時間後、後眼窩神経叢を通じて血液サンプルを採取し、300 x g で4°Cで15分間遠心分離して血清を分離しました。その後、血清cTnTレベルを特定のELISAキットを用いて定量化し、サンプルローディング、HRP結合抗体インキュベーション、自動洗浄、TMBクロモゲン反応の連続ステップを含み、4パラメータロジスティック曲線に基づく濃度を450 nmで測定し、cTnT濃度≥10 ng/mLは成功したモデル確立とみなされました。

体重とcTnT濃度が最も近い6つのモデルマウスを無作為に2つのグループに分けました:対照群と処理群(両者ともn=3、生物学的複製)。対照群は毎日5 mL/kgの正常生理食塩水静脈注射を受けました。治療群は、尾部静脈を通じて5 mL/kgの5%オリーブオイル系脂質乳化液(OOLE)を毎日静脈内注射を受けました(これは当院の臨床治療用量であり、マウス用には体表面積比を基に外推されています)。以下の検査が6日間の観察期間に実施されました。心臓機能は、ベースライン(0日目)および治療後(6日目)に超音波光音響イメージングシステムを用いて評価されました。6日目に眼窩後方静脈から血液を採取し、血清サイトカインはELISAで定量化されました。動物を過剰麻酔で安楽死させた後、心臓組織はタンパク質分析のために急速凍結されました。

T細胞分離
対照群のマウスは麻酔の過剰投与で安楽死させられました。脾臓は75%エタノールで5分間の表面滅菌後に無菌的に切除され、すべての結合組織が除去されました。脾臓は70μmの細胞ストレーナーを用いて機械的に解離され、PBSに2%のFBSを補足して単細胞懸浮液を作り出しました。この懸浮液は300 x g、4°Cで5分間遠心分離し、赤血球は1 mLのACK溶解緩衝液で室温で2分間溶解されました。溶解過程はPBS洗浄で終了しました。マウスT細胞分離キットを用いて活性化を防ぐためにT細胞を負の富集化しました。1,000万細胞ごとに50μLの選択カクテルを加え、室温で10分間培養しました。続いて、1,000万細胞あたり75μLのストレプトビジン磁気ビーズを追加し、5分間の培養期間を経ました。ビーズ結合細胞は磁石で3分間保持し、純度94%以上の濃縮T細胞を上清液から採取しました。CD4⁺およびCD8⁺サブセットの選別のために、濃縮細胞は抗CD3ε-PE、抗CD4-APC、抗CD8-FITC抗体で暗所で15分間染色され、その後予備冷却されたPBSで3回洗浄されました。フローサイトメーターで以下のゲーティング戦略を用いて選別が行われました:リンパ球(FSC/SSC)、次にCD3⁺、CD4⁺またはCD8⁺のサブセット。細胞は純度モードで200μLのPBSをあらかじめ充填した収集チューブに分類され、98%以上の純度を持つ標的サブセットが得られました。

心筋炎細胞モデルの構築と治療
HL-1細胞はDMEM/F12培地で、10%胎児牛血清(FBS)および1%ペニシリン・ストレプトマイシン(PS)を標準条件下(37°C、5% CO₂)で培養しました。細胞は3つのグループに分けられました:対照群(未処理)、モデル群(24時間CD4+/CD8+ T細胞で処理したHL-1細胞)、およびOOLE群(モデル群10%OOLEと24時間共処理)。

心筋損傷関連タンパク質の血清検出のためのELISA
キット内の抗体豊富なマイクロプレートウェルで50μLの血清サンプルを30分間インキュベートし、その後PBSTで3回洗浄して結合していない成分を除去します。2回目の培養のために、準備済みのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)アビジン溶液を加えます。PBSTで再度3回洗浄し、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質100μLを加えて比色反応を開始し、開始後30〜45分以内に100μLの停止液で反応を終了させます。マイクロプレートリーダーを使って450 nmの吸収率(OD)を測定し、既知の基準標準でプロットした標準曲線で標的分析物の濃度を定量します。

ウェスタン・ブロット
心臓組織は液体窒素を用いた組織均質装置で粉砕されました。その後、組織および細胞サンプルを200μLのRIPAバッファーに氷上で30分間溶解しました。溶解液は12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、タンパク質上清液を採取しました。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキットを用いて測定されました。タンパク質濃度を5μg/μLに調整した後、サンプルは5×ローディングバッファーと混合され、95°Cで10分間加熱されて変性させられました。タンパク質は10%SDS-PAGEゲル(100Vで90分間駆動)で分離され、その後15Vの半乾式エレクトロブロッティングでPVDF膜に30分間移されました。膜は5%無脂肪乳で遮断し、その後4°Cで一次抗体(IL-1β、NLRP3、MyD88、NF-κB p65、チューブリンを含む;1:1,000希釈)で夜間にプローブしました2。膜を0.1%Tween 20(TBST)を含むTrisバッファー生理食塩水でそれぞれ10分間3回洗浄した後、室温でホースラディッシュ過氧化酵素(HRP)結合二次抗体(1:10,000希釈)と1時間培養しました。タンパク質バンドは強化化学発光(ECL)基質を適用して可視化し、化学発光イメージングシステムで信号を捕捉しました。最後に、ImageJソフトウェアを用いて標的タンパク質バンドのデンシトメトリック値をチューブリン内部対照に正規化し、相対発現レベルを定量的に解析しました。

フローサイトメトリーによる細胞アポトーシスアッセイ
HL-1細胞はリン酸緩衝生食塩水(PBS)で2回洗浄されました。細胞解離のために、1 mLのトリプシンを加えて1分間インキュベートし、その後すぐに2 mLの完全培養地で中和しました。その後、細胞懸濁液を250 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液は廃棄されました。採取した細胞ペレットは氷で冷たいPBSで2回洗浄され、1倍結合バッファーに再懸濁されて細胞密度を1×106 cells/mLにしました。この細胞懸濁液の100μLアリコートをフローサイトメトリーチューブに移し、その後5μLのFITCアンネキシンVと5μLのプロピジウムヨウ化物(PI)を追加しました。穏やかな渦を巻いた後、混合液は暗闇の中、室温(25°C)で15分間培養されました。最後に各チューブに1×結合バッファー400 μLを追加し、その後フローサイトメーターを用いて細胞アポトーシスを解析しました。ゲート戦略では、イベントはまず前方散乱(FSC)と側散乱(SSC)でゲート化され、細胞内残骸を排除し、完全なHL-1細胞群を分離しました。この一次ゲート内で、アポトーシス細胞は象限解析を用いて定量化され、初期アポトーシス細胞はFITCアネクシンV⁺/PI⁻、後期アポトーシス細胞はFITCアネクシンV⁺/PI⁺として定義されました。

統計解析
各実験は三重に分けて行われ、統計解析は統計ソフトウェアを用いて行われました。2つのグループ間の差異は独立標本t検定を用いて分析されました。3群以上の差は一方向ANOVAを用いて分析し、その後ボンフェローニのポストホック検定を用いました。データは平均±標準誤差(SEM)で表されます。p < 0.05は統計的に有意とされました。

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結果

イピリムマブとノボルマブの併用は、動物モデルにおいてICI誘発性心筋炎を誘発します
ICI誘発性心筋炎モデルを確立するために、BALB/cマウスに尾静脈からイピリムマブ(5 mg/kg)およびニボルマブ(10 mg/kg)の静脈内注射を投与しました。その後、血清中の心トロポニンT(cTnT)濃度を酵素結合免疫吸着法(ELISA)を用いて測定しました。cTnTレベル≥10 ng/mLがモデル誘導の成功閾値として定義されました。 図1Aに示すように、モデリングプロトコルを受けた30匹のマウスの血清分析で、10匹のマウスでcTnT濃度が10 ng/mLを超え、これらの動物におけるモデル誘導の成功が確認されました。

OOLEは免疫性心筋炎のマウスの部分的な心機能を改善します
ICI誘発性心筋炎モデルでは、心エコー検査では収縮期(LVIDs)および拡張期(LVIDd)の両方で心拍数の増加...

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ディスカッション

本研究では、オリーブオイル系脂質エマルジョン(OOLE)がIL-1β/NLRP3/NF-κBシグナル伝達経路を抑制することで免疫チェックポイント阻害剤(ICI)誘発性心筋炎を効果的に減弱することを初めて示しました。私たちの結果は、OOLEが心機能を改善するだけでなく、 in vivo および in vitro の両方で心筋炎症を緩和するという機構的および機能的な証拠を提供します。ICI誘発性心筋炎のモデル。

機構的には、T細胞介在性心疾患がNLRP3インフラマソームアセンブリおよびNF-κBシグナル伝達を介してIL-1βカスケードの過剰活性化を引き起こすというモデルを支持しています。この炎症軸は心筋壊死を悪化させ、Th17分極を促進し、長期的な心臓再構築を誘発することが知られています。これに関連して、CD4/CD8⁺...

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

この研究は広州科技計画プロジェクト(基金番号:202201020040)、広州福大がん病院国際科学基金(基金番号:Y2023-ZD-05)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22μmのPVDF膜ミリポールISEQ00010 
4% パラホルムアルデヒド広州翡翠バイオテクノロジー有限公司BL539A
BALB/cマウス広東志元生物医学技術有限公司
BCAアッセイキット鼎国バイオテックBCA02
明視野顕微鏡写真撮影ML31
cTnT elisa キットランチャンシュオバイオテックED-28107
電気泳動装置WIXminiPro4
完全自動化化学発光画像解析システム富士フィルムLAS-3000
ヘマトキシリン・エオシンキット 広州翡翠バイオテクノロジー有限公司BL2236A
IFN-γ;ELISAキット厦門煉昌朔バイオテクノロジー有限公司(中国福建省)。ED-10284
IL-1とベータ;抗体親和性BF8021
IL-1とベータ;ELISAキット厦門煉昌朔バイオテクノロジー有限公司(中国福建省)。ED-10351
IL-6 ELISAキット厦門煉昌朔バイオテクノロジー有限公司(中国福建省)。ED-10377
ImageJ 1.54 ソフトウェアNIH
イピリムマブMCECAS: 477202-00-9
MyD88抗体親和性AF5195
NFとカッパ;B p65抗体親和性BF8005
ニボルマブMCECAS: 946414-94-4
NLRP3抗体親和性BF8029
オリーブオイル系脂質乳剤広州福大がん病院栄養科
急速半乾式回転フィルム装置バイオ・ラッド788BR04132
リアルタイム蛍光qPCR定量システムヤルイMA-6000
RIPA溶解バッファービヨタイムP0013B
回転式マイクロトームライカRM2235
SDS-PAGEゲルビヨタイムP0052A、P0053A
Annexin V-FITC/PI アポトーシス検出キット大連美倫バイオテクノロジー有限公司MA0220-1
EasySep Mouse CD4+ T 細胞分離キット幹細胞19765
HL-1ラット心筋細胞株広州オールパーフェクトバイオテクノロジー有限公司TCM-C783
TNF-およびα;ELISAキット厦門煉昌朔バイオテクノロジー有限公司(中国福建省)。ED-11776
超音波光音響イメージングシステムフジフイルム・ビジュアルソニックスVEvo3100
尿動力学検査システムテックマンBL-420

参考文献

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