シロイナナズナ核における単一分子局在顕微鏡の効率的なプロトコル

Summary

このプロトコルは、最適化された分離、固定、標識を用いてクロマチンおよびRNAポリメラーゼIIの信頼性の高いナノスケール可視化を実現し、単離シロイナズナの核の単分子局在顕微鏡イメージングの効率的なワークフローを提供します。この手法は、他のクロマチン関連タンパク質や高分解能イメージングのためのヒストン修飾にも容易に適応可能です。

Abstract

共焦点蛍光顕微鏡は植物核におけるクロマチンの組織構造に貴重な洞察をもたらしましたが、回折限界の分解能がクロマチン構造の研究を制約し、単一分子局在顕微鏡(SMLM)などの超分解能技術の利用を促しています。これらの手法の中で、直接確率的光学再構築顕微鏡(dSTORM)は個々の細胞内でナノスケールの解像度を提供し、クロマチンドメイン、ヒストン修飾、核組織の正確な可視化を可能にします。これらの手法は哺乳類システムでますます適用されていますが、サンプル調製の技術的課題により植物生物学での利用は限られています。

ここでは、 シロイナから分離された核のSMLMイメージングのための効率的かつ再現性の高いワークフローを紹介します。このプロトコルは、核形態を保存するための苗の固定から始まり、その後、穏やかな組織切断と遠心分離で完全な核を濃縮します。分離された核は液体培地に蛍光色体標識され、低融点のアガロースパッドに固定されます。この戦略により、長時間の単一分子イメージングセッション中の安定性が向上します。これらのステップは、背景蛍光を最小限に抑え、標識の一貫性を向上させ、生物学的複製をまたぐ再現性を高めます。

その結果得られる調製は、植物におけるクロマチン修飾や核構造の可視化をより明確にします。シロイナズナにSMLMイメージングを実装するための技術的障壁を下げることで、このプロトコルはナノスケールでのエピジェネティック制御、クロマチン組織、核トポロジー的変異を多目的に調査する汎用手段を提供します。本研究は、SMLMを植物に応用するための方法論的基盤を確立し、哺乳類細胞生物学とのギャップを埋め、核構造が植物システムの発生的および環境的手がかりに応じてゲノム調節にどのように寄与するかを研究する新たな機会を開きます。

Introduction

顕微鏡は長らくクロマチンの組織構造と核構造の研究の基盤であり、DNAやヒストン関連タンパク質が3次元核空間内でどのように配列し、遺伝子調節に影響を与えるかを明らかにしています^1,2。従来の蛍光顕微鏡法は、染色体領域、クロモセンター、核体^3,4などの大規模染色質ドメインについて貴重な知見を提供しており、特に植物の根組織^3,5,6において、その位置で実現可能である。しかし、これらの技術は光の回折障壁によって根本的に制限されており、空間分解能は横方向で約200 nm、^軸方向で約500 nmに制限されています。この制限は、エピジェネティック制御の基盤となるクロマチンの折りたたみ、ヒストン修飾パターン、転写区画化のナノスケールの詳細を覆い隠しています。この障壁を克服するために、構造化照明顕微鏡(SIM)⁸、刺激放出除去(STED)^9,10、単一分子局在顕微鏡(SMLM)^11,12などの超分解能顕微鏡(SRM)アプローチが開発され、100 nmから数 nm¹³ nmまでの解像度を実現しました。

SRM技術の中で、SMLM(光活性化局在顕微鏡(PALM)¹³および直接確率光学再構築顕微鏡(dSTORM)を含むものは、分子特^異性と組み合わせた卓越した空間分解能を提供します。SMLMは個々の蛍光色素の位置を時間経過とともに検出することで、クロマチンドメイン、ヒストンマーク、核構造の高精度ナノスケール画像を再構築^します。この能力は哺乳類系におけるクロマチン研究を変革し、SMLMはヌクレオソームのクラスタリング、クロマチン圧縮、ヒストン修飾パターンを前例のない詳細で可視化するために応用されています(15,16,17)。一方、SMLMの植物核への応用は、高い自己蛍光、細胞壁剛性、デンプンやクロロフィル¹⁸のような光散乱化合物の存在など、植物組織特性に伴う技術的課題により限られています。さらに、分離および標識時の核の繊細な性質により、長時間の画像撮影中に構造の完全性を維持し、背景蛍光を最小限に抑えるための最適化されたワークフローが必要です。

ここで説明するプロトコルは、エリザベス・クラシック・ダイアーとセリア・バルーによって刺激放出枯渇(STED)顕^{微鏡のために}もともと開発されました。その後、公開された微生物学応用20,21,22の知識を統合し、STORMイメージングの特定の要件を満たすために最適化・適応されました。全体的な目標は、単離されたシロイナ核のSMLMイメージングにおいて、効率的かつ再現性の高いワークフローを提供することです。最適化された固定、穏やかな機械的破壊、懸濁中の蛍光色素標識を統合することで、核形態を保存しつつ、画像画質を損なう細胞質汚染物質を効率的に除去します。低融点アガロースパッド上の標識核の固定化により、獲得時の機械的安定性が保証され、ナノスケール精度での長期単一分子イメージングが可能になります。これまでに記述された植物核のSRMプロトコル、特にSTED顕微鏡に基づく^ものと^{比較すると、}このワークフローは光スイッチ可能な蛍光素(例:AF647、JF549)を使用し、クロロフィルや組織の残骸を除去する洗浄ステップにより背景蛍光を低減し、固定かつ透過化された核に直接標識分子を加えることで標識均質性を向上させます。その結果、個々の核におけるクロマチン修飾、核区画、エピジェネティックパターンの一貫した可視化を可能にします。植物におけるSMLM導入の技術的障壁を下げることで、この手法はナノスケールイメージングのアクセスを広げ、クロマチンの組織や核構造が発生や環境の兆候に応じて遺伝子調節にどのように寄与するかを研究する基盤を提供します。

Protocol

注:本プロトコルで使用される材料および機器の詳細情報は 材料表に記載されています。特に指定がない限り、バッファーは無硝化性0.2μmフィルターでクリアされます。このプロトコル全体では、二重蒸留の超純度H₂O(ddH₂O)が使用されます。遠心分離の工程は、固定角度ローターを用いて1.5 mLのマイクロチューブ内で行われます。

1. 苗の核の固定と放出

1. 6ウェル培養プレートをフームフードの下に氷置き、各ウェルに約4mLの氷冷固定液を即席で準備します(4%(v/v)メタノール安定化ホルムアルデヒド、0.1%トリトンX-100、1×リン酸緩衝生理食塩水[PBS])。
2. クリーンな鉗子を使い、発芽後8〜15日以内に、固体(0.8%寒天)半強度ムラシゲおよびスクーグ培地2.2 g/L MS塩、1%ショ糖(w/v)、pH5.7(参考文献²⁴参照)で育てた苗を摘出し、直ちに固定液に浸します。約20本の苗を1本の井戸で管理し(サンプルごとに十分な材料を得るために3井戸が必要でした)。
3. プレートを氷で満たした真空チャンバーに入れ、0.2バールから0.8バールの圧力で15分間真空をかけて閉じ込められた空気を除去し、固定剤が^{植物組織に}深く浸透できるようにします。ゆっくりと真空を解除し、サンプルをかき混ぜてからさらに15分間真空をかけます。
4. フームフードの下でピペットで固定液を取り出し、冷たいPBS5mLでそれぞれ10分間10分間洗浄します。
5. PBSを取り除き、鉗子を使って固定組織を120mm×120mmのペトリ皿に移します。固定苗に加え、クラチック・ダイアーとバルーによる調製(45 mM MgCl₂、20 mM MOPS、30 mM クエン酸ナトリウム、0.3% トリトンX-100)を50 μL追加します。1 N HCl)¹⁹を使ってpH 7に調整します。刃物の欠けだ。
   注:この作業においては、ミミソリブレードの方が従来のカミソリブレードよりも効率的であることが判明しました。
6. 同じ刃で刻んだ組織をペトリ皿の端にこそげ、600μLのNIBを加え、刃に付着した組織も洗い流してください。
7. 組織スラリーを2 mLのドゥンス均質管に移し、小さい杵で5〜10回、次に大きな棒でチューブ内で滑らかに動くまでストロークします(通常は5〜10回のストロークが必要です)。
8. 均質化されたサンプルを30μmメッシュフィルターで1.5mLのマイクロチューブにろ過します。
9. 加速と減速の両方のために最も低いランプを使って、サスペンションを800 ×g で10分間遠心分離します。緑色の組織の破片の中に小さな白いペレットが見えます。
10. 上清液を捨て、ペレットを150μLのNIBに再懸濁します。
11. 800 × g で再び遠心分離機で10分間、上清液を取り除きます。もし緑色のゴミが目に見えたら、もう一度洗いましょう。ペレットのサイズに応じて50μLから150μLのNIBで再懸濁します。
12. 分離された核の懸濁液は最大1週間4°Cで保存してから染色を行います。しかし、直ちに進むことが推奨されます。

2. (免疫)染色

注:以下の手順では、通常20本の苗に相当する50μLの核懸濁体積にプロトコルを適用します。特に指定がない限り、以下の手順は室温で行われます。

1. 溶液を800 g で10分間遠心分離×、上清液を捨てます。ペレットに触れないように気をつけてください。
2. 核を50μLのブロッキングバッファー(143 mM NaCl、PBS中のBSA4%、4°Cで保存)に優しくピペッティングして再懸濁させます。優しくかき混ぜて30分間孵育させます。
3. 溶液を800× g で10分間遠心分離し、核ペレットに触れずに上清液を捨てます。
4. 核を1×PBSの50μLに優しくピペッティングして再懸濁させます。800 × gで再び遠心分離機で10分間処理します。上澄液は上記の通り捨てます。
5. 核を143 mM NaCl、1% BSA、0.05% Tween 20 in PBSからなる免疫染色バッファーで調製した一次抗体溶液50 μLに再懸浮させます(抗体および作動希釈は 材料表に記載)。サンプルを優しく攪拌しながら60分間培養します。
6. 2回洗い(ステップ2.3と2.4を繰り返します)を進めます。
7. 核をヤギ抗ウサギ用AF647二次抗体50μLに1/200希釈²⁶で再懸濁させます。蛍光色素を光から守るために、管をアルミホイルで包みます。チューブを優しく攪拌しながら60分間孵化させます。
8. 2回洗い(ステップ2.3と2.4を繰り返します)を進めます。
9. ペレットを50μLのNIBに再懸濁させます。懸濁液はアルミホイルで包んだ1.5mLのマイクロチューブに保管してください。標識は数週間4°Cで安定します。

3. マウント

1. STORMイメージングのために、低融点のアガロース溶液(LMA 1.5% w/v)を、50 mM Tris pH 8、10 mM NaCl、10% グルコースからなる1.25 ×バッファーBに溶けて準備します。1.25×のストック溶液を準備し、4°Cで保存します。
2. 90°Cで1分間加熱して粉末を溶かし、透明な溶液を得る。次のステップに進む前に、溶融したLMA溶液を37°Cで冷却・維持し、グルコース酸化酵素(GLOX)バッファーの熱変性を防ぐこと(-20°Cで保存した10倍のストック溶液を準備します。100 mM Tris pH 7.5、25 mM KCl、1 mM TCEP pH 7.0、5 mg/mL グルコースオキシダーゼ、0.4 mg/mL カタラーゼ 50%のV/Vグリセロールです。
3. LMA溶液が37°Cに達したら、温かいLMA溶液に100 mMのメルカプトエチルアミン(MEA)とGLOXを加えてSTORMバッファーを準備し、最終濃度を1×にします。MEA 1 Mのストック溶液は4°Cで最大1か月間保存しますが、新たに調製した溶液の使用が推奨されます。優しく混ぜてください。
   注:任意のDNA標識には、JF549結合ホエストの最終濃度1mM(DMSO中1mMストック溶液)を加えてください。使用まではサスペンションを37°Cに保ってください。
4. 核懸濁液をナノダイヤモンドと1/1500希釈で優しく混ぜます。サンプルと一緒に5分間培養します。
   注:ナノダイヤモンドはサンプルドリフトを補正するための基準マーカーとして機能します。
5. 混合物10μLをオゾン処理済みの1.5Hカバースリップ(紫外線オゾン洗浄システムで20分間)に浸し、3分間待って核がカバースリップに沈着するのを待ちます。
6. 余分な液体を取り除き、2分待ちます。ステップ3.3で準備したLMAを10μL加え、すぐに顕微鏡スライドで覆い隠します。
7. カバースリップはシリコンシーラントでシールしてください。マイクロピペットの先端を使って、小さなペトリ皿に同量の溶液AとBを混ぜます。カバースリップの縁に混合液を塗ってサンプルを密封します。シリコーンシーラントは5分以内に硬化します。
8. マウント後は、マウントパッドの酸素除去特性の喪失を防ぐため、遅延なくスライドのイメージングを行い、最終的に4〜5時間以内に実施します。

4. イメージング

注:イメージングパラメータは、試料の性質、蛍光色素の光物理的特性、顕微鏡の光学配置に応じて慎重に最適化されなければなりません。各蛍光分子の信号対雑音比を高く保ちつつ、蛍光チャネル間のスペクトル漏れや交差励起を最小限に抑えることが重要です。サンプルは、NA100xの油浸式対物レンズ、フォーカス維持ユニット、明るい視野イメージング用の白色LEDを備えた逆蛍光顕微鏡で観察されました。蛍光ラベルAlexaFluor647(AF647)は640nmで励起され、JF549-Hoechstは561nmで励起されました。発光された光は互換性のある二色性ミラーとバンドパスフィルターでフィルタリングされ、最後に科学的な相補金属酸化半導体(sCMOS)カメラで画像が収集されました。

1. サンプルスライドを取り付けてピントを合わせます。システムにフォーカス維持モジュールがあれば有効化してください(長期取得には強くおすすめ)。
2. 原子核を見つけて集中する。再構築中のドリフトをより効率的に補正するために、関心のある核の近くに1つまたは数個のナノダイヤモンドを置く方が良いです。
3. (任意)低レーザー出力で明面界および各蛍光チャネルの回折制限スナップショットをキャプチャします。
4. 二色イメージングを行う際は、まず長波長チャネルの取得から短波長チャネルに切り替えます(すなわち、JF549より先にAF647チャネルを取得する)。
   注:本研究で用いられた獲得パラメータの例:
   チャンネルA - エピトープ標識 - AF647
   露光時間:20 ms
   レーザー強度:640 nm – 2.2 kW/cm²
   エキサイテーションモード:HiLo²⁷
   チャネルB - DNA標識 - JF549-Hoechst
   露光時間:50ms
   レーザー強度:561 nm - 1 kW/cm²
   励起モード:エピ
   記録画像数:チャンネルあたり10,000〜30,000枚で、フレームあたりの蛍光色素密度が十分な量を保ち、単一分子の正確な局在化に十分なように保たれています。また、累積局在数は超分解能QUantitative Image Rating and Reporting of Error Locations(SQUIRREL)²⁸を用いて実証的に決定され、十分なフレーム数も示しています。

Results

上記のプロトコルにより、SMLMに適した高品質 なシロイナ 核の調製が可能です。核の完全性を向上させ、画像品質を損なう細胞質および細胞の破片を減らすために、複数回の最適化が行われました。各最適化ステップの後、核準備の品質はオリンパスIX81回転ディスク顕微鏡を用いた共焦点イメージングで評価され、その後超分解能取得に進みました。

共焦点イメージング
上記の手順は確かに共焦点イメージングと両立しています。この目的のために、ステップ3.1で使用されるLMA溶液はPBS(または任意の中性バッファーや培地)に基づいています。MEAとGLOXはSMLMにのみ必要です。一方、SMLM(ステップ3.3)で用いられるJFベースのホエクストは希釈されすぎて従来のイメージング手法では検出できません。共焦点またはエピ蛍光イメージング用のDNA標識は、Hoechst H33258を1/500希釈(ストック1 mg/mL)で達成しました。

現在の最適化プロトコルを用いて、15日齢のシロイナヌナの野...

Discussion

シロイヌナナ核の単一分子局在顕微鏡(SMLM)用に準備するには、最終サンプルの品質に大きな影響を与えるいくつかの重要な工程が必要です。前述の^{通り、19,35}、完全な核の回復を最大化するためには、徹底的かつ一貫した組織切断が不可欠です。標準的なカミソリの刃の代わりにミクロトームブレードを使用することで、組織の断片化がよりクリーンで均一になり、核の放出が促進されます。その後の洗浄と遠心分離の工程も、ゴミを減らすために同様に重要です。これらの工程は慎重に行われ、上澄液は200μLマイクロピペットでゆっくりと除去され、その後10μLマイクロピペットで核の損失を最小限に抑えます。ペレットが特にコンパクトな場合は、NIBバッファーの再懸濁容量を200〜250μLに増やすことで、凝集を防ぎ、より均一な懸濁を実現します。

オプションの改造により、サンプルの純度や画像品質がさらに向上します。最終洗浄...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition software	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Certified Low Melting Agarose	Bio-Rad	1613111
Coverslips thickness 1.5H round	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Dichroic mirror	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Dichroic mirror for excitation/emission separation
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´	biowest	X0515 - 500	Work in sterile conditions
Epredia Ultra Disposable Microtome Blades	FisherScientific	12191830	Low profile, single use
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Falcon	353046
Formaldehyde solution 37%	Carl Roth	7398	Work under the fume hood
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycerol	VWR	24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Used at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647
Hoechst 33258 solution	Sigma-Aldrich	94403	Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad
Hydrochloric Acid Solution	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Used to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles
Lasers unit	Oxxius	L6Cc	Equipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	HN03
Mercaptoethylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sodium salt 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Multiband emission filter	Semrock	FF01-446/523/600/677	Multiband emission filtration to block laser scatter light
Nanodiamonds	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Stock 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS camera	Hamamatsu	C14440-20UP
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile	Greiner Bio-One	664161	Used to grow plants on 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio-One	688161	Used when chopping the plant seedlings
pluriStrainer Mini cell strainer	pluriSelect	43-10030-50	Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Single band emission filter	Semrock	FF01-698/70	Specific emission filter for AF647 channel
Single band emission filter	Chroma	ET600/50m	Specific emission filter for JF549 channel
Sodium chloride (99,5%)	Euromedex	1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock cone	ClearLine	146560
Super-resolution system	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-carboxy