シロイナナズナ核における単一分子局在顕微鏡の効率的なプロトコル

Summary

このプロトコルは、最適化された分離、固定、標識を用いてクロマチンおよびRNAポリメラーゼIIの信頼性の高いナノスケール可視化を実現し、単離シロイナズナの核の単分子局在顕微鏡イメージングの効率的なワークフローを提供します。この手法は、他のクロマチン関連タンパク質や高分解能イメージングのためのヒストン修飾にも容易に適応可能です。

Abstract

共焦点蛍光顕微鏡は植物核におけるクロマチンの組織構造に貴重な洞察をもたらしましたが、回折限界の分解能がクロマチン構造の研究を制約し、単一分子局在顕微鏡(SMLM)などの超分解能技術の利用を促しています。これらの手法の中で、直接確率的光学再構築顕微鏡(dSTORM)は個々の細胞内でナノスケールの解像度を提供し、クロマチンドメイン、ヒストン修飾、核組織の正確な可視化を可能にします。これらの手法は哺乳類システムでますます適用されていますが、サンプル調製の技術的課題により植物生物学での利用は限られています。

ここでは、 シロイナから分離された核のSMLMイメージングのための効率的かつ再現性の高いワークフローを紹介します。このプロトコルは、核形態を保存するための苗の固定から始まり、その後、穏やかな組織切断と遠心分離で完全な核を濃縮します。分離された核は液体培地に蛍光色体標識され、低融点のアガロースパッドに固定されます。この戦略により、長時間の単一分子イメージングセッション中の安定性が向上します。これらのステップは、背景蛍光を最小限に抑え、標識の一貫性を向上させ、生物学的複製をまたぐ再現性を高めます。

その結果得られる調製は、植物におけるクロマチン修飾や核構造の可視化をより明確にします。シロイナズナにSMLMイメージングを実装するための技術的障壁を下げることで、このプロトコルはナノスケールでのエピジェネティック制御、クロマチン組織、核トポロジー的変異を多目的に調査する汎用手段を提供します。本研究は、SMLMを植物に応用するための方法論的基盤を確立し、哺乳類細胞生物学とのギャップを埋め、核構造が植物システムの発生的および環境的手がかりに応じてゲノム調節にどのように寄与するかを研究する新たな機会を開きます。

Introduction

顕微鏡は長らくクロマチンの組織構造と核構造の研究の基盤であり、DNAやヒストン関連タンパク質が3次元核空間内でどのように配列し、遺伝子調節に影響を与えるかを明らかにしています^1,2。従来の蛍光顕微鏡法は、染色体領域、クロモセンター、核体^3,4などの大規模染色質ドメインについて貴重な知見を提供しており、特に植物の根組織^3,5,6において、その位置で実現可能である。しかし、これらの技術は光の回折障壁によって根本的に制限されており、空間分解能は横方向で約200 nm、^軸方向で約500 nmに制限されています。この制限は、エピジェネティック制御の基盤となるクロマチンの折りたたみ、ヒストン修飾パターン、転写区画化のナノスケールの詳細を覆い隠しています。この障壁を克服するために、構造化照明顕微鏡(SIM)⁸、刺激放出除去(STED)

Protocol

注:本プロトコルで使用される材料および機器の詳細情報は 材料表に記載されています。特に指定がない限り、バッファーは無硝化性0.2μmフィルターでクリアされます。このプロトコル全体では、二重蒸留の超純度H₂O(ddH₂O)が使用されます。遠心分離の工程は、固定角度ローターを用いて1.5 mLのマイクロチューブ内で行われます。

1. 苗の核の固定と放出

1. 6ウェル培養プレートをフームフードの下に氷置き、各ウェルに約4mLの氷冷固定液を即席で準備します(4%(v/v)メタノール安定化ホルムアルデヒド、0.1%トリトンX-100、1×リン酸緩衝生理食塩水[PBS])。
2. クリーンな鉗子を使い、発芽後8〜15日以内に、固体(0.8%寒天)半強度ムラシゲおよびスクーグ培地2.2 g/L MS塩、1%ショ糖(w/v)、pH5.7(参考文献²⁴参照)で育てた苗を摘出し、直ちに固定液に浸します。約20本の苗を1本の井戸で管理し(サンプルごとに十分な材料を得るために3井戸が必要でした)。
3. プレートを氷で満たした真空チャンバーに入れ、0.2バールから0.8バールの圧力で15分間真空をかけて閉じ込められた空気を除去し....

Results

上記のプロトコルにより、SMLMに適した高品質 なシロイナ 核の調製が可能です。核の完全性を向上させ、画像品質を損なう細胞質および細胞の破片を減らすために、複数回の最適化が行われました。各最適化ステップの後、核準備の品質はオリンパスIX81回転ディスク顕微鏡を用いた共焦点イメージングで評価され、その後超分解能取得に進みました。

共焦点イメージング
上記の手順は確かに共焦点イメージングと両立しています。この目的のために、ステップ3.1で使用されるLMA溶液はPBS(または任意の中性バッファーや培地)に基づいています。MEAとGLOXはSMLMにのみ必要です。一方、SMLM(ステップ3.3)で用いられるJFベースのホエクストは希釈されすぎて従来のイメージング手法では検出できません。共焦点またはエピ蛍光イメージング用のDNA標識は、Hoechst H33258を1/500希釈(ストック1 mg/mL)で達成しました。

Discussion

シロイヌナナ核の単一分子局在顕微鏡(SMLM)用に準備するには、最終サンプルの品質に大きな影響を与えるいくつかの重要な工程が必要です。前述の^{通り、19,35}、完全な核の回復を最大化するためには、徹底的かつ一貫した組織切断が不可欠です。標準的なカミソリの刃の代わりにミクロトームブレードを使用することで、組織の断片化がよりクリーンで均一になり、核の放出が促進されます。その後の洗浄と遠心分離の工程も、ゴミを減らすために同様に重要です。これらの工程は慎重に行われ、上澄液は200μLマイクロピペットでゆっくりと除去され、その後10μLマイクロピペットで核の損失を最小限に抑えます。ペレットが特にコンパクトな場合は、NIBバッファーの再懸濁容量を200〜250μLに増やすことで、凝集を防ぎ、より均一な懸濁を実現します。

オプションの改造により、サンプルの純度や画像品質がさらに向上します。最終洗浄.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗RNAポリメラーゼII CTDリピートYSPTSPS(リン酸S2)抗体	アブカム	AB5095	免疫染色バッファー中の1/200希釈による一次抗体(ウサギで誘導されたポリクローン抗体)を可視化するために使用しました。
取得ソフトウェア	アベライト	NEO LiveImaging v2.18
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A7906
カタラーゼ	シグマ・オルドリッチ	C40
認証低溶融アガロース	バイオ・ラッド	1613111
カバースリップ厚さ1.5Hラウンド	マリエンフェルト	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-グルコース、無水、99%	サーモ・サイエンティフィック	A16828-36
二色鏡	セムロック	Di03-R405/488/561/635-t1	励起/放出分離のための二色鏡
ダルベッコリン酸塩緩衝塩水10&急性;	バイオウェスト	X0515 - 500	無菌環境での作業
Epredia ウルトラ使い捨てミクロトームブレード	フィッシャーサイエンティフィック	12191830	低プロファイル、使い捨て
Falcon 6ウェルクリアフラットボトムTC処理マルチウェル細胞培養プレート(蓋付き)	ファルコン	353046
ホルムアルデヒド溶液 37%	カール・ロス	7398	排気フード下での作業
グルコース酸化酵素	シグマ・オルドリッチ	G2133
グリセロール	VWR	24388.295
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高度交差吸着二次抗体、Alexa fluor plus 647	サーモ・サイエンティフィック	A32733TR	1/200で二次抗体としてAF647と結合して使用。
Hoechst 33258 解	シグマ・オルドリッチ	94403	1/500で使用され、アガロースパッドに加えられたDNAのカウンターステインに使われます
塩酸溶液	化学実験室	CL05.0311.1000
JF549-ホーヒスト	ラヴィスラボとオープンケミストリーチーム(ジャネリア)	JF549-ホーヒスト	DNAのカウンターステインに使用され、最終濃度1.5 nMでアガロースパッドに加えられます
キンブル・ドゥンス ティッシュグラインダーセット	シグマ・オルドリッチ	D8938	2 mLチューブで、大きめ(0.0030-0.0050インチ)と小さめ(0.0005-0.0025インチ)のクリアランスペッスルの両方を含みます
レーザーユニット	オクシウス	L6Cc	6基のレーザーを搭載:405nm - 100 mW、488 nm - 200 mW、532 nm - 500 mW、561 nm - 300 mW、640 nm - 500 mW、730 nm - 30 mW
塩化マグネシウム六水和物	カール・ロス	HN03
メルカプトエチルアミン(MEA)	シグマ・オルドリッチ	30070
MOPS ナトリウム塩 98%	フィッシャー・サイエンティフィックSAS	352590010
多帯域発光フィルター	セムロック	FF01-446/523/600/677	レーザー散乱光を遮断するための多帯域放射フィルター
ナノダイヤモンド	アダマス・ナノテクノロジーズ	NDNV100nmHiWGA2ml	ストック 1 mg/mL
ORCA-FusionデジタルCMOSカメラ	浜松	C14440-20UP
ペトリ皿、100/20mm、PS、透明、通気口付き、無菌	グライナー・バイオ・ワン	664161	1/2 MS培地で植物を育てていた
ペトリ皿、四角い、PS、透明、120/120/17mm、無菌	グライナー・バイオ・ワン	688161	苗を切る際に使われる
pluriStrainer ミニセルストレーナー	プルリセレクト	43-10030-50	メッシュサイズ30とマイクロ;m、1.5 mLエッペンドルフ管に適しています
塩化カリウム	シグマ・オルドリッチ	P9333
単帯域発光フィルター	セムロック	FF01-698/70	AF647チャネル用の特定放射フィルター
単帯域発光フィルター	クロマ	ET600/50m	JF549チャネル用の特定放射フィルター
塩化ナトリウム(99.5%)およびnbsp;	ユーロメデックス	1112-A
スターフロストスライド 76 x 26 mm	ニッテル	VS112711FKB.01
滅菌シリンジフィルター&オスラッシュ;33 mmの孔隙率 0.2 & マイクロ;m ルアーロック錐	クリアライン	146560
超分解能システム	アベライト	SAFe360	オリンパスIX83 100倍NA1.5油浸透物レンズを装備
トライナトリウムクエン酸2H2O Gen-Apexバイオモール	プロラボ	PRO-33615.268
トリス基分子生物学グレード	プロメガ	H5135
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)	サーモ・サイエンティフィック	20491
トライトン X-100	ユーロメデックス	2000-B
トゥイーン20	ユーロメデックス	2001-B
ツインシルスピード	ピコデント	13001002	シリコーンシーラント
紫外線オゾン浄化システム UVOCSオーブン	UVOCS社	T10X10	カバースリップクリーニングのための20分間の露光
真空ポンプ	バキューブランド	VP 100C
ヘレウス・メガフュージ16R遠心分離機	サーモ・サイエンティフィック		ローターTX-400 75003629。エッペンドルフ管を用いた遠心分離。