このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

207 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/70894

⸱

2026年6月23日

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、酵素的消化およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、マウスの骨格筋および骨髄から小さな細胞外小胞を分離し、構造的に複雑で収量の少ない組織から小胞富集部分を再現可能にして下流の分子解析を可能にします。

要約

小さな細胞外小胞(sEV)は、ナノサイズの脂質結合粒子で、タンパク質、脂質、リボ核酸(RNA)の移動を通じて細胞間通信を媒介します。骨格筋(SkM)や骨髄(BM)などの固形組織からのsEVの分離は、収率が低く非胞性成分からの汚染があるため、依然として困難です。このプロトコルは、マウスのSkMおよびBMからsEVを分離するための再現可能なワークフローを記述しています。SkMは酵素的に消化され、BMは直接処理され、その後差分遠心分離およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を受けます。SkMの場合、空隙体積(~2.5 mL)を廃棄し、その後の~1.6 mLはEV濃縮分画として収集され、通常は400 μLの連続分画(F1–F4)に細分されます。BMでは、700μLの空隙体積を廃棄し、その後~850μLのEV濃縮分画を収集し、これを~170μLの連続分数(F1–F5)に細分し、EVマーカーの濃縮に基づいてプールできます。この手法を用いると、小さな組織体積(単一の大腿四頭筋から約500μL、プールした大腿骨および脛骨から約150μL)からsEVを分離でき、主に200 nmの<粒子径を持つ~108 mL·mL−1·mg−1 の組織が得られます。透過電子顕微鏡、ナノ粒子追跡解析、ウェスタンブロッティングを用いて典型的なEVマーカーの完全性と純度が検証され、さらに単一粒子干渉計検出によるテトラスパニン定義された小胞サブポピクル群の定量化も行います。この方法は、最小限の入力材料で構造的に複雑な組織から高純度のsEVを再現性に分離し、組織由来小胞の下流の分子および機能解析を支援します。

概要

小さな細胞外小胞(sEV)は、ナノサイズの脂質結合粒子で、タンパク質、脂質、核酸の移動を通じて細胞間通信を媒介します。これらはすべての細胞型から放出され、ほぼすべての生体流体に存在し、ペプチドや微小リボ核酸(RNA)を含むバイオアクティブ貨物の主要な運搬者として機能します2。貨物は選択的に選別され、特定の信号を正確に届けることが可能です。また、その小胞構造により、自由分泌因子の典型的な勾配や希釈制約を回避し、濃縮分子ペイロードを長距離にわたって届けることができます。バイオフルイド(例:血漿、血清、唾液)からのEVは全身シグナル伝達の便利なスナップショットを提供しますが、多くの組織から起源を持つ非常に混在した集団を表しています5。これにより、どの臓器が特定の生物学的信号を生成しているのか、また組織レベルでEV通信がどのように制御されているのかを特定することが困難です。循環中のEVはプールされるため、組織特異の変化が希釈または隠蔽され、信号の真の発生源を特定する能力が制限されます。

骨格筋(SkM)と骨髄(BM)は、異なる細胞組成とシグナル伝達役割を持つ主要な代謝および機能的に活発な組織です 7,8。両組織とも、組織特異的な特有の物質を豊富に含んだEV集団を放出する可能性があります。しかし、これらの信号は免疫細胞などの高ターンオーバー組織からのEVによって血漿内で簡単にかき消されてしまうことがあります。筋肉や大便からEVを直接分離することで感度が上がり、循環中では観察できない微妙な組織特異的適応の検出が可能になります。したがって、組織由来のEVは、特定の臓器がEVを放出する時期、その信号がどれくらい持続するか、どの適応が急性か慢性かを明らかにする重要な補完情報を提供します。EVへの関心が高まっているにもかかわらず、確立された多くの分離方法はバイオフルイド(例:プラズマや血清)や細胞培養システム向けに開発されています。これらの文脈では、比較的高収量と最小限の構造的破壊でEVを得ることができます。しかし、SkMやBMのような固体組織からEVを直接分離するには、著しい技術的課題があります。これらの組織は構造的に複雑かつ多様であり、機械的または酵素的解離ステップが必要であり、高濃度の可溶性タンパク質、細胞小器官断片、非小胞性ナノ粒子などの人工物を導入し、高純度のEV製剤の実現を困難にします。

組織由来EV分離におけるもう一つの大きな課題は、分数定義および分離の標準化されたワークフローが不足していることです。差動遠心分離単独ではタンパク質集合体や大きな小胞の共分離が起こることが多い一方、超遠心分離法は広く使われているものの、ローターの種類や実験条件によって小胞の凝集、変形、可変性の回復を引き起こすことがあります。密度勾配法は純度を向上させますが、時間がかかり、スループットが低く、実験室間で標準化が困難です。したがって、現在、高純度かつ安定した収率を持つ固体組織から小型EVを分離するのに最適化された広く採用された再現可能な方法はありません。

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、小胞に強い遠心力をかけずに粒子をサイズに基づいて分離できるため、EV分離の有望な代替手段として浮上しています。SECは、小胞の完全性と生物学的機能を保ちつつ、小型EVを可溶性タンパク質や低分子量汚染物質から効率的に分離することを可能にします。重要なのは、SECにより洗脱分の明確な定義が可能となり、EV濃縮分の再現性や実験間の一貫性向上が可能であることです。しかし、SECのワークフローでは、特に上流の組織処理、デブリ除去、フラクション収集に関して、組織由来サンプルに対して慎重な最適化が必要です。これらの制約に対処するため、SkMおよびBMからsEVを分離するための再現可能かつ標準化されたプロトコルを開発しました。この方法は、線維組織に対する制御された酵素的消化、破片除去のための差動遠心分離、そしてSECベースの精製による高純度小胞の分離を統合しています。このワークフローは、細胞内成分からの汚染を最小限に抑えつつ、小胞の完全性を保ち、低収量組織からの一貫した回復を可能にするよう最適化されています。

このプロトコルは、ナノ粒子追跡解析(NTA)、標準的なEVマーカーのウェスタンブロッティング、形態評価のための電子顕微鏡、抗体捕捉、干渉計測定、多チャネル蛍光イメージングを用いた単一粒子EV解析を用いて、定義された分画と検証された純度を持つ組織由来sEVを単離するための実用的かつスケーラブルなアプローチを提供することで、重要な方法論的ギャップを埋めます。特に、バイオフルイド由来の小胞が細胞内の信号起源を解明するには不十分な組織特異的EV解析を必要とする研究に適しています。研究者は、固形組織から汚染を最小限に抑え、小胞の完全性を保つ高純度のsEVを得ることを目的とする場合にこの方法を用いるべきです。一方、超遠心分離法は純度があまり重要でない高収量用途では好まれ、スループットが低いにもかかわらず特定のEVサブポピュレーションを分離する際には密度勾配方式が選択されることがあります。このプロトコルは、組織由来のsEVの単離と特性評価のための標準化された枠組みを提供し、分子、生化学、機能的下流解析の再現性を可能にします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての動物処置はマギル大学動物ケア委員会(DOUG10029)によって承認され、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って実施されました。

1. SkM由来sEV(SkM-sEV)分離プロトコル

  1. サンプル採取と組織解離
    1. 組織の採取と保存
      1. 切除直後、事前に冷却したメチルブタンに浸してSkM組織をスナップ冷凍します。
        注意:予備冷却されたメチルブタンを準備するには、メチルブタンの容器をドライアイスの浴槽に入れ、徐々にドライアイスを直接液体に加えます。溶液を冷やすと、通常は−70°Cから−80°Cの範囲内です。 使用中はドライアイス浴でメチルブタンを保温しておく。組織を完全に凍結させるまで約3〜4秒浸け、完全に硬化し柔軟性が失われることを示します。
      2. 組織をクライオビアルに移す。
      3. サンプルをドライアイスの上に置きます。
        注意:サンプルはさらなる処理まで−80°Cで保管してください。繰り返される凍結と解凍のサイクルは避けましょう。急速スナップ冷凍は、サンプルが適切に密封されている場合にEVを効果的に保存します。組織が露出したまま放置されたり、複数回の凍結解凍サイクルを経ると、脱水や小胞損傷が生じることがあります13。
    2. 組織解離
      注意:バイオセーフティキャビネット内のすべての工程は、汚染を防ぐために滅菌機器と手袋を使用して行ってください。これによりEVの純度が損なわれる可能性があります。
      1. 組織の重さを量ってください
        1. ピンセットは70%エタノールで滅菌し、自然乾燥させます。
        2. 凍結組織をあらかじめ計量された懸濁培養皿に移します。
        3. 組織をミリグラムバランス(通常はマウスの年齢や性別によりますが、サンプルあたり80〜120mg)を使って計量します。
          注:プロトコルは入力組織質量~80〜120mgに対して検証されています。この範囲内の試料については、ステップ1.2.3.1、1.3.1.3、1.3.2.1で指定された試薬体積を修正せずに使用してください。この範囲外のサンプルについては、RPMI-1640、コラーゲンゼD、DNase Iの検証済み比率(1000:40:40:4 μL/100 mg組織)を維持しつつ、すべての試薬体積を組織質量に比例してスケールしてください。これは組織1mgあたり約10μL RPMI-1640、0.4μLコラーゲナーゼD(100 mg/mLストック)、0.04 μL DNase I(20,000 U/mLストック)に相当します。これらの比率を維持して、最終反応酵素濃度を保ちます。消化効率とEV収量は、80〜120mgの範囲を大幅に外れた場合に実証的に検証されるべきです。
        4. サンプルは事前に冷やして冷やしたチューブに戻し、氷の上に保管してください。
      2. 酵素を準備する
        1. コラーゲン酵素D(100 mg/mLストック)およびDNase I(20,000 U/mLストック)の解凍アリコートを氷で保管します(酵素ストックの調製については 補足ファイル1、ステップ1.4参照)。これらの酵素はステップ1.3.2.1で添加され、最終反応時濃度3.8 mg/mLのコラーゲン酵素Dおよび77 U/mLのDNase Iを達成します。最終消化量は1.044mLです。
        2. 逆転でDNase Iを優しく混ぜます。渦を巻くな。
      3. 消化のための組織準備
        1. 氷の上に置いた無菌懸濁培養皿に800μLのRPMI-1640を加えます。
        2. 組織を皿に移します。
        3. 組織を滅菌使い捨てメスで、ほぼ均一な大きさ(片側2〜3mm)の6〜8個に切り分けます。切断時には無菌鉗子で組織を安定させ、均一な断片化を確保しましょう。このステップはサンプルごとに1分以内に完了し、サンプル間の一貫性を保ちましょう。
        4. 調理中は皿を氷のままにしておき、分解を最小限にしましょう。
    3. 組織移動と酵素による消化
      1. 組織移植
        1. 滅菌されたP1000ピペットの先端を無菌刃でトリミングし、直径2〜3mmの開口部を作り、ステップ1.2.3.3で生成された組織断片が自由に通過できるようにします。
          注意:または、市販のワイドボア(ワイドオリフィス)1 mLピペットチップを使用してください。これらは標準化された開口部(通常内径~2–3 mm)を提供し、手動トリミングに伴う変動を排除します。
        2. 組織断片とRPMI-1640培地を、改造チップを装着したP1000ピペットを用いて、あらかじめ標識された1.5mLチューブに移管します。残留断片と培地を回収するために2〜3回連続の吸引を行います。移植後は皿とピペットの先端を目視で確認し、残った破片を滅菌鉗子で移し、目に見える組織が残っていないか確認してください。
        3. 各チューブに200μLのRPMI-1640を加えます。
      2. 酵素的消化
        1. 氷で解凍したアリコートから、各チューブにコラーゲナーゼDストック40μL(100mg/mL)とDNase Iストック4μL(20,000 U/mL)を加えます。これにより、最終反応濃度は3.8 mg/mLのコラーゲン酵素Dおよび77 U/mLのDNase Iとなります。80〜120mgの範囲外のサンプルについては、ステップ1.2.1.3の後のNOTEに記載された酵素体積を比例的に調整してください。
          注:これらの体積は、典型的な80〜120 mgの範囲内の組織質量に合わせて校正されています。この範囲外の組織質量については、ステップ1.2.1.3の次のNOTEに記載された比例ですべての試薬体積をスケールします(組織1mgあたり0.4μLコラーゲナーゼDストックおよび0.04μLのDNase Iストック)。これにより、組織質量に関係なく最終反応酵素濃度は同じに保たれます。
        2. 複数のサンプルを処理する際は、酵素をすべてのサンプルに同時に加えます。
        3. 酵素添加中はチューブを氷の上に置いておく。
        4. チューブを優しく反転させて混ぜます。渦を巻くな。
        5. チューブを37°Cで30分間、旋回ミキサー(24回転、20°傾き角度、材料 表参照)で孵化させます。孵化中は均等に混ぜるようにしましょう。
          注意:各サンプルを総容量1.044mL(1000μL RPMI-1640、40μLコラーゲナーゼD、4μL DNaseI、1サンプルあたり約25:1に相当)で消化してください。
    4. 破片の除去
      注意:最初の遠心分離開始時にSECカラム平衡を開始します(ステップ1.4.1.1)。SECカラムはフラッシュと平衡に20〜25分かかります。この時点で平衡を始めることで、ろ過工程(ステップ1.4.3)終了後すぐにカラムが試料の充填準備が整うようにします。
      1. 最初の遠心分離
        1. サンプルを300 × gで4°Cで10分間遠心分離し、未消化の残骸、無傷の細胞、残存組織断片をペレットで除去します。
        2. ペレットを乱さずに新しい無菌1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに慎重に移してください。
      2. 2回目の遠心分離
        1. サンプルを2,000 × gで4°Cで15分間遠心分離し、大きな破片、死細胞、アポトーシス性の物体、大きな小胞をペレットします。
        2. ペレットを乱さずに新しい無菌1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに慎重に移してください。
          注意:2回目の遠心分離は任意であり、追加の破片除去が必要な場合は含めるべきです。最初の遠心分離後に上清液が明らかに濁っているか、残留粒子状物質が含まれている場合はこのステップを行います。また、EVで濃縮されたSEC分数において、過去の製剤で細胞内マーカー(例:CalnexinやBiP)による汚染が認められたり、透過式電子顕微鏡で非小胞粒子の存在が確認された場合にもこのステップが推奨されます。このステップの必要性は、各組織タイプに対する初期プロトコル最適化時に検証されるべきです。
      3. ろ過
        1. 事前に湿らせた滅菌30μmの細胞ストレーナーは、RPMI-1640で洗浄して膜を平衡し、サンプル損失を最小限に抑えます。すすぎは捨てましょう。
        2. 各サンプルを事前に湿らせた30μmの細胞ストレーナーに通し、無菌の低タンパク質結合1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに通し、SEC前に残存する細胞残渣や大きな粒子を除去します。
        3. 重力でサンプルをフィルターを通過させます。
        4. 試料ごとに10〜15分をろ過してください。
          注意:ろ過は、ろ過膜の上に目に見える液体が残っておらず、収集管内のろ過液の容積が安定したときに完了します。ろ過が遅くなったり停止した場合、残留ゴミによる詰まりの兆候があります。そのような場合は、明確化の手順を繰り返すか、サンプル負荷を減らすことを検討してください。
        5. 550〜600μLのろ過済み上清液を収集し、その後SECカラムに負荷をかけます。サンプル間の一貫性を確保するために、回収した総体積に関わらず、1カラムあたりの負荷容量を500μLに正規化してください(ステップ2.2.1参照)。
  2. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
    1. 均衡SEC列
      注意:可能であれば遠心分離中にこの工程を行ってください。
      1. SECカラムを17mLの1×PBS(0.22μmフィルター付き)でフラッシュします。
      2. 全体が重力でカラムを通過し、予想流量0.75 mL/min(17 mLのフラッシュ容量で合計20〜25分)にします。流量の速さや低速は、カラムの平衡不良や詰まりを示すことがあります。
      3. 平衡中はカラムとPBSを室温(RT、21°C±2°C)で維持し、流量の安定と最適なカラム性能を確保します。
      4. 低タンパク質結合の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブを準備し、すべての分画を採取します。
      5. 必要に応じて空洞体積の収集用に追加のチューブを用意してください。
    2. 試料の荷込みと洗脱
      1. 500μLのろ過済み上清液をSECカラムに注入します。
      2. サンプルが完全に樹脂に入り込むのを待ちます。液体の半月板が樹脂床の表面に到達し、樹脂の上には液体が残らず、樹脂は目に見える湿った状態のままである時点で終点に達します。
      3. メニスカスが樹脂表面下に沈んだり、カラムが乾燥したりしないと、空気が樹脂床に入り込み、溶出が妨げられます。液体メニスカスが樹脂表面に到達したら(ステップ2.2.2で定義)、直ちにステップ2.2.4へ遅れずに進めてください。
      4. すぐにPBSを2mL加えて溶出を開始します。
      5. 空体量(~2.5 mL)を集めます。
      6. 空の体積を廃棄するか、EV以外の部分として保持してください。
      7. 2.5 mLの空隙体積が溶出された直後にEV濃縮分の採取を開始します。
      8. 空洞体積の後に合計1.6mLのEV濃縮イリュートを採取し、単一の連続画画として1本のチューブにまとめるか、連続して分割して後からプールします。
      9. あるいは、0.4 mLの連続分画を収集して純度と収量のバランスを最適化する方法もあります。より高い純度が必要な場合(例:プロテオミクス分析や感度の高い下流用途など)、より小さい分画が推奨され、EV全体の収量を最大化するためには大きな分画が用いられることがあります。
      10. EV濃縮の比率を評価し、特徴付け方法(例:EVマーカーや汚染物質のウェスタンブロット、NTA)を用いて評価し、特徴付けセクションで定義されたEV濃縮区分をプールします。
        注意:コラムは絶え間なく流れ続けてください。1つの部分が仕上げに近づいたら、樹脂床の上に一定の液体を維持し、カラムが枯渇しないようにPBSを加えます。採取には低タンパク質結合・ヌクレアーゼフリーのチューブを使用してください。
    3. 集中
      1. EVサンプルは遠心フィルター(100 kDa分子量カットオフ[MWCO])を用いて、下流用途(例:RNAシーケンス、プロテオミクス、ウェスタンブロットなど)に用いられます。
      2. 使用前にPBSでフィルターをあらかじめすすぎてください。
      3. 4,000 g× 4°Cで遠心分離し、最終体積(通常50〜100 μL)に達するまで2〜3分ごとにチェックします。より高い濃度が必要な用途では最終体積を低く(例:~50 μL)、回収を最大化したい場合は高容量(例:~100 μL)を用いましょう。
        注意:目標体積に達したら遠心分離を停止して過剰濃度を避けてください。
      4. 優しくピペットで保持液を回収します。
      5. 必要に応じて、濃度前後のサンプル体積を記録して回収を推定してください。NTAは利用可能な場合、濃度の前後の粒子濃度を評価するために使用できます。
    4. 保管
      1. EV濃縮成分は氷上または4°Cで即時アッセイ(例:NTAや透過電子顕微鏡[TEM])に保管し、TEMは24時間以内、NTAは48時間以内に処理します。
      2. Aliquot EVサンプルは低タンパク質結合チューブに保存されます。
      3. 長期使用のためにサンプルは−80°Cで保存します。
      4. 繰り返される凍結と解凍のサイクルは避けましょう。

2. BM由来sEV(BM-sEV)分離プロトコル

  1. サンプル採取と組織解離
    1. 組織の採取と保存
      1. 骨を切除直後にスナップフリーズしないでください。これは骨髄を硬化させ、チューブ穿刺法での抜出を複雑にします。代わりに、骨は処理や冷凍前に氷上または4°Cの扱い期間を短時間で保管し、ステップ3.1.1.4(−80°C保存前のドライアイスへの置き)で説明されています。
      2. 解剖した骨から周囲の筋肉や結合組織を取り除きます。
      3. 骨をクライオビアに移してください。
      4. サンプルをドライアイスの上に置きます。
        注意:サンプルはさらなる処理まで−80°Cで保管してください。
    2. BM処理
      注意:バイオセーフティキャビネット内のすべての工程は、汚染を防ぐために滅菌機器と手袋を使用して行ってください。これによりEVの純度が損なわれる可能性があります。
      1. 材料を加える前に、1.5 mLの遠心分離機チューブを事前に計量しラベルを付けてください。抜歯前後のチューブ重量を比較してBM質量を計算します。
      2. ポケッドチューブの準備は、0.2mLのPCRチューブ(キャップのまま)を1.5mLの遠心分離機チューブにぴったりと挿入して準備します。0.2 mLチューブの底部を、基部に垂直に持った無菌の16G針で一度刺し、直径約1.6 mmの均一な穿孔を形成します。各脚につき、ネズミごとにセットアップを一つずつ用意しましょう。
      3. 筋肉や周囲の組織をすべて除去した脚を無菌のペトリ皿に入れます。
      4. 大腿骨と脛骨を関節間隙を切って分離します。
      5. 大腿骨と脛骨の両端を切って赤骨髄を露出させます。骨を1.5mLチューブ内に位置する穴開きPCRチューブに入れ、パラフィルムで密封して遠心分離中に確実にセットアップします。
      6. 試料を約8,000 × g、または使用機器で可能な限り近い設定で室温で10秒遠心分離します。
      7. 骨髄抽出の成功を以下の3つの基準で確認する:(i) 骨は目に見えて白く、残留赤色の骨髄がない、(ii) 下部管内のペレットは濃赤でコンパクトで、通常は1.5 mLチューブの円錐形の先端を満たしている、(iii) 測定された骨髄質量(ステップ3.1.2.9)がマウスあたり1匹あたり約15〜30 mgの範囲内であること。
      8. 骨の位置を変えたり再切断したりし、赤い骨髄が骨内に残っている場合は短い回転を繰り返します。
      9. 再度チューブを重さて抽出した骨髄の質量(通常は1サンプルあたり約15〜30 mg、マウスの年齢、性別、抽出効率に応じて)を測定します。
        注:このプロトコルは、サンプルあたり1~30 mgの骨髄収量で検証されています。RPMI-1640の懸濁液容量は骨髄質量に関係なく250μLで一定に保たれるため(ステップ3.1.2.10)、EV収量は下流解析時に測定された開始骨髄質量(粒子・mL−1·mg−1 組織)に正規化されます。15mgを大幅に下回るサンプルについては、再懸濁前に同齢、性別、骨を持つマッチマウスの骨髄を採取し、下流特性評価のための十分な入力を維持します。30 mgを大幅に超えるサンプルについては、骨髄を250 μLの別々の再懸濁液に分けて分割するか、RPMI-1640の体積を比例的に(1 mgあたり~12.5 μL)スケールして不完全再懸濁を防ぎます。いずれの場合も、解析時に同じ質量あたり正規化を適用してください。
      10. 各チューブに250μLのRPMI-1640を加えます。骨髄質量に関係なくサンプル間で一定の体積を維持し、EV収率を開始骨髄質量に正規化できるようにします。サンプルは冷蔵保存してください。
      11. P1000ピペットで10〜15回優しく上下にピペットし、懸濁液が均一になり、塊や組織断片が目立たないまで再懸濁させます。小胞の完全性を損なう可能性のある、力強いピペッティングや気泡形成は避けてください。
  2. 破片の除去
    1. 最初の遠心分離
      1. サンプルを300 × gで4°Cで10分間遠心分離し、未消化の残骸、無傷の細胞、残存組織断片をペレットで除去します。
      2. ペレットを乱さずに新しい無菌1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに慎重に移してください。
    2. 2回目の遠心分離
      1. サンプルを2,000× gで4°Cで15分間遠心分離し、大きなゴミを除去します。
      2. ペレットを乱さずに新しい無菌1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに慎重に移してください。
    3. 第三回遠心分離
      1. サンプルを10,000 × gで4°Cで30分間遠心分離し、アポトーシス体や大きな小胞を除去します。
      2. ペレットを乱さずに新しい無菌1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに慎重に移してください。
      3. 最終的な上清液量を200μLに確保してください。
  3. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
    1. カラムの準備
      1. SECカラムを1×PBS(0.22μmフィルター付き)6mLでフラッシュして平衡させます。
        注:平衡体積はカラムごとに異なり、材料表に記載されたカラムタイプと一致している必要があります。このカラムは6 mLの平衡体積を必要とし、これはSkM試料用カラムとは異なります。
      2. 体積全体を重力で通過させてください。
      3. 平衡時にはカラムとPBSをRTで維持し、最適な流量とカラム性能を確保します。
    2. 試料の荷込みと洗脱
      1. 150μLのろ過済み上清液をSECカラムに注入します。
      2. サンプルが完全に樹脂に入り込むのを待ちます。終点は、液体のメニスカスが樹脂床の表面に達し、樹脂が湿ったままの状態で樹脂の上に見える液体が残らない状態(ステップ2.2.2で説明)に到達します。
      3. メニスカスが樹脂表面以下に落ちたり、カラムが乾燥したりしないようにしてください(ステップ3.3.2.2で定義されたエンドポイント参照)。これは樹脂床に空気を導入し、溶出を妨げます。液体メニスカスが樹脂表面に到達したら、直ちにステップ3.3.2.4へ遅滞なく進みます。
      4. すぐに550μLのPBSを加えて洗脱を開始します。
      5. 空波体積(700μL)を集めます。
      6. 空の体積を廃棄するか、EV以外の部分として保持してください。
      7. 700μLの空隙体積が溶出された直後にEV濃縮分の回収を開始します。
      8. 700μLの空隙体積の後に850μLのEV濃縮イリュートを採取します。
      9. あるいは、約170μLの連続的な分画を収集して純度と収量を最適化する方法もあります。
        注:より高純度が必要な場合(例:プロテオミクス解析や感度の高い下流用途など)、より大きな分割はEVの収量を最大化するために推奨されます。
      10. EVマーカーの分率評価を行い、必要に応じてEV濃縮分をまとめます。
        注意:コラムは絶え間なく流れ続けてください。1つの部分が仕上げに近づいたら、樹脂床の上に一定の液体を維持し、カラムが枯渇しないようにPBSを加えます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

このプロトコルの組織由来sEV単離の有効性を評価するために、SkMおよびBMサンプルからの代表的な結果を提示します。成功した分離は、(i) 初期SEC画画における標準的なEVマーカー(TSG101、CD63、CD81、CD9)の濃縮、(ii) 細胞内汚染物質(例:CalnexinやBiP)の最小限の検出、(iii) 大多数の<粒子が200 nmのユニモーダル粒子大きさ分布、(iv) TEMによる完全な膜結合小胞の可視化、(v) EV富集画における後のタンパク質豊富画画よりも高い粒子濃度、という点で定義されました。追加の特徴付けには単一粒子テトラスパニン解析が含まれていました。対照的に、最適でないまたは失敗した分離は、初期分画におけるEVマーカーの濃縮が弱いまたは不在、細胞内汚染物質の大量存在、粒子サイズ分布が広く多様性、または電子顕微鏡による明確な小胞構造の欠如が特徴でした。これらの基準は確立されたsEV特性評価ガイドラインと整合しています。

SkM由来sEV(SkM-sEV)

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

このプロトコルは、低収量で非常に異質な組織であるSkMおよびBMから直接分離する堅牢かつ再現性の高いアプローチを説明しています。バイオフルイドや細胞培養システムではEV分離は確立されていますが、組織解離、細胞内物質からの汚染、収量の変動などの課題により、組織由来EVの標準化された方法は依然として限られています。ここでは、EVの純度、歩留量、再現性に影響を与える重要なステップ、トラブルシューティング戦略、制限事項、特にSkMおよびBM調製に関する考慮事項を概説します。本研究におけるEV濃縮分画は、標準的なEVマーカーの濃縮、細胞内汚染物質の検出が最小限であること、および期待されるSEC洗脱プロファイルとの整合性など、複数の補完的基準に基づいて運用的に定義されました。初期の分画(SkMではF1–F4、BMではF1–F5)が下流解析のために選択され、後期の分画ではEVマーカーが引き続き存在しつつも、タンパク質含有量の増加や細胞内汚染物質のレベル上昇と関連しており、小胞純度の低下を示しました(補足表1

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

技術支援と有益な議論をいただいたジェニー・ヤン、ダリウシュ・ジュラウェク、ヴォロディミル・イェルコに感謝します。特にNadim Tawil氏とLaura Montermini氏の支援をいただいたApplied Nanomedicineプラットフォームの方々に感謝しています。また、動物施設のスタッフ、ガイレイン・ガドゥリーさんとタラ・トムソンさんにも、ネズミの取り扱いに協力してくださったことに感謝いたします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL 遠心管Sarstedt72.690.300プロトコル全体で使用される一般的なマイクロ遠心管
1.5 mL 低蛋白結合管Sarstedt72.706.600EVの取り扱い、SEC分画の収集、および保存に使用
0.2 mL PCR管Fisher Scientific14-222-262ポケットチューブ骨髄抽出セットアップに使用
16 G 針BD3051970.2 mL PCR管に穴を開けるのに使用
30 µm 細胞ストレーナーMiltenyi Biotec 130-098-458骨格筋サンプルのろ過に使用
70% エタノールSigma-Aldrich1.11727ピンセットの滅菌に使用
バイオセーフティキャビネットNANA無菌組織の取り扱いに使用
骨切断器具Fisher Scientific10-001-976大腿骨と脛骨を分離し、骨髄を露出させるために使用
ウシ血清アルブミン (BSA)BioShopALB001ウェスタンブロットブロッキングと抗体希釈に使用
塩化カルシウム二水和物 (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302HEPESバッファの調製に使用
炭素被覆銅グリッド、200メッシュSigma-Aldrich930342TEMサンプルの準備に使用
遠心フィルター、100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096EV濃縮に使用
コラゲナーゼ DRoche11088858001骨格筋の酵素消化に使用
クライオバイアルSarstedt72.690.300組織と骨の保存に使用
脱イオン水（超純水）NANAバッファの調製とTEM洗浄ステップに使用
DNase IRoche11284932001骨格筋の酵素消化に使用
ドライアイスNANAサンプルの冷却と輸送に使用
エンハンスド化学発光基質Biorad1705061ウェスタンブロット検出に使用
フィルターユニット、0.22 µmSarstedt83.3941.501適用可能な場合にPBSをろ過するために使用
鉗子 / ピンセットMilliporeSigmaF3892組織の取り扱いに使用
グルタールアルデヒドNANATEM固定に使用
グリシンNANATEMグリッド洗浄ステップで使用
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095DNase I ストック調製に使用
HEPESBioShopHEP001.500HEPES-NaOH バッファ調製に使用
ホルシュラジッシュペルオキシダーゼ結合ストレプタビジンThermo FisherS911ウェスタンブロット検出に使用
化学発光イメージングシステムBiorad12003153ウェスタンブロット膜のイメージングに使用
KClBioShopPOC308HEPESバッファの調製に使用
塩化マグネシウム (MgCl2)BioShopMAG510.500HEPESバッファの調製に使用
2-メチルブタンThermo Fisher78-78-4骨格筋のスナップフリージングに使用
ミリグラムバランスMilliporeSigmaZ741359組織と骨髄の重量測定に使用
NaClBioShopSOD004.1HEPESバッファの調製に使用
ナノ粒子追跡分析装置Malvern PanalyticalNanoSight NS300ナノサイト NS300は粒子のサイズ測定とカウントに使用
NaOHBioShopSHY500.500pH調整に使用
ニトロセルロース膜BioRad1704271ウェスタンブロット転写に使用
回転ミキサーLabnet S0500酵素消化中に使用
P1000 ピペットMilliporeSigmaFA10006M-1EA組織移送に使用
ピペットチップ、1 mLSarstedt70.3050.275チップは組織フラグメントの移送のために開口部を広げるようトリミング
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)WisentINC 811.012-FLプロトコル全体で使用、SEC平衡化と溶出にも使用
ホスファターゼ阻害剤MilliporeSigma4906845001ウェスタンブロット溶解液調製に使用
ペトリ皿MilliporeSigmaCLS351146骨髄の調製に使用
ポリアクリルアミドゲル、4–20% 勾配ステインフリーBioRad4561094ウェスタンブロット分離に使用
プロテアーゼ阻害剤MilliporeSigma11697498001ウェスタンブロット溶解液調製に使用
RPMI-1640 培地Sigma-AldrichR7388-500ML非添加; FBSや抗生物質なし
RIPA バッファ、10×Merck20-188ウェスタンブロッティング用タンパク質抽出に使用
滅菌使い捨てスカルペルUltident Paragon02-90000-10骨格筋組織を細かく切るために使用
SEC カラム、オリジナル 70 nmIZONICO70P骨格筋 SEC に使用
SEC カラム、シングル 70 nmIZONICS70P骨髄 SEC に使用
アジ化ナトリウムSigma-AldrichS2002洗浄用 PBS に添加
ナトリウムカコジル酸バッファNANATEM固定バッファに使用
ルアースリップ使い切り注射器（針なし）MedlineSYR101020適用可能な場合、NTA取得中に使用
透過型電子顕微鏡FEINATecnai G2 Spirit Twin 120 kV Cryo-TEMは TEM イメージングに使用
Tween-20

参考文献

  1. Whitham, M., et al. Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise. Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).
  2. Kumar, M. A., et al. Extracellular vesicles as tools and targets in therapy for diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 27 (2024).
  3. Fonseka, P., Mathivanan, S. Extracellular vesicles biogenesis, cargo sorting and implications in disease conditions. Cells. 12 (2), (2023).
  4. Taraboletti, G., et al. Bioavailability of VEGF in tumor-shed vesicles depends on vesicle burst induced by acidic pH. Neoplasia. 8 (2), 96-103 (2006).
  5. Dakup, P. P., et al. Challenges and opportunities in state-of-the-art proteomics analysis for biomarker development from plasma extracellular vesicles. Proteomics. , (2025).
  6. Li, Y., et al. EV-origin: Enumerating the tissue-cellular origin of circulating extracellular vesicles using exLR profile. Comput Struct Biotechnol J. 18, 2851-2859 (2020).
  7. Shero, J. A., Lindholm, M. E., Sandri, M., Stanford, K. I. Skeletal muscle as a mediator of interorgan crosstalk during exercise: Implications for aging and obesity. Circ Res. 136 (11), 1407-1432 (2025).
  8. Vanhie, J. J., et al. The role of exercise- and high-fat diet-induced bone marrow extracellular vesicles in stress hematopoiesis. Front Physiol. 13, 1054463 (2022).
  9. Pinto, A. C., et al. Exploiting the therapeutic potential of contracting skeletal muscle-released extracellular vesicles in cancer: Current insights and future directions. J Mol Med (Berl). 102 (5), 617-628 (2024).
  10. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  11. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835 (2023).
  12. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145 (2021).
  13. Ahmadian, S., et al. Different storage and freezing protocols for extracellular vesicles: A systematic review. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 453 (2024).
  14. Watanabe, S., et al. Skeletal muscle releases extracellular vesicles with distinct protein and microRNA signatures that function in the muscle microenvironment. PNAS Nexus. 1 (4), pgac173 (2022).
  15. Magalhaes-Gama, F., et al. Exploring cell-derived extracellular vesicles in peripheral blood and bone marrow of B-cell acute lymphoblastic leukemia pediatric patients: Proof-of-concept study. Front Immunol. 15, 1421036 (2024).
  16. Potter, D. R., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles attenuate pulmonary vascular permeability and lung injury induced by hemorrhagic shock and trauma. J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 245-256 (2018).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Org Biomol Chem. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Kim, T., Hong, J. W., Lee, L. P. Efficient methods of isolation and purification of extracellular vesicles. Nano Converg. 12 (1), 45 (2025).
  19. Bracht, J. W. P., et al. Choice of size-exclusion chromatography column affects recovery, purity, and miRNA cargo analysis of extracellular vesicles from human plasma. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (3), 497-508 (2024).
  20. Mo, W., et al. Extracellular vesicle-mediated bidirectional communication between the liver and other organs: Mechanistic exploration and prospects for clinical applications. J Nanobiotechnology. 23 (1), 190 (2025).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。