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本研究は河北省総合病院倫理委員会(承認番号:2025-LW-0265)により承認されました。研究の後ろ向き性質により、匿名化された臨床データを用いる非介入研究委員会の許可を得て、データ収集期間後に倫理承認が下されました。書面によるインフォームドコンセントの要件は免除されました。
参加者選考
潜在的な参加者は、2022年7月から2024年5月にかけて河北省総合病院の腎臓科から募集されました。すべての患者は、あらかじめ定められた納入・除外基準に従ってスクリーニングが行われました。
選定基準は以下の通りです:MogensenステージIII23における糖尿病性腎症(DN)と診断され、持続性アルブミン尿と定義され、3〜6か月間に採取した3つのスポット尿サンプルのうち少なくとも2件で尿中アルブミン対クレアチニン比(UAlb/UCR)が認められ、血尿や非糖尿病性腎疾患を示唆する急激な腎機能低下なし;CKD-EPI式を用いて推定糸球体濾過率(eGFR)≥45 mL/min/1.73 m²);ビタミンD、プロブコール、免疫抑制療法の既往なしにDNの初診;年齢<75歳;また、糖尿病性ケトアシドーシスや高血糖高浸透圧状態などの急性糖尿病合併症、または登録前4週間以内の活動性重篤な感染症のない臨床的に安定した状態。登録に腎生検は必要ありませんでした。ただし、活動性尿沈殿物、急速に進行する糸球体腎炎、全身性自己免疫疾患を含む非糖尿病性腎疾患の疑いがある患者は除外されました。
除外基準には、悪性腫瘍、重度心血管疾患、自己免疫疾患などの重篤な全身疾患が含まれていました。ビタミンD、プロブコール、バルサルタン、アトルバスタチン、インスリンに対する既知のアレルギー;妊娠や授乳;および免疫抑制剤やコルチコステロイドを含む、研究結果に干渉する可能性のある薬剤の4週間以内の最近の使用。
グループ配分
スクリーニング医師は適格性確認まで最終グループ割り当てを盲検したままでした。
年齢、性別、糖尿病およびDNの期間、高血圧または高脂血症の既往など、基礎的な人口統計学的および臨床的特徴を記録しました。
本研究は後ろ向きの非ランダム化比較モデルを用いています。選択バイアスを最小限に抑え、時間的変化や医師関連の変動性などの交絡因子に対応するため、グループ配分は医師や患者の好みではなく、入院順に基づきました。
2022年7月から2023年12月に入院した患者は、バルサルタン、アトルバスタチン、プロブコールからなる標準的な三剤療法を受け、対照群に割り当てられました(n=56)。2024年1月から5月の間に入院し、4回療法(バルサルタン、アトルバスタチン、プロブコール、ビタミンD)を受けた患者が観察群に割り当てられました(n = 94)。
観察群の患者数増加は、2024年初頭から研究センターで補助的ビタミンD療法の臨床応用が増加したことを反映しており、これは新たな証拠の進展に伴います。ベースラインの人口統計学的特徴および臨床的特徴はグループ間で比較可能でした(表1;P>0.05)であり、診断基準、検査方法、医師チーム構成に有意な変更はなかった。
治療の施行
すべての参加者は、8か月間の研究期間を通じて、血糖コントロールのための標準化された1日皮下インスリン注入レジメンを受けました。インスリン用量は、日々の毛細血管血糖モニタリングに基づいて個別に調整されました。対照群の患者は、バルサルタン(空腹時に1日1回80mg)、アトルバスタチン(1日1回20mg)、プロブコール(250mg、1日2回)を8か月間投与しました。観察群の患者は、同じ用量とスケジュールでバルサルタン、アトルバスタチン、プロブコールのレジメンを投与し、毎日の経口ビタミンD補給も行いました。
ビタミンDの用量は、登録時に測定した基線血清25-ヒドロキシビタミンD[25(OH)D]レベルに基づいて電気化学発光免疫測定法(ECLIA)を用いて決定されました。ビタミンDの充足性は25(OH)D ≥30 ng/mL)、不十分は20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL)、欠乏は25(OH)D <20 ng/mLと定義されました。欠乏予防のための補給を受けた患者には1日あたり600〜800 IUが投与され、ビタミンD不足または欠乏が確定した患者には1日あたり2000 IUが投与されました。
安全監視および停止基準
8か月間の治療期間中の参加者の安全性を確保するため、血清カルシウム、リン、副甲状腺ホルモン(PTH)のレベルをベースラインおよび4週間ごとに測定し、ビタミンD誘発性高カルシウム血症およびカルシウム・リンのバランスをモニタリングしました。ベースラインおよび8か月後に12誘導心電図(ECG)を実施し、プロブコールに関連するQTc間隔延長を評価する。ベースラインQTc≥男性450ms、女性≥460msの患者では、心電図は1か月目に再度実施されました。
血清クレアチニンやeGFRを含む腎機能パラメータ、血清電解質を最初の1か月およびその後月1か月間は隔週でモニタリングしました。参加者には新たな症状を直ちに報告するよう指示されました。治療中止基準には、48時間以内の再検査で確認された補正血清カルシウム>10.5 mg/dL(2.62 mmol/L)、QTc間隔>500ms、または2回連続した心電図でベースラインから>60ms増加;腎疾患:グローバルアウトカム改善(KDIGO)基準に基づく血清クレアチニンのベースラインからの倍増または急性腎障害の発症;およびビタミンDまたはプロブコールに関連する可能性のある、おそらく、または確実に関連すると考えられる、または確実に関連すると考えられる、CTCAE(CTCAE)に基づくグレード≥3の有害事象。重篤な有害事象は24時間以内に病院倫理委員会に報告されました。
生物サンプルの採取と処理
血液および尿サンプルは治療開始前および8か月間の治療期間終了後に採取されました。すべてのサンプルは、8〜12時間の夜間断食後の翌朝に採取されました。約20mLの静脈血を標準的な採血技術で血清分離器およびEDTAチューブに採取しました。血液サンプルは室温で30分間凝固させ、1000 × g で4°Cで15分間遠心分離しました。 透明な血清上清液は、血栓やバフィーコートを乱さないまま慎重に吸引され、異なるアッセイ用のクライオバイアルに分割され、参加者ID、日付、サンプルタイプをラベル付けし、−80°Cで分析まで保存されました。血清サンプルは−80°Cで最大12か月間保存可能でした。
24時間尿たんぱく質排出(24時間UPE)では、参加者は1日目の午前7時に最初の尿サンプルを廃棄し、その後、2日目の午前7時の最初の尿サンプルを含む全ての尿を、用意された採取容器に採取しました。参加者は収集期間中、収集容器を冷蔵保存するよう指示されました。尿量の総量を記録し、徹底的に混合し、検査室分析のためにアリクォート(分割)を行った。サンプルは24時間以内に分析した場合は4°Cで保存され、後で分析するために−20°Cで保管されました。
尿アルブミン対クレアチニン比(UAlb/UCR)については、初日の午前中の尿サンプルを滅菌容器で採取し、同様に処理しました。同じ手順は8か月間の治療期間終了後も繰り返し行われました。
生化学的および臨床パラメータ解析
凍結血清サンプルは、血清クレアチニン(SCr)分析前に氷上または4°Cで解凍されました。SCrは、製造元の指示に従い、自動生化学分析装置上の酵素比色測定法を用いて測定されました。日々の校正は多層校正器を用いて行われ、各バッチには2段階の市販品質管理材料が含まれていました。サンプルは二重に分析され、変動係数>5%のアッセイが繰り返し行われました。SCrの下限検出限界は2.0μmol/Lでした。
24時間尿アリコート中のタンパク質濃度はピロガロール赤モリブート法を用いて測定しました。サンプルは重複分析され、各ランに品質管理材料が含まれていました。校正範囲(>3.0 g/L)を超えるサンプルは生理食塩水で希釈され、再評価されました。24時間のUPEは尿中のタンパク質濃度と総尿量を用いて計算されました。
初日の尿検査から尿中のアルブミンおよびクレアチニン濃度を生化学分析装置で測定し、その後UAlb/UCR比を計算しました。
製造元の指示に従い、検証済みの血糖計と毛細血管指点血サンプルを用いて、空腹時血漿グルコース(FPG)および食後2時間血糖値(2h-PPG)を測定しました。
糖化ヘモグロビン(HbA1c)は高性能液体クロマトグラフィーと専用のHbA1c分析システムを用いて分析されました。参加者には、治療後の採血の7日間は脂質低下薬の服用を避け、24時間は高脂肪の食事やアルコールを避けるよう指示されました。血清総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)、高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-C)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)を酵素アッセイを用いて測定しました。2段階の品質管理材料が毎日分析されました。脂質パラメータは最初にシングリケートで測定され、変動係数>10%のサンプルは重複して再評価されました。検出限界は、TCで0.1 mmol/L、TGで0.05 mmol/L、HDL-Cで0.08 mmol/L、LDL-Cで0.10 mmol/Lでした。LDL-C値は直接アッセイまたはトリグリセリドレベルが<400 mg/dLの場合のフリーデヴァルト方程式によって決定されました。
免疫機能と炎症マーカー解析
血清免疫グロブリンG(IgG)濃度は市販のヒトIgG ELISAキットを用いて測定されました。アッセイ検出範囲は1.37〜1000 ng/mL、感度は0.52 ng/mL、アッセイ内変動係数は<6%、アッセイ間変動係数は<9%でした。すべてのサンプルは重複分析され、各プレートには高品質・低品質管理物質が同梱されました。QC値が目標値から2標準偏差外のプレートは却下され、繰り返し検査されました。上限を超えるサンプルは1:2で希釈され再評価されました。
すべての試薬と血清サンプルは分析前に室温に平衡化されました。血清サンプルはキットの指示に従って希釈され、通常は1:100,000の希釈で行われました。標準サンプル、希釈サンプル、ブランク(100μL)を適切な事前にコーティングされたマイクロプレートのウェルに加え、37°Cで90分間インキュベートしました。ウェルは37°Cで60分間、ビオチニル検出抗体で洗浄され、インキュベートされました。 追加の洗浄後、ホースラディッシュの過酸化酵素結合液を加え、暗闇で30分間培養しました。洗浄後、基質溶液を加え、混合液を暗闇で15分間培養した後、停止液を加えました。光密度は450 nmで測定され、基準波長は570 nmまたは630 nmでした。IgG濃度を計算するために標準的な曲線が生成されました。
リンパ球のサブセットは、488nmおよび640nmレーザーを搭載したBD FACSCanto IIを用いたフローサイトメトリーで解析されました。順方向散乱電圧は300V、横散乱は350V、FITCチャンネルの光電子増倍管電圧はそれぞれ400V、550V、480Vに設定されました。ダブレットはFSC-AとFSC-Hゲーティングを用いて除外しました。
7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)を用いた生存可能性染色を行い、7-AAD陰性イベントのみを解析しました。全血サンプルは染色されていない、アイソタイプコントロール、試験管に分散されました。抗ヒトのCD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE抗体が試験管に追加され、対照チューブにはマッチしたアイソタイプ対照抗体が添加されました。サンプルは室温の暗闇で30分間培養されました。補償制御はBD CompBeadsで作成され、自動補償はFACSDivaソフトウェアで実施されました。赤血球は赤血球溶解バッファーで溶解され、その後洗浄されて7-AADを含む染色バッファーに再懸浮させられました。
品質管理には日々のサイトメーター設置と追跡ビーズが使用されました。ゲーティング階層には、ダブレット排除、リンパ球選択、生存ゲーティング、CD3+ゲーティング、CD4/CD8サブセット同定が含まれていました。1サンプルあたり少なくとも5万件の生リンパ球イベントが取得され、総獲得イベントは10万件から15万件の範囲でした。データはFlowJoソフトウェアを用いて分析され、CD3+、CD4+、CD8+の細胞の割合とCD4+/CD8+比率を計算しました。
市販のELISAキットを用いて血清のhs-CRP、IL-6、TNF-α、MCP-1濃度を測定しました。検出範囲および感度は以下の通りです:hs-CRP(0.07–12.5 ng/mL;感度0.022 ng/mL)、IL-6(0.7–300 pg/mL;感度0.35 pg/mL)、TNF-α(1.6–100 pg/mL;感度0.8 pg/mL)、およびMCP-1(5–1000 pg/mL;感度2.5 pg/mL)。すべてのアッセイは重複して実施されました。すべてのプレートには低品質および高品質の管理材料が含まれていました。アッセイ内の変動係数は<8%、アッセイ間変動係数は<10%でした。検出限界以下の値は定量下限の半分として記録され、最高基準を超える値は希釈されて再評価されました。サンプルは分析前に1回の凍結・融解サイクルのみを経ました。サイトカインELISAの手順は、希釈因子、培養条件、温度に関する製造元の指示に従い、IgG ELISAと同様のプロトコルに従って行われました。
臨床アウトカム評価とデータ管理
8か月間の治療期間終了時には、グループ割り当てを盲検にした主治医が参加者の臨床状況を評価しました。患者は、糖尿病性腎症の事前定められた臨床改善基準が少なくとも2週間連続で満たされた場合、退院者と分類されました。すなわち、24時間UPEでベースラインと比較して≥30%の減少、eGFRの安定化または改善(ベースラインからの減少<5 mL/min/1.73 m² )、および急性糖尿病合併症やその他の継続入院治療を必要とする状態の不在。すべての基準を満たさなかった参加者は退院不可と分類されました。その後、各群の臨床反応率が計算されました。
収集されたすべての人口統計、検査、臨床データは、2人の独立した研究者による二重データ入力を用いて電子データベースに入力されました。データの正確性を確保するために、射程チェックと整合性チェックが実施されました。主要評価項目には、24時間UPEおよびUAlb/UCRを含む腎機能パラメータのベースラインから8か月への変化、および免疫機能パラメータ(CD3+ T細胞パーセンテージおよびCD4+/CD8+比を含む)が含まれていました。副次的評価項目には、血糖値(FPG、2h-PPG、HbA1c)、脂質プロファイル(TC、TG、LDL-C、HDL-C)、炎症マーカー(hs-CRP、IL-6、TNF-α、MCP-1)および臨床反応率の変化が含まれていました。すべてのアウトカム指標は、治療開始48時間前および8か月治療終了後1週間以内のベースラインで評価されました。
統計解析
すべての統計解析はSPSSソフトウェアを使用して実施されました。正規分布の連続変数は平均±標準偏差で表され、カテゴリ変数は頻度とパーセンテージで表されました。独立標本t検定は群間比較に、カイ二乗検定はカテゴリ変数に用いられました。統計的有意性はP<0.05と定義されました。研究の探索的性質と多数のアウトカムが評価されたため、二次アウトカムは多重性を調整しませんでした。したがって、P値は確認的ではなく記述的と考えられていました。後ろ向き非ランダム化研究デザインのため、対照群と観察群間の比較は潜在的な交絡因子を未調整で、残留交絡が残っている可能性があります。全150名の登録患者(対照群56名、観察群94名)は8か月間の治療および追跡期間を全て完了しました。追跡、撤退、または登録後に除外された患者はいませんでした。腎機能、グルコースおよび脂質プロファイル、免疫マーカー、炎症因子などのベースライン特性やアウトカム指標に関する欠落データは特定されませんでした。したがって、補完手続きは必要ありませんでした。