本研究では、グリーン合成CuO/ZnOハイブリッドナノ粒子がトウモロコシ中のアフラトキシンB1 (AFB1)蓄積および転座を減少させる効果を調査し、125 mg/kgの処理がAFB1 レベルを有意に低下させ、人間および動物の食事曝露リスクを最小限に抑えたことを示しました。
研究記事
本研究では、グリーン合成CuO/ZnOハイブリッドナノ粒子がトウモロコシ中のアフラトキシンB1 (AFB1)蓄積および転座を減少させる効果を調査し、125 mg/kgの処理がAFB1 レベルを有意に低下させ、人間および動物の食事曝露リスクを最小限に抑えたことを示しました。
アフラトキシンB1 (AFB1)は 、アスペルギルス 属が産生する強力な発がん物質で、トウモロコシ作物を汚染し、食事への曝露によって人間や動物に深刻な健康リスクをもたらします。従来の収穫後の管理や化学的介入は、成長中に土壌由来の毒素の植物への移動を防ぐのにコストがかかったり効果が薄いことが多いです。このプロトコルの主な目的は、グリーン合成銅酸化物/酸化亜鉛酸化物(CuO/ZnO)ハイブリッドナノ粒子(NP)を持続可能な収穫前の土壌改良物として評価することでした。この研究は、これらのNPがトウモロコシ組織内でAFB1 の移座と蓄積を効果的に抑制し、食用穀物における毒素の蓄積を減らすかどうかを明らかにすることを目的としました。2つの異なる圃場地点にまたがるランダム化完全ブロック設計を用いて、トウモロコシはAFB1 または アスペルギルス・フラバス 胞子で接種され、異なる濃度のNPs(0–125 mg/kg)で処理されました。このプロトコルでは、環境に優しい環境性を確保するために Pleurotus ostreatus 基質を用いたグリーン合成が用いられました。植物組織は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて異なる生理段階で分析し、AFB1 レベルを測定し、人間および家畜のリスク評価を算出しました。125 mg/kgのグリーンハイブリッドNPsによる治療(p < 0.05)により、すべての成長段階でAFB1 濃度が低下しました。キャンパス内のサイトでは、AFB1 は栄養期で68%、開花期で82%、成熟時に76%減少しました。重要なのは、穀物AFB1 のレベルが6.91 ppbに低下し、人間の推定1日摂取量を大幅に減少させたことです。しかし、潜在的なナノ粒子残基や長期的な毒性を評価するにはさらなる研究が必要です。この方法は、緑色のCuO/ZnOハイブリッドNPが効果的なバイオレメディエーション剤として機能し、植物の食用部位への毒素輸送を防ぐことを示しています。このアプローチは、アフラトキシン多発地域における食料安全保障を強化し、AFB1 曝露を軽減するための拡張可能で環境に安全な戦略を提供します。
アフラトキシン、特にアフラトキシンB1(AFB1)は、その有病率、毒性、そして人間への影響から、最も重要なマイコトキシンの一つです。これらは主にアスペルギルス属1,2,3に属する特定の菌類によって産生されます。AFB1は肝細胞がんと関連しており、すべてのアフラトキシンの中で最も危険なものです。これらの強力な発がん性物質はトウモロコシ(Zea mays L.)を含むさまざまな農作物に感染し、深刻な食品安全上の懸念を引き起こしています。トウモロコシ中のAFB1の存在は作物の収量や品質に影響を与えるだけでなく、食事曝露を通じて人間と動物の健康に深刻な脅威をもたらします7,8。
現在、アフラトキシンの管理は主に収穫後の戦略に依存しており、適切な乾燥、損傷した粒の選別、化学処理(例:アンモニアやオゾン)、照射、そして保管中の真菌増殖を防ぐ密閉保存などです。戦略には、良好な作物管理、生物防除剤(石灰など)、貯蔵施設の改善が含まれます。マイクロ波、紫外線(UV)、パルス光、電解水、冷プラズマ、オゾン、電子ビーム、ガンマ線照射などの物理的・化学的処理も試験されています。しかし、これらの収穫後の方法は高コストでエネルギーを消費する場合が多く、広く使用するには非現実的であり、成長中の植物内でのアフラトキシン移動を防ぐことはできません。
収穫前のアプローチとしては、抵抗性品種の栽培、適時の植え付け、干ばつストレス軽減のための灌漑、そしてアフラトキシ生成系A. flavus株(例:Aflasafe)による生物防除が含まれます。これらは毒素発生株を競争的に排除しますが、繰り返し施布が必要で土壌移動を完全には解決できない可能性があります。11,12,13.これらの方法はしばしば制約に直面します。収穫後の介入は既存の汚染を逆転させることができず、資源が限られた環境での選別・貯蔵インフラに高額なコストがかかること、化学物質による栄養素の損失や残留物のリスクがあり、生物防除の効果は環境条件によって変動します。
これに対し、グリーン合成されたCuO-ZnOハイブリッドナノ粒子は、収穫前の土壌改良戦略として新しいアプローチを提供します。従来の化学的天然天然植物とは異なり、植物抽出物(例:キノコ基質)を用いたグリーン合成は有害溶媒を避け、コストを削減し、生体適合性を高めるため、環境的に持続可能な製品となります15,16。CuO-ZnOのハイブリダイゼーションは、活性酸素種(ROS)を生成し、真菌膜を破壊し、AFB1吸着のための大きな表面積を提供することで抗真菌活性を相乗的に高め、穀物などの食用植物部位への取り込みや移動を防ぎます。これは既存の戦略とは異なり、土壌と植物の界面での早期介入を可能にし、低用量(例:125 mg/kg)で作物収量を損なうことなく最大80〜99%のAFB1削減を実現できます。17。主な利点には、化学殺菌剤と比較した環境に優しいこと、単一金属NPや多様な畑条件下での生物防除に対する優れた有効性、そしてサハラ以南アフリカのようなアフラトキシン発生地域での農業実践への拡張可能な統合の可能性があります。
金属酸化物NP、特に酸化亜鉛(ZnO)および酸化銅(CuO)は、抗真菌特性と毒素吸収能力からこれらの材料の間で注目を集めています18,19。例えば、Cu NPsはROSを生成する能力があり、細菌や真菌の生物的高分子に害を及ぼす可能性があると報告されています20。また別の実験では、F. Solaniをキトーサン系CuO自然分解剤で処理した際、菌株は序列数の増加に向かう顕著なシフトを示し、最大の秩序効果21を生み出しました。NPのグリーン合成は、従来の化学手法に比べてより安全かつ持続可能な代替手段として注目を集めており、有害な副産物や環境への影響を最小限に抑えることができます。
CuOとZnO NPのハイブリダイゼーションは両金属の有益な特性を組み合わせ、分解や吸着の有効性を高める可能性があります AFB123,24。現在、これらのグリーン合成NPは主にin vitro実験における真菌株のAF産生制御に用いられています。例えば、シークとアワドは、アフラトキシ生成性A. flavus株のAgNPs、AuNPsおよびそれらの混合物が、アフラトキシ生成性A. flavus株の成長およびアフラトキシンB1蓄積に与える影響を研究しました。しかし、A. flavusの増殖を制御するために必要な濃度は不明です。したがって、土壌改変源からトウロモロコシ組織へのAFB1移座に対する緑色のCuO-ZnOハイブリッドを従来のNPと比較して評価する重要な必要性があります。したがって、本研究の目的は、異なるCuO/ZnO緑色ハイブリッドNPの濃度がトウモロコシ植物組織中のAFB1/A. flavus濃度に与える影響を明らかにし、AFB1のリスクを評価することでしたトウモロコシをCuO/ZnOのグリーンハイブリッドNPで処理した後の研究仮説は、グリーン合成CuO-ZnOハイブリッドNPの観察される有効性のメカニズム的基盤を提供するものでした。本研究は以下の測定可能な仮説を検証します。1) 抗真菌抑制仮説、すなわちハイブリッドNPが単一金属NPと比較して土壌中のA. flavus胞子形成およびその後のde novo AFB1産生を有意に減少させるというもので、モレルワネ部位での真菌負荷と毒素レベルが低いことが示される。2) 吸着-転座仮説:既存の毒素(キャンパスサイト)が存在することで、NPsはAFB1に対して高い結合親和性を示し、土壌からトウモロコシの根系への毒素移動速度を有意に低下させるとされました。3) 生体適合性(植物毒性)仮説:グリーン合成ハイブリッドNPsが従来の化学ベンチマークと比較してトウウロコシ組織における残留金属蓄積を低減し、酸化ストレスマーカーを低減させることで、作物のバイオセーフティを高めるというもの。
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実験施設
試験は7km離れた2か所で実施されました。各部位には異なる治療法が施されました。最初の試験では、南アフリカ北西州のモレルウェーン、ノースウェスト大学(NWU)研究農場(25.810°S, 25.630°E、1276 m)に40%日陰のネットハウス施設が設置されました。赤砂ローム土壌はハットン型に分類され、砂75%、シルト4%、粘土25%25が含まれていました。2回目の実験はNWUマフィケングキャンパス(南緯25度8278度、東経25度、東経25度、1276m)のネットハウス施設で行われました。2番目の地点の土壌は砂質ロームで、砂82%、シルト3%、粘土15%で、以前はアルカディアフォーム25に分類されていました。CuO/ZnOのグリーンハイブリッドNPは、南アフリカNWU自然農業科学部物理化学科の化学科実験室で合成されました。
CuO/ZnOグリーンハイブリッドNPの合成
乾燥した Pleurotus ostreatus の用済みキノコ基質(SMS)を100 mLの脱イオン水に加え、70°Cで加熱し、2時間26分かき混ぜました。混合物は室温まで冷却されろ過され、30mLのろ過液を酢酸銅2.5gと酢酸亜鉛2gを蒸留水30 mLの溶液に加えました。この溶液のpHは水酸化ナトリウム(NaOH)で8に調整され、80°Cまで2時間加熱、反応後に遠心分離、オーブンで一晩乾燥、650°Cで2時間26分焼成されました。合成されたNPはCuO/ZnOグリーンハイブリッドNPとして特徴付けられ確認されました。
土壌サンプリングと分析
モレルウェイン大学農場およびキャンパス試験現場から、0–15cmおよび15–30cmの深さで土壌サンプルが採取されました。その後、27号誌によって物理的・化学的特性が分類・調査されました。
実験設計
本研究は、3回の重複を用いるランダム化完全ブロックデザイン(RCBD)の因子実験を用いました。多様な汚染シナリオ下でのグリーン合成CuO-ZnOハイブリッドNPの有効性を評価するため、別々のサイトで2つの独立した曝露モードが確立されました。サイト1(ノースウェスト大学キャンパス)は、外因性汚染モデルを示し、抽出されたAFB1 を160 ppb/kgの速度で土壌にスパイクし、NPsの直接吸着および転座遮蔽能力を評価しました。サイト2(モレルウェーン研究農場):生物学的感染モデルとして、土壌に160個の胞子/kgでA . flavus 胞子を接種し、NPsが 新規 マイコトキシンの産生およびその後の植物取り込みに与える抗真菌効果を調査しました。粉末状のNPは、接種後に1kgの土壌と均一に混合され、植栽用のビニール袋に入れられました(AFB1 または A. flavus 胞子)。各治療は別々に行われ、手は治療間に消毒されました。その後、最初に各鉢に4粒のトウモロコシの種(上部直径9cm、底部直径6.5cm)を植えました。1鉢につき健康な苗を3本保つため、苗は出芽から1週間後に剪定されました。土壌分析から得られた最適なトウモロコシ生産の推奨に従い、土壌は肥料が施されました。鉢は列間および列内間隔で0.75m×0.3mに配置され、合計216鉢が設置されました。種まき後、鉢植えの土は60%の畑容量まで水やりしました。土壌および植物のサンプルは、V10(発育)、R1(開花)、R6(成熟)の3つの発育段階で採取されました。その後、サンプルは氷で満たされたクーラーボックスに入れて研究所に運ばれ、さらに検査のために-20°Cの温度で保管されました。茶色の紙袋で残りの植物サンプルを保存・深凍し、AFB1 濃度やその他のアッセイに用いられました。残りの植物サンプルはAFB1 濃度やその他の分析のために茶色の紙袋に入れて冷凍保存され、分析が行われました。
トウモロコシアフラトキシン分析
トウモロコシの発育成分(根、茎、葉、穀物)は、さまざまな成長段階で滅菌プラスチック袋に集められ、丁寧にラベルを付けて研究室へ運ばれました。成長データの完全性を維持し、各発達段階ごとに独立した観察を確保するために、破壊的サンプリングプロトコルが実施されました。ナノ粒子濃度と接種タイプ間の交差汚染を排除するため、収穫用ツールと手袋は70%エタノールで洗浄され、各処理グループごとに脱イオン水で洗浄されました。乳鉢と乳棒を使い、植物材料10gと塩化ナトリウム1g(NaCl)を80%メタノールと20%蒸留水の25mLに10分間粉砕しました。トウモロコシ粒およびトウモロコシコアについては、25gの粉末サンプルと2.5gのNaClを80%メタノール:20蒸留水100mLと高速で10分間ブレンドしました。その後、均質化された抽出物はガラスマイクロファイバーフィルターでろ過され、その後リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で20mLの20% Tween-2を洗浄しました。アフラトキシンは、1秒間に1滴の流速で洗脱後、免疫親和性カラムから抽出され、上清液(細胞質)は琥珀状のバイアルに収集されました。その後、AFB1 およびその他のアフラトキシンは、o-フタルジアルデヒド溶液でアフラトキシンを誘導化し、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)システムに注入する液体クロマトグラフィー法28 に従って測定されました。HPLCシステムには、362nm励起、425nm放射に設定されたJasco FP-920蛍光検出器が装備されていました。AFB1 は本質的に362 nmの励起波長で検出されるよう生理学的に構造化されていました。5μm粒子を用いたヒクロムカラム(4.6 mm × 150 mm)が使用され、誘導反応器は100 μAのKOBRAセルプログラムでした。クロマトピークの分離は、同様の固定相の前カラムを取り付けたヒクロムカラム内で行われました。Inertsil ODS-3とODS-3 Vはそれぞれガードカートリッジと分析カートリッジとして使用され、インジェクターはレオダインバルブを備えたオートサンプラーで構成されていました。移動相は水で構成されており、メタノール(65:35、v/v)、臭化カリウム(119 mg)、および4 M硝酸(350 μL)/リットルで、1.0 mL/minの流量で等分流でポンプされました。アフラトキシン検出は、各ピークに対して各標準と同様の保持時間で陽性と見なされ、基準ノイズの5倍の高さで評価されました。
検出限界(LOD)、定量限界(LOQ)、および回収率(%)を計算し、それぞれ式1、2、3を用いてHPLCの解析手法を検証しました。LODは背景雑音から確実に区別できる最も低いアフラトキシン濃度であり、LOQは許容される精度と精度で定量的に測定可能な最低濃度です。AFB1 およびその代謝物は、陰性トウモロコシ対照サンプルに10μLの総アフラトキシン標準物質(AFB1、AFB 2、AFG1、AFG2)を三重に添加することで回収されました。サンプルは前述の手順を用いてHPLCで抽出されました。
LOD = X + 3s 1
LOQ = X + 10s 2
3
ここで、「X」は強化サンプルのブランク値の平均濃度、「s」はサンプル標準偏差を表します。
AFB1曝露推定
トウモロコシの食事中の平均アフラトキシン濃度、1日のトウモロコシ摂取量、平均体重(子供、成人、肉牛、乳牛、ヒヨコ)を用いて推定1日摂取量(EDI)を算出しました。平均アフラトキシンのEDIは式2に従って計算され、(ng/kg体重/日)で表されました。ハザード指数(HI)計算のために、EDI値はTD503231の単位に一致するためにng/kg体重/日(1 ppb/kg/日=1,000 ng/kg体重/日)に換算されました。
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リスク評価と特徴付け
ハザード指数(HI)はEDIをTD50で割り、安全係数50,000を掛けて計算されました。中央値毒性用量(TD)50は、ゼロ用量では腫瘍を発症しなかった試験動物の50%で腫瘍を引き起こすために必要な用量(ng/kg/体重/日数)31,32です。
データ分析
分散分析は、SAS 9.4(SAS Institute Inc.、CARY, CAR, USA)におけるRCBD手法を用いて収集された成長および収量データの解析を行いました。最小二乗平均の複数比較は、Tukeyの正直に有意差(HSD)検定33を用いて実施されました。
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成長成分中のアフラトキシン濃度
結果は、成長成分およびグリーン合成CuO/ZnO非物質処理されたトウモロコシ穀物にアフラトキシン濃度が検出され、主要なアフラトキシンタイプ(AFG2、AFG1、AFB2、AFB1)の存在を示しました。アフラトキシン濃度の計算に用いられた較正曲線は、異なるアフラトキシン間で良好な線形性を示し、r2 の値は0.9999から1の範囲でした(図1 および補足ファイル1)。HPLCの検証は、アフラトキシン類似体のLODおよびLOQ値がそれぞれ0.006から0.07ppbおよび0.002から0.2ppbの範囲で示されました(表1)。Afsトータルの平均回収率はキャンパス内サイトで95%から102%の範囲にとどま...
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このプロトコルがトウモロコシにおけるAFB1転座および蓄積の減少に成功するには、生物学的有効性と分析信頼性の両方を確保するいくつかの重要なステップがかかっています(16,27)。結果は、125 mg/kgのグリーン合成CuO-ZnOハイブリッドNPが、両実験モデルにおいてAFB1濃度を有意に減少させることを示しましたが、そのメカニズムは異なる可能性があります。吸収力学(キャンパスサイト):キャンパスサイトでは、トウモロコシが事前に抽出されたAFB1にさらされ、植物組織の有意な減少(V10で68%、R1で82%)が見られ、ハイブリッドNPが土壌マトリックス内で毒素を効果的に吸着し、根の吸収のための生体利用能を低下させたことを示唆しています(図4)
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著者には利益相反を主張するものはありません。
この研究は、ノースウェスト大学の博士課程奨学金と自然科学・農学部の奨学金によって支援されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 酢酸銅(II)[Cu(CO2CH3)2] | シグマ・オルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国 | 10,53,753 | 濃い青緑色の結晶状固体(純度98%) |
| ガラスマイクロファイバーフィルター | シグマ・オルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国 | 1703965 | ホウケイ酸ガラスおよび |
| 高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)システム | 島津 | 20H2 | 分析物の分離および定量化のために、 |
| HPLCグレードのエタノール | シグマ・オルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国 | 34923 | 高純度無色溶媒(&ge: 99%) |
| HPLCグレードのメタノール | メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ | 322415 | 高純度無色溶媒(&ge: 99%) |
| 免疫親和性カラム | 島津 | KJ524 | 標的分析物の選択的精製のために |
| PAN 5R-590Rのトウモロコシ種子 | NWK | 該当なし | 小さく硬い粒で白いコルオール |
| リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) | メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツ | 3526580 | 等張緩衝液とnbsp; |
| ビニール袋 | エコアグロ・エンタープライズ(Pty)Ltd | 該当なし | 穿孔 |
| 精製されたAFB1、AFB2、AFG1、AF2およびAFの合計インシチュア | トリロジー・アナリティカル・ラボラトリー社(ワシントン州ヴォスブリンク・ドライブ、アメリカ) | TAS-M12DA1-10 | 白色からオフホワイトの結晶固体 |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | シグマ・オルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国 | 該当なし | 白色結晶固体 |
| 酢酸亜鉛 [Zn(CH3COO2)2H2O] | VWR化学物質 | 2331 210 2 | 白色結晶固体(純度99%) |
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