このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

マウス脳の微小血管内皮細胞の単離と培養

172 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/70909

⸱

2026年7月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

この記事について

サマリー

新生児のマウス脳組織から脳微血管内皮細胞(BMECs)を単離し一次培養し、生理学的および病理学的条件下での血液脳関門機能を研究するための堅牢な in vitroモデルを生成するためのプロトコルを提示します。

要約

脳微小血管内皮細胞(BMECs)は、血液脳関門(BBB)の主要な細胞構成要素であり、分子輸送の調節や中枢神経系の恒常性維持に重要な役割を果たしています。信頼できる in vitroの脳内皮モデルは、神経学的および全身疾患におけるBBB生理学および機能障害の研究に不可欠です。新生児マウスの大脳皮質からBMECsを分離し、一次培養するための再現可能なプロトコルを記述します。この手法には、皮質組織の剥離、機械的および酵素的解離、牛血清アルブミン(BSA)密度勾配を用いたミエリン残骸の除去、CD31ベースの免疫選択を用いた内皮細胞の濃縮が含まれます。分離された細胞はその後、コラーゲン被覆プレート上で培養され、形態学的評価、内皮マーカーの免疫蛍光検出、血管新生チューブ形成アッセイ、およびバリア特性を評価する経内皮電気抵抗(TEER)測定を用いて特徴付けられます。このプロトコルは、生理学的および病理的条件下でのBBB生物学、内皮シグナル伝達、神経血管相互作用の調査に適した一次BMEC培養を得る信頼性の高いアプローチを提供します。

概要

血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)と全身循環間の物質交換を厳密に調節する高度に専門化された構造です。BBBは主に脳の微小血管内皮細胞が緊密結合で結ばれて形成されます。これらの内皮細胞は、アストロサイト、ペリサイト、ニューロン、グリア細胞、基底膜を含む多細胞システム(NVU)内で機能します。これらの構成要素の中で、脳の微小血管内皮細胞(BMECs)は、密接合部を持つ連続した層を形成し、数千の選択的トランスポーターシステム、限定的な小胞輸送、そして浸着分子の低発現によって溶質や細胞の脳実質への通過を制限することで免疫細胞の浸潤を制限することで中心的な役割を果たします。3,4。

物理的および選択的バリアとしての役割に加え、BMECは神経血管シグナル伝達、脳血流調節、局所免疫応答、特に脳血管新生5などの重要なプロセスにも積極的に関与しています。後者のプロセスは胚発生時に重要ですが、脳卒中、虚血、炎症などの病的状態でも再活性化されます。BMECは血管内皮成長因子(VEGF)や胎盤成長因子(PLGF)などの血管新生シグナルに応答し、新しい血管の形成と成熟を調整します 6,7。したがって、脳内皮機能障害はBBBの完全性と脳の恒常性を著しく損なうことになります。

BMECsを in vitroで研究することで、BBBの生理学と脳血管新生を制御するメカニズムの両方をモデル化できます。しかし、神経組織の複雑さ、ミエリンの豊富さ、そして高い純度の高い培養の必要性により、これらの細胞を脳組織から分離することは大きな技術的課題を伴います。不死化細胞株は存在しますが、表現型および機能的代表性の面で大きな制限があります8.

この文脈において、新生マウスモデルからのBMECの一次培養プロトコルは強力な実験ツールであり、生体内で脳内皮の形態学的、分子的、機能的特徴の多くを保持しています。しかし、マウスのBMEC分離に関する確立されたプロトコルのいくつかは、機械的解離と密度勾配(デキストランまたはパーコル)を組み合わせることに依存しており、しばしば変動する内皮濃縮やペリサイト、アストロサイト、ミエリンデブリによる残留汚染をもたらします。抗生物質を用いたプロマイシンによる精製は内皮純度(最大~95%)を向上させるが、タンパク質合成の阻害や内皮表現型への潜在的な影響により細胞ストレスを引き起こす可能性がある。あるいは、蛍光活性化細胞選別(FACS)に基づくアプローチは高純度の集団を提供しますが、専門的な機器と広範な処理を必要とし、生存率や拡張性を低下させる可能性があります。より新しい新生児プロトコルでは密度勾配を避け、遠心分離の回数を減らし、収量を上げつつ汚染を抑える方法が導入されています。

この背景を基に、本研究は新生マウスの脳微血管から内皮細胞を単離・培養するための最適化プロトコルを説明しています。この方法は、精密な解剖学的解剖、効率的な酵素的消化、牛血清アルブミン(BSA)勾配を用いたミエリン除去、CD31マーカーに結合した磁気微小球を用いた免疫選択による濃縮を組み合わせています。このプロトコルは、脳血管新生、神経血管相互作用、内皮シグナル伝達、生理学的および病理学的条件下でのBBB機能障害の研究に適した、生存可能で再現性が高く濃集された一次培養の取得を可能にします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

ビオビオ大学の生命倫理・バイオセーフティ委員会はこのプロジェクトを承認しました(Fondecyt助成金1240925)。動物を用いた研究は、実験動物の使用における3つのRの基本原則13 および米国国立衛生研究所が発表した実験動物のケアと利用に関するガイドライン14の推奨に従って行われました。動物たちはビオビオ大学の生物施設で適切な環境で飼育され、標準的な環境(12時間の明暗サイクル、22 ± 2°Cの温度管理、飼料と水の自由 なアクセス) が設けられました。

細胞を得るために、4か月から6か月の野生型妊娠マウス(C57BL/6)を用いました。出産後、子犬は産後5日目(P5)まで母親と一緒にいました。この時点で、子孫はイソフルランによる深い麻酔を受け、反射を失うまで安楽死に至りました。低体温症は運動を最小限に抑える補助的なものとしてのみ用いられ、直後に斬首が行われました。すべての処置は、アメリカ獣医師会(AVMA)の動物安楽死ガイドライン(2020)および 実験動物のケアおよび使用に関する国際規則(NIH)14に従って実施されました。大脳皮質を分離し、この実験プロトコルの開発に用いられました(プロトコルステップ3参照)。 材料表 には、このプロトコルで使用される材料と抗体が記載されています。

1. 内皮培養培地の準備

  1. マウス脳内皮細胞用の培養培地500 mLを無菌容器で調製するには、10%胎児牛血清(FBS)を補足したDMEM250 mL、10% FBSを補足した内皮細胞培養培地250 mLを混合します。
    注:培養培地は必須の内皮増殖因子を提供し、細胞増殖をサポートします。参照された製品(材料 表参照)が利用できない場合は、同等の内皮細胞サプリメント(例:ECGS、ヒドロコルチゾン、L-グルタミン)をDMEM+FBSに加え、同様の成長条件16を得ることができます。
  2. 無菌性を確保するために、培地全体(10% FBS)を0.22μmフィルターで滅菌します。
  3. 調製された培地は使用まで4°Cで保存します。成長因子活性を維持するために、2〜4週間ごとに新鮮な培地を準備してください。

2. 培養プレートのコーティング

注:細胞の付着を促進し、内皮表現型を維持するためには、培養プレートにはタイプIコラーゲンをあらかじめコーティングする必要があります。このプロセスの手順は以下の通りです:

  1. プリコーティング溶液は、タイプIコラーゲン(0.1 mg/mL)、酢酸Mを混ぜてコラーゲンを溶かし、滅菌基底培地を混合して総体積15 mLにします。コラーゲンが完全に溶けるまで優しく混ぜ、必要に応じて pH4.0 に調整してください。 0.22μmフィルターで滅菌 フィルターを使い、使用まで 氷で保管 してコラーゲンの安定性を保ちます。
    注:タイプIコラーゲンは基底膜を模倣し、内皮細胞の付着を支え、細胞表現型の維持を助けます。
  2. 無菌条件下で溶液を均質化します。培養皿の表面全体を均一に塗布します。
    注意:表面を覆うために必要な体積のみを使用します。
  3. プレートを37°Cで一晩(12〜16時間)孵育し、コラーゲンが適切に吸着できるようにします。細胞をシードする前に、余分なコーティング液を取り除き、プレートを無菌のリン酸緩衝生食塩水1回(PBS1回、pH7.4)で2回洗浄し、残留酸と結合していないコラーゲンを除去します。

3. 脳混合細胞培養の単離

注:このプロトコルは、P5マウスの大脳皮質からBMECを分離することを目的とした以前の報告9,17を基にしています。

  1. イソフルランを用いた深麻酔で5匹のP5子犬を生贄にします。低体温症は補助としてのみ使用し、その後頸椎切断を行う。
    注意:この段階以降、すべての手順は層流型生物安全キャビネット内で行われなければなりません。
  2. 脳を採取し(図1A)、滅菌冷たいPBS(1回)に50mLの円錐形チューブに入れて、すべての脳が処理されるまで放置します。
  3. 髄膜を消毒されたニトロセルロース膜で慎重に転がして分離します。脳を冷たいPBS(1回)を含む100mmプレートに移します。滅菌メスを用いて脳幹、小脳、視床、嗅球を除去します(図1B,C)。
  4. できた髄膜のない大脳皮質を採取し、冷たいPBS(1回)に保存します。直ちに全脳皮質を50mLの円錐形チューブに移し、5mLのPBSを氷に1回入れた状態に移します(図1D)。
  5. 無菌ハサミを用いて機械的に組織を解離し、その後1 mLピペットで組織の断片が見つからず、懸濁液が均一になるまで続けます(図1E)。
    注意:研磨時の機械的応力を減らすためにピペットの先端を切断することができます。組織解離は制御された吸引と優しいピペッティングによって達成され、広い先端の開口部はせん断力と機械的細胞溶解を最小限に抑え、細胞の生存能力を保ちます。
  6. すべての組織を集めて15 mLのチューブに入れます。
  7. 組織を消化するには、サンプルを無菌の15 mL円錐形チューブに移し、2 mLのコラーゲン酵素溶液(DMEMでは2 mg/mL)を含み、軌道シェーカーで37°Cで180 rpmで2時間培養します。
  8. 消化後、10%FBSを補足したDMEM5mLを懸濁液に加え、遠心分離機で3,000× g で10分間投与します( 図1F参照)。上清液は捨てる。
  9. ミエリンを除去するには、ペレットを20% BSA4 mLのPBS(w/v)に再懸浮させ、遠心分離機で3,000 × g で20分間保存します(図1G)。遠心分離後、パスツールピペットでミエリンを含む上部の乳白色層を慎重に除去し、残った上澄液は捨て去ります(図1H)。
  10. ペレットを10% FBSを含む2 mLのDMEMに再懸浮させ、その後再び3,000 × g で10分間遠心分離します。上清液を捨て、最終的なペレットを10% FBSを含む1 mLのDMEMに優しく再懸浮させます。
    注:この段階では、最終的な懸濁液には組織解離から生じる不均一な脳由来細胞群が含まれています。この混合物には脳の微小血管内皮細胞、アストロサイト、ペリサイト、その他の神経細胞が含まれる可能性があります。BMECを選択的に濃縮するためには、その後の精製および培養工程が必要です。
  11. 分離細胞をメッティングする前に、準備された培養プレートからコーティング溶液を取り出し(ステップ2.3参照)、各ウェルを滅菌PBS(1回)で2回洗浄します。
  12. 再懸濁したセル(ステップ3.10)をコーティングされたプレート(推奨:60mm皿)に種をまきます。
    注:通常、1回の分離から得られる全細胞懸濁液は、 5mLの内皮増殖培地を含む1つまたは2つのコーティングされた皿に分散されます。
  13. 培養液を37°Cの加湿インキュベーターで5%のCO₂で維持します。ミディウムは2〜3日に一度交換してください。培養液が90〜100%の合流に達したら、CD31被覆ビーズを用いた免疫選択を行い、内皮細胞の増殖を行います。
    注:分離および初期培養確立後、この手法は通常、 1つの調製物に約5×106 個の細胞を得て、これらはコラーゲン被覆プレートに付着し、内皮単層の特徴的な石畳形態を発達させます。

4. CD31磁気ビーズを用いた脳微小血管内皮細胞(BMECs)の単離

  1. 細胞の調製と剥離
    1. 培養が90〜100%の合流に達したら、残留培地を除去するためにPBS(1x)で細胞を3回洗浄します。
    2. プレートにトリプシン1mL(0.5%×1x)を加え、37°Cで3〜5分間インキュベートして細胞を剥離させます。
    3. 10%FBSを含む内皮培養培地1mLを加えてトリプシンを中和します。細胞懸濁液(~2 mL)を無菌マイクロ遠心分離管に移し、遠心分離機で220 × gで4°Cで10分間投与します。 上清液は捨てる。
  2. CD31磁性ビーズの調製
    1. 新しい15mLチューブに8μLのCD31磁気ビーズを入れます。ビーズを1mLの1%ハンクス溶液で洗い、チューブを動かして優しく再懸浮させます。
    2. チューブを磁石に2分間当ててビーズを沈殿させます。ビーズを乱さずに上清液を慎重に除去してください。洗う手順を3回繰り返します。
      注意:ビーズを失わないように磁石の近くで作業し、一次細胞培養の汚染を防ぐために無菌状態でこの作業を行うこと。
  3. ビーズを用いた細胞の培養
    1. 細胞ペレットをFBSを含む1%ハンクス溶液1mLに再懸浮させ(非特異的結合を減らすため)。
    2. 1,000μLピペットを使って、あらかじめ洗浄されたビーズを含むチューブに細胞を移します。混合物を氷の上で優しく振って20分間孵化させます。
  4. 内皮細胞の磁気分離
    1. チューブを磁石に3分間当てて、ビーズ結合した内皮細胞を沈殿させます。
    2. 上澄液を慎重に除去してください。
      注:この段階では、2種類の単離細胞を精製できます。1つは内皮細胞(ステップ4.5参照)で、別の種類の脳細胞が混合されています。現時点では、2つの選択肢があります。
      1. 上清液(脳細胞の混合物)を取り除き捨て、チューブを磁石に付けたままにしてください。ビーズ結合細胞(すなわちCD31+ 細胞)をハンク溶液2 mLで洗浄し、これを3回繰り返します。
      2. 上清液に含まれる細胞ご片を用いて、選択されていない細胞(例:線維芽細胞、アストロサイト、ミクログリア、ニューロン、ペリサイトなど)を含む新しい培養液を生成します。
  5. 精製されたBMECSの培養
    1. ビーズ結合された内皮細胞を7 mLの完全内皮培地(10% FBS)に再懸浮させます。
    2. 細胞をコラーゲンでコーティングした60mmのプレートに一晩かけて種付けします(セクション2参照)。標準的な条件(37°C、5% CO₂)で培養します。
      注:内皮表現型は、記載された培養条件下で(p)3まで保持されます。血液脳関門関連の特性を維持するために、早期通過(p0–p3)を用いた実験的アッセイが推奨されます。

5. 細胞の特徴付け

  1. ビーズ捕獲細胞の顕微鏡観察
    注:本プロトコルで記述された培養条件下では、一次BMECは通常、特徴的な内皮形態および表現型を保持しつつ、最大 3回の通過(p3) 維持可能です。種まき密度や成長速度によっては、培養は一般的に 約2〜3週間の 体外 維持が可能で、その後に顕著な表現型変化が起こることがあります。
    1. CD31磁気ビーズによる免疫選択後、位相差顕微鏡で結合した細胞を観察します(図2A)。
      1. 典型的な卵石形態を示し、5〜7日以内に均一な単層を形成するCD31陽性内皮細胞を探してください。
        注:免疫選択の過程で、CD31被覆された磁気ビーズは内皮細胞に特異的に結合し、その結果、内皮集団を豊かにします。選択過程後も、直径約4.5μmのビーズは初期通過時に内皮細胞に関連したり内部化したりする様子が観察されることがあります。これらは通常、洗浄や培養維持で減少し、BMECの生存率や細胞成長を妨げません (図2B)。
      2. 均一な形態と細長いまたはアストロサイト様の細胞の不在を利用して、内皮集団の純度を推定します。
  2. CD31およびGLUT1の免疫蛍光
    1. コラーゲン被覆のカバースリップと培養に2個×3個のBMEC を80〜90%の合流点まで播種します。
    2. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温(22–25°C)で10分間固定し、PBSで洗浄します。
    3. 0.1%のTriton X-100で5分間透過し、5%BSAで非特異的な結合を30分間ブロックします。
    4. CD31およびGLUT1(脳内皮に特異的なグルコーストランスポーター)に対する一次抗体を4°Cで一晩潜伏させます。
    5. PBSで洗浄し、適切な蛍光セカンダリ抗体とともに1時間インキュベートします。
    6. 核は 4′,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)でカウンターステインし、カバースリップにアンチフェードマウントメディウムを装着します。
    7. 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で観察してください。CD31が細胞境界に局在しているか(図3A)、GLUT1が細胞質および膜分布を示し、内皮同様と脳内皮表現型を確認できるか(図3B)。
      注:独立したBMEC分離からの代表画像は、培養されたBMECの典型的な形態とマーカー発現を示しています。クラウディン-5のようなタイトジャンクションタンパク質の存在も脳内皮の特徴付けに用いられます。内皮培養の純度をさらに評価するために、他の神経細胞タイプの陰性マーカーを用いた追加の免疫蛍光染色を行うことができます。例えば、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)はアストロサイトを検出し、イオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba1)は微小膠細胞の識別に用いられます。これらのマーカーに染色が見られないことは、非内皮細胞集団からの汚染がないことを裏付けています(図3C,D)。
  3. チューブ形成アッセイ
    注:内皮細胞はマトリジェルアッセイ18で前血管形成能力を示し、このアッセイを用いて内皮の同一性を確認できます。
    1. 96ウェルの板にマトリジェルをプレコートし、37°Cで30分間重合させます。
    2. 100μLの完全内皮培地(10% FBS)で100 μLのウェルあたり10× 4 BMECをシード。37°Cで培養し、位相対照顕微鏡を用いて4〜8時間にわたり管の形成を監視します(図4A)。
    3. ImageJ(Angiogenesis Analyzerプラグイン)を用いて、チューブ長、接合部数、メッシュ数を定量化します19。(図4B)
      注:BMECが相互に連結した管状構造を形成できる能力は、その血管新生ポテンシャルおよび内皮機能の裏付けです。
  4. 経内皮電気抵抗(TEER)の測定
    注:脳内皮細胞はBBB20の重要な構成要素であるため、厳重なバリアを形成する必要があります。電気的障壁を生成する内皮能力を確認する必要があります。
    1. 上部区画と培養物のコラーゲン被覆トランスウェル挿入部(孔径0.4μm)に20,000個のBMECを播種し、合流に達するまで行います。
    2. 上皮ボルトオームメーターを用いてTEERを測定し、単層の完全性を評価します。安定化するまで毎日TEER値を記録すること;抵抗の増加は、機能的内皮バリアに特徴的な細胞間接合部の形成を示します (図4C)。
      注:選択されていない細胞混合物の残存物、特にアストロサイトは共培養システムを生成するために使用できます。この構成には、上部(BMECs)と下部(選択されていない細胞混合)区画間のセル比の慎重な最適化が必要であり、各検査室で標準化されるべきです。この共培養構成は、以前に記載されたBBBモデル21から応用されたものです。
    3. 非選択細胞ミックス(ステップ4.4.2.2)を培養皿の下部ウェルに、トランスウェル挿入膜の上部にBMECをまきまきます。
      注:単一栽培と共培養条件を比較した代表的な実験を含み、TEER測定による障壁の厳しさを評価する( 図4C)。

6. 精製されたBMECの拡張と維持

  1. 培養条件
    1. 精製済みBMECを完全な内皮培養培地(10% FBS)で、湿度95%の加湿インキュベーター(95%)で37°C、5%のCO₂で維持します。培養培地を2〜3日ごとに交換し、新鮮な栄養素を提供し細胞の生存能力を維持します。
  2. 細胞の成長と形態のモニタリング
    1. 培養を毎日位相差顕微鏡で観察し、細胞の付着、成長、形態を観察します。BMECの特徴的な石畳形態を探し、5〜7日以内に合流単一層を形成します。
  3. サブカルチャリングと通過
    1. 培養が80〜90%の合流に達したら、37°Cで0.05〜0.1%のトリプシンを3〜5分間細胞剥離します。
    2. トリプシンを同量の完全な培地で中和し、220× g で4°Cで10分間遠心分離し、ペレットを新鮮な内皮培地に再懸浮させます。
    3. 細胞を所望の密度でコラーゲン被覆プレートに種付けし、増殖を継続させます。
      注意:内皮表現型と機能的完全性を維持するために、BMEC通過回数を3〜5回に制限してください。
  4. 任意の冷凍保存
    1. 長期保存のために、BMECを冷凍培地(完全な内皮培地に10% DMSOを)に再懸濁します。制御された冷凍庫で徐々に–80°Cまで凍結し、その後液体窒素に移して長期保存します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

ここで述べるプロトコルにより、新生マウス(P5)から一次BMECsの分離と培養が可能になります。これらの細胞はBBBの主要な細胞構成要素であり、脳血管生理学および病態生理を研究するための貴重な実験ツールです。形態学的、表現異常的、機能的評価を通じて、脳微血管内皮細胞(BMECs)の単離および培養に成功したことが示されました。

分離ワークフローにより、非皮質領域の除去、酵素的消化、BSA勾配を用いたミエリン除去の後に、剥離された大脳皮質から細胞懸濁が得られました( 図1A–H参照)。遠心分離の工程を経て、細胞を含むペレットを得て、その後の培養に使用しました。

分離後5日目には、免疫選択前の混合細胞集団が全体の細胞プールで構成されていました(図2A)。CD31ベースの磁気ビーズ選択後、内皮細胞が濃縮され、選択後に...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

BMECsの分離は、脳卒中を含むさまざまな中枢神経系(CNS)病変4,9におけるBBBの生理学およびその機能障害を調節するメカニズムを研究するための重要なツールです。不死化細胞株とは異なり、一次BMEC培養は脳内皮の主要な表現型および機能的特徴を保持し、密結合タンパク質の発現や生体内を代表する血管新生能力を保持します。文脈 8,10.

本論文は、出生後のマウス脳組織からBMECを単離・培養するための最適化され再現可能かつ技術的にアクセス可能なプロトコルを提示します。このプロトコルにより、内皮豊富で高い生存性と機能性を持つ細胞群を得ることができ、シグナル伝達研究、血管新生、バリア特性の評価に適しています。コラーゲン酵素を用いた酵素的消化、効率的なミエリンクリアランスの...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

この原稿の一部はOpenAIのChatGPT(GPT-4、2025年7月版)で作成され、明瞭さ、言語、一貫性が向上しました。著者たちはすべてのAI支援コンテンツを批判的にレビューし、編集し、承認しました。データ分析、結果解釈、科学的結論の生成にはAIツールは使用されませんでした。

謝辞

著者らは、GRIVAS HealthおよびNEUROVASの研究者の皆様から貴重なご意見に感謝申し上げます。この研究はFondecyt Regular 1240295の資金提供を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
60 mmの培養プレートCorning430166
96ウェルの培養プレートCorning41122107
酢酸Sigma-AldrichA6283
抗生物質・抗真菌薬（オプション）Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594染色)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor  (488染色)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
自動および血清学的ピペット Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
基底培地（コラーゲン溶液用）Gibco (DMEM)11965092
ウシ血清アルブミン（BSA）Sigma-AldrichA9647
コラーゲナーゼII型Sigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM（高グルコース）Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV完全培地Merck MilliporeSCME004内皮細胞成長培地
Falconチューブ（15 & 50 mL）Corning®352096 / 352070
胎牛血清（FBS）Gibco (Thermo Fisher)16000044
蛍光顕微鏡MoticBA410
手袋、マスク、実験消耗品様々なサプライヤー—
ヘパリン（100 U/mL）Sigma-AldrichH3393
倒立顕微鏡Olympus CKX41
磁気分離マグネットEasySep  NC9284020
振とう器（37 °C）Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
パラフィルムBemisPM996
PBS（1×）Thermo Fisher Scientific10010023
冷蔵遠心機HITACHICT5RE
メスカルペルFine Science Tools様々な
はさみと細かいピンセットFine Science Tools様々な
滅菌硝化セルロース膜BIO-RAD1620094
I型コラーゲンCorning 30394

参考文献

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
  3. Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
  4. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
  5. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
  6. Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
  7. Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
  8. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
  10. Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
  11. Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
  12. Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
  13. Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
  14. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
  15. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
  16. Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  17. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
  18. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  19. Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
  20. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
  21. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
  22. Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
  24. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
  25. Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
  26. Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
  27. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
  28. Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
  29. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
  30. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

神経科学第233号第233号今月のJoVE号脳内皮細胞一次培養血液脳関門脳血管新生
マウス脳の微小血管内皮細胞の単離と培養
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。