成人幹細胞からのヒト嗅覚上皮オルガノイドの生成と分化

サマリー

本プロトコルは、成人ヒト上甲介組織から嗅前駆細胞を単離し、嗅上皮オルガノイドを生成する確立されたアプローチを示しています。また、これらのオルガノイドを成熟した嗅覚感覚ニューロンへと分化させる化学誘導戦略も詳述し、これにより人間の嗅神経新生のモデリングを可能にします。

要約

人間の嗅上皮は、基底幹細胞の常駐集団によって支えられる驚くべき神経新生能力を持っています。しかし、この再生プロセスを忠実に再現する動 的なin vitro モデルを確立することは困難であることが証明されています。ここでは、成人ヒトの上鼻甲介組織から単離された前駆細胞から嗅覚オルガノイドを生成する確立されたプロトコルを提示します。これらのオルガノイドは幹性を維持しており、SOX2の発現からも明らかで、未成熟神経マーカーGAP43の均一発現と成熟嗅覚感覚ニューロンマーカーOMPの末梢局在を特徴とする空間的に組織化された分化パターンを示します。その後、Notch阻害剤LY411575、WntアクチベーターCHIR-99021、レチノイン酸を用いた標的分化により、OMPと神経マーカーTuj1(クラスIII β-チューブリン)を共発現する陽性嗅覚感覚ニューロン様細胞が生成されました。このヒト由来モデルはマウスシステムの限界を回避し、嗅神経新生、COVID-19関連嗅覚喪失、その他の嗅覚関連神経変性疾患の研究のための堅牢な in vitro プラットフォームを提供します。

概要

ヒト嗅覚系は連続的な神経新生を支^{えており、}この過程は主に嗅上皮の基底幹細胞、特に水平基底細胞(HBC)と球状基底細胞(GBCs)によって駆動されます。^2,3個のGBCは持続的に嗅覚感覚ニューロン(OSN)に分化しますが、HBCは損傷によって活性化されるまで静止状態を守ります。^4,5 嗅覚知覚は、臭い分子がOSNの繊毛上の受容体に結合することで始まり、信号伝達カスケードを引き起こし、嗅球や皮質に情報を伝達します。⁶ この感覚機能の発達と維持は嗅上皮によって支配されます。

身体的、化学的、生物学的な刺激によって引き起こされる嗅覚障害は、しばしば自然に治癒します。⁷ それにもかかわらず、世界人口の1.5%から25%に影響を及ぼ^し、トラウマ、^感染症、^アルツハイマー病やパーキン^{ソン病などの}神経変性疾患など多様な病因から生じることがあります。これらの場合、自然回復はしばしば不完全または欠如します。嗅覚トレーニングやコルチコステロイド投与などの現在の治療法は、効果が限定的であることを示しています。^12,13 この治療的ギャップは、損傷後の嗅神経上皮の生存と再生を支配するメカニズムの不完全な理解に起因しており、この知識のギャップは、人間の嗅覚生物学を研究するための既存のin vitroモデルの不十分さによってさらに悪化しています。

近年、多様なヒトオルガノイドモデルの開発により、人間の病気を研究するための新たな技術的プラットフォームが生まれました。成人幹細胞由来の¹⁴種類のオルガノイド(AdSCs)、すなわち組織常駐幹細胞は、胃、肝臓、膵臓、肺、膀胱など、さまざまな内胚葉由来組織に対して成功裏に生成されています。 15,16,17,18,19 これに対し、外胚葉由来の嗅板からヒトの嗅上皮オルガノイドを確立することは技術的に依然として困難である。主な実用的課題は、人間の上鼻甲介から生存可能な嗅上皮組織を一貫して得ることの難しさです。嗅領域の位置や範囲は個体によって大きく異なり、加齢に伴う顕著な変性が起こります。呼吸上皮を誤って採取すると、培養結果に悪影響が及ぶ。これに対処するため、Renらによる2021年のプロトコルを改良し、ヒト嗅覚粘膜から細胞クラスターを^培養し、ヒト嗅上皮オルガノイドを確実に生成することに成功しました。私たちのアプローチは、三次元かつ階層的に組織化されたヒト嗅覚上皮オルガノイドを生成し、それらを嗅覚感覚ニューロンへと分化させることを支援します。このモデルは、嗅上皮幹細胞の運命を決定するメカニズムを調査し、嗅覚障害の治療薬をスクリーニングするための貴重な実験プラットフォームを提供します。

要約すると、この手法の主な目的は、成人前身細胞からヒト嗅覚上皮オルガノイドを生成・分化するための標準化されたワークフローを確立することです。このアプローチの根拠は、人間の嗅覚系の生理学的に関連した in vitro モデルの欠如によって生じた重要なギャップを埋めることにあります。従来の二次元(2D)単層培養やマウスモデルと比較して、この三次元(3D)の人間由来システムは、嗅粘膜の複雑な空間的組織と人間特有の遺伝的文脈を忠実に再現するという明確な利点を提供します。研究者がこのプロトコルを検討するためには、呼吸上皮への汚染を避けつつ、人間の上鼻甲介から生存可能な嗅上皮を正確に分離することは非常に困難であり、患者の年齢や個々の解剖学的差異に大きく左右されることを認識することが重要です。したがって、このプロトコルは、ヒトの臨床標本に継続的にアクセスでき、ヒトの嗅覚神経新生、ウイルス誘発性の嗅覚喪失、または神経変性疾患に関連する嗅覚欠損のモデル化を目指す研究者に特に適しています。

プロトコル

本研究は四川大学華西病院の機関審査委員会(IRB)の承認を得て実施されました(承認番号2024(31))。組織採取およびデータ公開前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。脳脊髄液鼻漏のための内視鏡的頭蓋底手術または篩骨洞手術を受けた患者から、上鼻甲介組織標本を採取しました。

1. 組織サンプルの処理と輸送

1. 採取直後、組織サンプルをDMEM/F12/HEPES基礎培地に10%胎児用牛血清および5%ペニシリン・ストレプトマイシン溶液を補足した予冷却された滅菌輸送培地に置き、4°Cで実験室へ輸送します。
   注:血清は細胞の生存能力維持を助け、抗生物質混合物は輸送中の微生物汚染を防止します。細胞の生存率を保つために輸送時間を2時間以内に抑えましょう。

2. 組織前処理(氷上で実施)

1. サンプルを予備冷却の滅菌培養皿に移し、輸送培地を除去し、5%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を含む修正PBSバッファーで組織を洗浄します。洗浄は以下の通りです:5mLの冷蔵済み洗浄液を皿に加え、組織を5〜7回軽く叩き、液体を完全に吸引します。この洗浄サイクルを3回繰り返し、血球や組織のゴミを除去します。
2. 滅菌マイクロシザーを使い、組織を約1〜2 mm³の断片に細かく刻みます。
   注意:この段階では組織の水分補給を維持し、鈍い鉗子で固定し、切除時間を最小限にして細胞の生存を維持してください。

3. 酵素的消化

1. 機械的に解離された組織を15 mLの遠心分離機チューブに移し、予温された37°Cの化合物消化バッファー3 mL(トリプシン0.125%とDNase Iを含み)を加え、酵素と組織の体積比を3:1に保ちます。チューブを37°Cの水浴で20分間優しく攪拌しながら孵化させます。消化の進行を監視し、組織の凝集を防ぐために5分ごとにサンプルを点検してください。
2. 消化を止めるために、同量の終端液、DMEM/F12/HEPES基礎培地に10%胎児用牛血清を補足します。混合物を上下に優しくピペットで上下に10回動かし、酵素と阻害成分の完全な混合と効果的な接触を確保します。
   注:血清に含まれるα1-アンチトリプシンは、トリプシン活性を効率的に中和します。

4. 単一セル懸濁液の準備

1. 50 mLの遠心分離機チューブの上に40 μmのセルストレーナーを置きます。トリムした1 mLピペットの先端を使い、消化済みの組織と液体を15 mLチューブからストレーナーに移します。ピペットの先端でフィルター上の物質を優しく渦巻きさせて通過を促し、その後、さらに1〜2mLの終端液でストレーナーをすすいでください。すべての液体が濾し器を通過したら、50 mL管から新しい15 mL遠心分離機管にろ過液を移します。
2. 300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 チューブの底部にある明確な細胞ペレットを確認し、上清液を慎重に吸引し、細胞ペレットを乱したり失われたりしないように約100μLを残します。

5. 三次元文化システムの確立

1. 細胞ペレットを培養培地に再懸濁せずに、予冷処理された低結合ピペットチップを使ってマトリゲルと直接結合し、正確な密度10,000細胞/μLを得ます。この細胞-マトリジェル混合物を24ウェルプレートの各ウェルに40μL、ガラス底共焦点ディッシュ各に20μLを分散します。プレートを37°Cで30分間培養し、マトリジェルが重合して三次元足場を形成します。
2. マトリジェル固化後、ゲルを破壊しないようにウェル壁に沿って血清不使用嗅神経幹細胞培養培地500μLを優しく加えます。培養菌は37°Cの加湿インキュベーターで5%のCO₂を使い、培地を3日ごとに新鮮な予温された培地に交換します。
   注:嗅覚神経幹細胞培養培地はDMEM/F12/HEPESに以下の成分を補足しています:R-スポンディン1(200 ng/mL)、ノギン(100 ng/mL)、Wnt3a(50 ng/mL)、EGF(50 ng/mL)、Y-27632(10 μM)、主要抗菌薬(100 μg/mL)、N2サプリメント(1%)、B27サプリメント(2%)、L-グルタミン(1%)。

6. 通過と区別

1. 使用前に氷で10分間冷やし、ウェルから培地を吸引し、各ウェルに1mLの氷冷回収液を加えます。プレートを45°の角度に傾け、溶液を優しく吸引して5〜7回送出して基底膜マトリックスからオルガノイドを外し、得られた懸濁液を15mL遠心分離機管に移します。チューブを氷上で3〜5分間培養し、その後300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を慎重に除去します。ペレットの損失を防ぐために約100μLの液体を残します。
2. 細胞ペレットに直接オルガノイド解離試薬1mLを加え、37°Cで220rpmの優しく振って5分間培養します。すぐに消化を終了させ、同量のストップ溶液を加え、混合物を上下に優しくピペットで5回ずつ動かして均一さを保ちます。離離細胞を300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、
3. 細胞ペレットをマトリジェルで再懸浮させ、24ウェルプレートの場合は1ウェルあたり40μL、ガラス底共焦点培養皿では20μLの容量で再懸浮させます。均一な懸濁液を確保するために、予冷処理された低結合ピペットチップで十分に混ぜます。適切なプレートや皿にシードした後、37°Cで30分間培養し、マトリジェルの重合と三次元足場形成を促します。次に、嗅覚神経幹細胞用の特殊な血清不使用球状培養培地500μLをウェル壁に沿って優しく加え、ゲルを乱さないようにします。培養液は37°C、CO₂5%、相対湿度95%の環境でインキュベーターで維持します。
4. 通過から約7日後、新しい世代の嗅覚上皮オルガノイドが球状体に再形成されたら、ガラス底の共焦点皿から拡大培地を吸引し、分化培地に置き換えます。分化培地は3日ごとに新鮮で予熱された培地に置き換えます。形態的に異なる嗅覚ニューロンは通常、約7日後に顕微鏡で明らかになります。
   注:分化培地はDMEM/F12/HEPESにR-スポンジン1(200 ng/mL)、ノギン(100 ng/mL)、Wnt3a(50 ng/mL)、EGF(50 ng/mL)、Y-27632(10 μM)、LY411575(5 μM)、CHIR99021(3 μM)、レチノイン酸(RA、1 μM)、主要抗菌薬(100 μg/mL)、N2サプリメント(1%)、B27サプリメント(2%)、L-グルタミン(1%)を補足したものです。

7. 免疫蛍光

1. 培地を吸引し、500μLのPBSでサンプルを優しく洗浄します。PBSを除去し、4%パラホルマルデヒド500μLを加えて室温で15分間固定します。固定剤を吸引して除去し、その後、固定された試料をPBS(3×500μL)で洗浄し、4°Cで最大48時間保存します。
2. PBSを吸引し、500μLの透過化溶液(0.2% Triton X-100 in PBS)を加え、室温で15分間培養し、その後吸引して溶液を廃棄します。サンプルは0.02%PBST(0.02%トライトンX-100 PBS、3×500 μL)で洗浄します。
3. ブロッキング液500μL(PBS中の3% BSA)を加え、室温で1時間培養します。
4. ブロッキング溶液を吸引し、適切な一次抗体(例:抗GAP43を1:160、抗OMPを1:50、抗SOX2を1:50で希釈して調製)500 μLの一次抗体溶液と交換し、4°Cで一晩培養します。 翌日、一次抗体溶液を吸引し、サンプルを0.02%PBST(3×500 μL)で洗浄します。
5. Alexa Fluor 488またはAlexa Fluor 555を希釈した二次抗体をブロッキング溶液で1:500希釈したものを含む二次抗体溶液500 μLを加え、室温の暗い環境で1時間培養します。二次抗体溶液を吸引し、0.02%PBST(3×500 μL)で追加洗浄を行います。
6. 500μLのDAPI作動液(PBSで希釈したDAPI)を加え、暗闇で10分間培養して核を染色します。DAPI溶液を吸引し、0.02%PBST(3×500 μL)でサンプルを洗浄します。染色サンプルは画像撮影前に最大48時間、4°Cで保存してください。

8. 共焦点顕微鏡イメージング

1. 直径≤100μmのオルガノイドに対してはZ軸サイズ1μm、100μmを超えるオルガノイドでは0.5μmの共焦点顕微鏡法を用います。多チャンネルシーケンシャルモードで画像を取得し、スキャン順はDAPI、FITC、TRITC、Cy5です。取得したZスタック画像シーケンスファイルを3Dレンダリングソフトウェア(例:Imaris)にインポートします。3D体積レンダリング関数を利用して、オルガノイドの完全な三次元モデルを生成します。この再構築モデルを観察し、特定の細胞マーカー(例:SOX2、GAP43、OMP)の空間的分布を可視化し、嗅上皮オルガノイドの階層的構造および神経分化状態を最終的なエンドポイントとして定性的に確認します。

結果

嗅上皮組織の単離と一次嗅上皮オルガノイドの培養
嗅上皮オルガノイドの培養システムを確立するために、ヒト上甲介組織から嗅上皮を単離し、三次元マトリジェルマトリックスに埋め込んだ(図1)。Renらが報告した定義された培養条件を基に、EGF、Noggin、Wnt3a、R-pondin 1の主要成長因子の濃度をROCK阻害剤Y-27632とともに検証・微調整しました。この組み合わせは嗅上皮オルガノイドのクローンの増殖と増殖を強固に支持しました。これらの条件下では、マトリゲルの単一嗅覚上皮細胞が生存し、一次培養から7〜12日以内に古典的な球状オルガノイドへと発達しました(図2)。12日間培養されたオルガノイドは固定され、神経幹細胞再生能力維持に重要な転写因子SOX2および未成熟および成熟嗅覚感覚ニューロンのマーカーであるGAP43およびOMPの免疫蛍光染色を受けました。結果は、当プロトコルで生成されたオルガノイドがSOX2...

ディスカッション

オルガノイドは、自己組織化した三次元構造がネイティブの人間組織とほぼ同じであり、場合によっては実際の臓器と組織学的に区別がつかないという点で、独自のin vitroモデルを示しています。^{したがって}、ヒトオルガノイドモデルの確立はヒトの病気研究にとって極めて重要です。ここでは、成熟した嗅覚感覚ニューロンへ確実に分化する一次ヒト嗅覚上皮細胞からオルガノイド培養システムを生成するプロトコルを提示します。このアプローチは、従来の手法の限界を克服し、従来の手法はマウスの嗅上皮のみに依存していたオルガノイド生成に依存^{しており、人間の}嗅覚障害のスペクトルとその基礎的な病理メカニズムを調査するための堅牢なプラットフォームを提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP antibody	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 antibody	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Supplement	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-glutamine supplement)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (basement membrane matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Supplement	Gibco	17502048	1%
Organoid Dissociation Reagent	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid Recovery Solution	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primary antimicrobial agent)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
Recombinant Human EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Recombinant Human Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinoic acid	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM