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方法論記事

老化細胞の調整培地を用いたin vitro モデルにおける健康な細胞間コミュニケーション回復のための抗酸化剤の新規結合

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DOI：

10.3791/70923

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2026年4月24日

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1Biotechnology Unit, Mesoestetic Pharma Group

この記事について

サマリー

この方法は、老化した皮膚線維芽細胞が健康な皮膚にどのように影響を与えるかを研究します。老化はUVB曝露によって誘発され、調整培地を正常な線維芽細胞に適用します。この方法は、皮膚の老化における細胞間コミュニケーションの変化を標的とした生物活性化合物の評価に役立ちます。

要約

皮膚の老化は、分子および細胞レベルでの変化によって引き起こされる多因子的なプロセスであり、いわゆる老化の特徴とも呼ばれます。これらの変化の一つに細胞間コミュニケーションの変化があり、皮膚組織の機能障害や構造的損傷に寄与します。ここでは、老化した線維芽細胞から調教培地を培養することで、これらの皮膚老化の特徴を模倣する in vitro モデルを提示します。まず、UVB照射を受けた線維芽細胞を光老化に関連する遺伝子発現の変化について解析できます。次に、UVB誘発性老化線維芽細胞から調教された培地を採取し、健康な線維芽細胞に移植することで、細胞外マトリックスタンパク質のダウンレギュレーションと炎症促進性サイトカイン遺伝子発現のアップレギュレーションをもたらします。これらの変化は、抗酸化物質(ビタミンC+イデベノン)の新規併用を用いることで相殺されます。これらの結果は、 in vitro モデルが新しい化合物の皮膚皮膚細胞老化特性に対する有効性を評価し、皮膚再生および若返りの細胞プロセスを調節する化合物の選定に利用できることを示しています。

概要

皮膚の老化とは、硬さや弾力性の喪失、たるみの増加など、皮膚機能や特性の自然な低下の過程です。これは紫外線(UV)曝露や汚染などの外部要因によって加速され、細胞を損傷し分子レベル1で変化を引き起こします。これらの変化は最近の研究でよく特徴付けられており、ゲノム不安定性、テロメアの喪失、エピジェネティックな変化、プロテオスタシスの喪失、マクロオートファジーの異常、栄養感知の制御不全、ミトコンドリア機能障害、細胞老化、幹細胞の枯渇、細胞間コミュニケーションの障害、慢性炎症、そしてジスバイオシス2が挙げられます。これらの特徴は、細胞内損傷が組織機能障害につながり、老化プロセスを有利にする仕組みを説明しています。興味深いことに、これらの変化は独立して作用するのではなく、相互依存的なネットワークシグネチャーを形成します。ゲノム損傷やエピジェネティックな変異などの一次損傷が蓄積し、最終的に細胞老化を引き起こします。皮膚の場合、これは主に紫外線による損傷によって引き起こされ、光老化が皮膚老化の特徴の主な要因です3。老化細胞は炎症促進サイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、成長因子の産生増加を示します。これは老化関連分泌表現型(SASP)とも呼ばれ、IL6、IL8、MMP1、MMP3、TNFA、IL1Aなどが含まれます4,5,6。これらの分泌因子は皮膚の構造的特性(皮細胞外マトリックスなど)に影響を与えるだけでなく、周囲細胞の機能も妨げます。これには、メラノサイトの活性化を刺激し、加齢に伴う皮膚色素沈着(幹細胞因子やIL18など)や周囲の健康な線維芽細胞の機能を変化させ、その機能を損なうサイトカインの放出が含まれ、老化表現型7,8,9,10,11の増幅に寄与します。その結果、慢性的な炎症や細胞間コミュニケーションの変化が、これらの分子変化をしわ、たるみ、シミ、硬さの喪失など老化の視覚的兆候へと変換する有害な状態の主要な促進因子となっています。

SASPの有害な影響に寄与する特定のタンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ルミネックス、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)、ウェスタンブロットなどのよく知られた技術で研究可能です(5,12)。しかし、このアプローチは個々の視点から特定のタンパク質を特定し、特定の作用機序を特徴づけるには有用ですが、完全なSASPが隣接する細胞に与える影響は考慮していません。ここでは、UVB誘導の老化性皮膚線維芽細胞が健康な隣接線維芽細胞に与えるSASPの影響を研究するin vitroプロトコルを提案します。これは老化による細胞間コミュニケーションの変化の特徴を模倣しています。前述の通り、紫外線は皮膚における細胞老化の主な要因です。したがって、現在のモデル3を構築するために、複製性またはがん遺伝子誘発性老化よりもUV損傷が損傷源として選ばれています。このために、老化性線維芽細胞が分泌する因子を含む培地(調整培地)を使用し、この培地で培養された健康な線維芽細胞で細胞機能のマーカーを定量化します。このプロトコルの下で、調整された培地が老化細胞から健康細胞へ移された後、UVB誘導性老化性線維芽細胞を収穫し、炎症促進や副分泌シグナル伝達に関与する遺伝子などの分子特性を定量化します。次に、老化性線維芽細胞から調教培地で処理された健康な線維芽細胞を採取し、SASPが隣接細胞に与える影響を特徴付け、細胞外マトリックス、成長因子、線維芽細胞活性化に関与する遺伝子を定量化します。したがって、関心化合物(COI)の効果は、初期に老化した線維芽細胞で、その後、調整培地で処理された健康な線維芽細胞で分析されます。これらの化合物に関しては、過去の研究で抗酸化物質が光老化誘発性皮膚老化の兆候を防ぎ、是正する効果があることが示されています。したがって、2種類の抗酸化物質(ビタミンCとイデベノン)の組み合わせにより、老化細胞および老化細胞の条件付き培地で培養された健康細胞の両方でUVBによる変化の一部を逆転させるために用いられます 13,14,15

全体として、このプロトコルはSASPが皮膚細胞に与える影響を研究し、細胞間コミュニケーションの変化を回復する新規分子や介入法を特定することを目的としており、これにより美容医療および再生皮膚科における再生および生体刺激製品に適しています。

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プロトコル

本研究で使用されたヒト皮膚線維芽細胞は、市販の細胞株提供者から入手されました。一次ヒトサンプル、患者データ、生 体内 実験は含まれていなかったため、本研究では機関審査委員会(IRB)の承認およびインフォームドコンセントは必要ありませんでした。

1. UVBを用いた真皮線維芽細胞における老化誘導

  1. 6ウェルプレート上で、6ウェルプレートに6個×10個4細胞の密度でヒト皮膚線維芽細胞をプレートし、10%胎児用牛血清(FBS)を添加して6ウェルプレートに配置します。
  2. 24時間後、細胞培養培地を取り出し、1ウェルあたり1mLのリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)に置き換えます。
  3. 細胞に25 mJ/cm²のUVB光を照射します。
    注:このエネルギーは、本プロトコルで使用されるUVB照射装置(材料表参照)に最適化されており、老化を引き起こすのに十分な損傷を与えつつ、アポトーシスを引き起こす過度な損傷を回避しています。他の装置を使用する場合は、照射エネルギーを適切に調整してください。
    注意:UVB放射線は危険です。適切な防護具とシールドを用いて、被曝を避けるようにしてください。
  4. PBSを除去し、1ウェルごとに新鮮な細胞培養培地2mLを加えます。
  5. 72時間後に細胞培養培地を取り出し、1ウェルあたり1mLのPBSを加え、ステップ1.3で説明した通りにUVB照射を繰り返します。
  6. 72時間後、培養培地を取り出し、1ウェルあたり0.05%トリプシン-EDTAを0.5mL加えます。37°Cで1〜2分間インキュベートし、その後1.5mLの新鮮培養培地で細胞を収穫します。
  7. 細胞培養培地(DMEMに10% FBSを補足)を用×6ウェルプレートで10個4個の 密度で細胞をプレートします。この工程の後に細胞老化が誘発されます。

2. 関心化合物を用いた老化細胞の処理

  1. 24時間後、培養培地を取り出し、関心のある化合物を含む培養培地2mLを加えます。
  2. さらに24時間後、ステップ1.1で説明されたように、6ウェルプレートに別のヒト皮膚線維芽細胞をプレートします。これらの細胞は、調整培地の移植のための健康な皮膚線維芽細胞として機能します。

3. 老化細胞から健康細胞への調整培地移動

  1. 老化細胞の化合物処理から48時間後、健康な線維芽細胞をプレート化してから24時間後に、老化細胞から1ウェルあたり2mLの調整培地を採取し、健康な線維芽細胞に移します。
    注意:健康な線維芽細胞から培養培地を除去し、調整培地を加える前に効率的に移植してください。
  2. 老化細胞に1mLのPBSを加え、ステップ1.6で説明したトリプシンで採取します。これらの細胞はELISAキットやqPCRを使って老化または炎症マーカーの解析に用いてください。
    注意:細胞ペレットは、下流アッセイがすぐに行われない場合、−80°Cで保管されることがあります。
  3. 健康な線維芽細胞を37°Cで5%のCO₂で24時間培養します。

4. 線維芽細胞活性化解析のための健康細胞の収穫

  1. 調整培地で24時間の培養後、ステップ1.6で説明した通りトリプシンを用いて健康な線維芽細胞を採取します。qPCRで細胞外マトリックスの遺伝子発現を解析します。
  2. qPCR解析を実施してください。
    1. 製造元の指示に従って細胞ペレットからRNAを抽出してください(RNA抽出キット)。
    2. 製造元の指示に従って200 ng RNAの逆転写を行います(逆転写キット)。
    3. 製造元の指示に従ってcDNAを増幅します(qPCRマスターミックス)。qPCRは以下の条件下で実施します:95°Cで30秒、その後95°Cで5秒、60°Cで30秒のサイクルを行います。使用されるプライマーは 表1に記載されています。
ジーンフォワードシーケンス逆シーケンス
CDKN2A5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3'5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3'
CDKN1A5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3'5'-CCAGGACTGAGGCTTCCT-3'
SCF5'-AATCCTCTCGTCAAAACGAAGG-3'5'-CCATCTCGCTTATCCACAATGA-3'
IL-185'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3'5'-GTTTGTTGGGAGAGAGG-3'
ELN5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3'5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3'
FBN15'-GGTGAATGTACAAACACAGAGTCAGCAG-3'5'-ATAGGAACAGAGCACAGCTTGTGTGA-3'
IL-65'-AGCCCTGAGAAAGAGAGACATGTA-3'5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3'
IL-85'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAAGGT-3'5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCTCT-3'
CTGF5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGTGT-3'5'-TGTCTCTCTAGGGTAGGCAGCTA-3
IGF15'-CAGAGCAGATAGAGCCTGG-3'5'-CAGGTAACTCGTGCAGCA-3'

表1:qPCRアッセイに使用されるプライマーの一覧。 このモデルで研究・定量された遺伝子に対応する各プライマーの順位配列と逆配列が提供されています。

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結果

本プロトコルは、 in vitroでの老化における細胞間コミュニケーションの変化の特徴をシミュレートする方法を説明しています。 図1 は、老化誘導、マーカー定量化、in vitroにおける皮膚細胞間コミュニケーションの変化解析など、プロトコルの主なステップを示す図示図を示しています。

figure-results-1
図1:プロトコルの図式的要約と主要なステップ。 プロトコルの主なステップの概略的概要。まず、健康な線維芽細胞においてUVB損傷を用いて老化を誘発します。次に、老化した線維芽細胞に関心化合物(COI)を投与し、細胞を...

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ディスカッション

分子レベルでの老化プロセスを理解することは、老化関連の特徴を遅らせ、細胞や組織の寿命と機能を延ばす新しいアプローチや介入を設計する鍵となります。老化の特徴の定義と特定は、これらの介入の開発のための科学的枠組みを確立する上で不可欠でした(2,16)。老化の特徴として認識されているのは、細胞間コミュニケーションの変化であり、細胞間のシグナル伝達が低下し機能不全を伴い、加齢に伴う組織の変性を引き起こします。老化した皮膚では、老化細胞の蓄積が炎症促進微小環境を促進し、隣接する非老化細胞の機能能力を変化させ、その結果、細胞活動を低下させることで組織損傷を悪化させます。この現象は細胞外マトリックスタンパク質や成長因子の合成減少、マトリックスメタロプロテイナーゼなどの有害タンパク質の増加に至り、最終的には皮膚の老化の兆候として現れます。これには、くすんだ肌色、硬さの低下、しわの出現など

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開示事項

すべての著者はMesoestetic Pharma Group, S.L.に雇用されていました。

謝辞

著者たちは、このプロジェクトにおける協力と助言に感謝申し上げます。

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材料

```html
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6ウェルプレートFisher Scientific10578911アッセイ（老化誘導と化合物処理）中に使用する細胞培養マルチウェルプレート
Bio-LINKクロスリンカーBLX-312/36（UVB照射装置）Vilber LourmatVL-6111-1090-1UVB照射による損傷を生じさせ、結果として老化を誘導するために使用する装置
Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）Merck Life scienceD6046-500ML皮膚線維芽細胞の標準培養培地
Fetal bovine serum（FBS）Fisher Scientific17593595細胞増殖のための成長因子、ホルモン、タンパク質、必須微量栄養素の供給源として使用される栄養補充物
H3K27me3 ELISAキットEpigentekP-3014T-096生物学的サンプルにおけるH3K27me3の表ピ遺伝子修飾を検出するための特異的免疫アッセイ
Human dermal fibroblastsPromocellC-12302真皮の主要な皮膚細胞で、皮膚の光老化を調節する
Phosphate buffered saline（PBS）Merck Life scienceD8537-500ML生理的環境を模倣する緩衝液。ストレスを誘導したり細胞の活性を低下させたりすることなく細胞を洗浄するのに使用
PrimeScript RT reagent kit（逆転写キット）Takara BioRR037A細胞から単離されたRNAからcDNAを取得するためのキット。RNA精製後のqPCRアッセイの2段階目。
TB Green Premix Ex Taq（qPCRマスターミックス）Takara BioRR420AcDNAからポリメラーゼ連鎖反応を生成し、遺伝子発現レベルを定量するためのキット。逆転写後のqPCRアッセイの3段階目。
Total RNA Purification Kit（RNA抽出キット）Norgen17200収穫した細胞からRNAを取得するためのキット。細胞収穫後のqPCRアッセイの1段階目。
Trypsin/EDTA 0.05%Merck Life scienceT2601-100ML細胞培養プレートから細胞を剥離するための収穫/伝代ステップに使用する酵素溶液
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参考文献

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