プロペントフィリンは、脊髄のアストロサイトおよびミクログリアにおけるERK1/2リン酸化を調節することで、切開術後痛覚過敏を緩和する

サマリー

本研究では、ラットにおいて髄腔内に投与したプロペントフィリンが切開後痛覚過敏を軽減させる効果があるか、また、その効果が脊髄のグリアマーカーの変化および細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）のリン酸化に関連しているかについて検討します。

要約

脊髄アストロサイト、ミクログリア、および細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）は、疼痛処理に関与していることが示唆されています。本研究では、術前の髄腔内プロペントフィリン（PPF）投与がラットの術後急性切開痛による痛覚過敏を軽減するか、またその効果が脊髄グリアマーカーおよびERK1/2のリン酸化に関連しているかを検討しました。66匹の雄性Sprague–Dawleyラットを、ブランク群、切開痛群、生理食塩水群、ジメチルスルホキシド群、PPF群、およびU0126群にランダムに割り付けました。機械的および熱的痛覚過敏を、ベースライン時および切開後2、4、8、24、72時間で評価しました。脊髄の神経およびグリアマーカー、p-ERK1/2、および炎症性メディエーターを、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法により評価しました。さらに、一次脊髄アストロサイトを用いた実験を行い、ERK1/2依存的な炎症性メディエーターの放出を検討しました。術前の髄腔内PPF投与は、72時間の観察期間を通じて機械的および熱的痛覚過敏を軽減したのに対し、U0126は主に切開後の早期に痛覚過敏を軽減しました。切開後4時間において、両治療ともに脊髄におけるGFAP、Iba-1、およびp-ERK1/2の発現低下と、TNF-αおよびCOX-2の免疫反応性の低下に関連していました。培養アストロサイトにおいて、PPFはLPS誘導性の炎症性メディエーター放出を抑制しましたが、構成的活性型ERK1/2はこの効果を減弱させました。これらの知見は、PPFの抗痛覚過敏効果が、切開後の脊髄グリア、ERK1/2関連、および炎症反応の調節に関連していることを支持しています。

概要

切開痛は、外科的手術後に一般的に見られる急性疼痛の一種であり、通常は7日を超えて持続することはありませんが、炎症性疼痛や神経障害性疼痛とは異なる複雑な病理学的メカニズムを有しています^1,2。切開痛の発生過程において管理が不十分な場合、慢性疼痛症候群へとさらに進行する可能性があり、その性質が急性組織損傷痛から神経障害性疼痛または混合性疼痛へと変化することがあります³。一般的に、切開後の鎮痛法としては、オピオイドや非ステロイド性抗炎症薬などの鎮痛薬の投与が最も一般的です。しかし、これらの薬剤を継続的または高用量で使用すると、多くの副作用が生じる可能性があり、より安全で効果的な鎮痛戦略の必要性が浮き彫りとなっています。

プロペントフィリン（PPF）がさまざまな疼痛プロセスにおける痛覚過敏を緩和することは、信頼できる根拠によって示されています^4,5。さらに、PPFの鎮痛効果は、p38やc-Jun N末端キナーゼ（JNK）などのミトゲン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）の脊髄での発現を抑制することによって、部分的に達成されることが分かっています⁶。p38およびJNK経路に対するPPFの効果は確立されていますが、疼痛シグナル伝達に関与するもう一つの重要なMAPKサブファミリーである細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）経路を調節する可能性については、急性切開痛においては未だ解明されていません。ERK1/2の活性化はp38やJNKとは異なる時間的・細胞的なパターンを示すため、独自の治療機会がある可能性が示唆されており、この知識の空白を埋めることは特に重要です。

アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイトを含むグリア細胞は、当初、神経組織の接続および支持構造であると考えられていました。しかし、近年の研究により、アストロサイトとミクログリアがシナプス可塑性の調節や痛みの情報の伝達において重要な役割を果たすことが示されています⁷。脳および脊髄の常在性マクロファージであるミクログリアは、疼痛プロセスの非常に早い段階で、いくつかの細胞外刺激信号によって活性化され、その後増殖して大量の炎症性サイトカインを放出することで、脊髄から脳への痛み信号の伝導を増強させます^8,9。同時に、活性化したアストロサイトは、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の放出をアップレギュレートし、細胞間コミュニケーションを強化することで、感覚ニューロンに直接情報を送信することができます¹⁰。

切開誘発痛の初期段階（最初の24時間以内）ではアストロサイトの活性化が起こり、一方でミクログリアの活性化はかなり後になってから現れることが研究で示されています^11,12。さらに、ある研究では、切開誘発痛における機械的痛覚過敏に対して、活性化ミクログリアの影響は限定的であることが示されました¹³。これらの知見は、急性疼痛におけるアストロサイトとミクログリアの異なる役割について、依然として疑問が残っていることを強調しています。グリア変調剤であるプロペントフィリン（Propentofylline）は、慢性神経締め付け損傷、急性神経損傷、および急性組織損傷後のアストロサイトおよびミクログリアの活性化を調節することで、痛覚過敏を緩和することが報告されています^4,5。しかし、現在の知る限り、急性切開誘発痛におけるアストロサイトまたはミクログリアの活性化に対するPPFの効果を検討した研究はありません。

mitogen-activated protein kinase 1および2（MEK1/2）の下流で活性化される主要なMAPKサブファミリーである細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）は、侵害受容処理および神経可塑性に広く関与している^14,15。先行研究により、リン酸化ERK1/2（p-ERK1/2）は侵害刺激によって脊髄ニューロンで誘導されること、また炎症性または神経障害性疼痛状態でアストロサイトやミクログリアにおいても検出されることが示されている^16,17,18,19。さらに、MEK1/2–ERK1/2シグナリングを薬理学的に阻害することで、複数の疼痛モデルにおいて機械的および熱的痛覚過敏が軽減することが報告されている^{20,21,22,23,24,25}。

しかしながら、急性切開によって活性化される脊髄ERK1/2の細胞分布、特にアストロサイトおよびミクログリアにおける分布と、切開誘発痛におけるその役割については、まだ十分に定義されていません。当研究グループによる先行研究では、PPFが脊髄のJNKおよびp38シグナリングを抑制することで、ラットの急性切開後痛覚過敏を緩和することが示されていますが、切開誘発痛においてPPFが脊髄グリア細胞のERK1/2関連シグナリングも調節するかどうかは不明なままです。したがって、本研究は、完全に独立したメカニズム的なパラダイムではなく、疼痛研究における既存のグリアおよびMAPKの枠組みを拡張するものと見なされるべきです。先行研究との主な相違点は、具体的に急性切開痛に焦点を当てていること、MAPK成分としてp38/JNKではなくERK1/2を検討していること、そしてPPF投与に関連してp-ERK1/2の初期の脊髄細胞分布を評価していることにあります。

本研究は、術前の髄腔内PPF投与がラット足底切開モデルにおける切開後痛覚過敏を軽減するかどうか、また、この効果がERK1/2のリン酸化や、脊髄神経およびグリアマーカーの発現変化、ならびに炎症性メディエーターである腫瘍壊死因子-α（TNF-α）およびシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）に関連しているかどうかを検討することを目的として設計されました。具体的に、本研究は、行動評価と時系列的なウェスタンブロット解析を組み合わせた点、MEK1/2阻害剤U0126との薬理学的比較を行った点、および急性切開痛モデルにおいて脊髄ニューロン、アストロサイト、ミクログリアにおけるp-ERK1/2の定性的な免疫蛍光局在解析を行った点で、先行報告とは異なります。本研究のメカニズム的枠組みは、グリア変調およびMAPKシグナル伝達と痛みの関連を示す既存の文献に基づいたものですが、切開後痛覚過敏の早期段階における脊髄ERK1/2関連のグリア反応の関与の可能性について、さらなる証拠を提供することを意図しています。

従来の術後鎮痛剤と比較して、経路標的アプローチでは特定のシグナル伝達成分を検証できますが、効果が限定的な時間に留まる可能性があり、侵襲的な投与が必要となる場合があります。MEK1/2–ERK1/2の阻害は、いくつかの実験的疼痛モデルにおいて抗痛覚過敏効果を示しています^{20,21,22,23,24,25}。PPFは、グリア応答を調節し、複数のMAPK関連プロセスに関与しているため、単一経路阻害剤とは異なります^4,5,6。実用的な臨床応用への移行は、前臨床デザイン、術前の髄腔内投与、雄ラットのみの使用、およびより大規模な外科モデルにおける用量設定および安全性試験の欠如によって依然として制限されています。

プロトコル

実施された実験は、中国甘粛省の蘭州大学第二附属病院倫理委員会（倫理承認番号：2017-070）によって承認されました。すべての手順は、国際疼痛研究協会のガイドライン²⁶に従って行われました。認定された実験動物センターから入手した、体重 200–250 g の成人雄性Sprague–Dawleyラット計66匹を使用しました。性別依存的なホルモンの影響に関連する潜在的な変動を抑えるため、本研究では雄性ラットのみを対象としました。すべてのプロトコルは国際疼痛研究協会のガイドライン²⁶に準拠して実施され、苦痛を最小限にするために必要な措置が講じられました。本研究で使用した試薬、消耗品、器具、およびソフトウェアの詳細な情報は、材料表に記載されています。

動物

ラットは手術前は2匹ずつ、切開後は個別に飼育し、餌と水は ad libitum（自由摂取）とした。室内は12時間明期・12時間暗期のサイクルで維持し、温度は24 °C ± 2 °Cに制御した。

髄腔内投与および切開痛モデル

溶液の髄腔内投与のため、ラットを1.5%–3%のセボフルラン（ノーズコーン経由で投与）で麻酔し、脊柱を屈曲させた腹臥位に配置した。腰部領域の被毛を剃除し、L5–L6椎間隙上の皮膚を消毒した。マイクロシリンジをL5–L6椎間隙から経皮的に挿入した。針を刺進させる際の突然の尾の跳ね上がりまたは尾の動きにより、クモ膜下腔への進入成功が示され、さらに緩やかな吸引時に脳脊髄液が出現することで確認した。これらの徴候が観察されない場合は、注入前に針の位置を調整した。両方の確認基準が満たされた後にのみ注入を行い、注入後に異常な神経学的徴候を示した動物は除外した。その後、各溶液をゆっくりと注入し、注入後に再び皮膚を洗浄した。手術時間は約3分で、ラットは通常5–10分以内に麻酔から回復した。

切開痛のラットモデルは、既報の手法に従って作製した²⁷。麻酔後、後肢の足底面を10%ポビドンヨードで消毒した。かかとから約0.5 cmの位置から始まり、指先に向かって足底の皮膚に1 cmの縦切開を加えた。切開は皮膚および筋膜まで到達させた。足底筋を眼科用鉗子で慎重に挙上し、組織全体の連続性を維持しながら縦方向に切開した。その後、筋肉を元の位置に戻し、軽く圧迫して止血を行い、3-0ナイロンを用いて2箇所のマットレス縫合で創部を閉鎖した。閉鎖後、切開部位を再度消毒した。手術後、ラットは個別に飼育し、強い光を避け、食物と水に自由にアクセスできる静かで暖かい環境で回復させた。術後に動物を観察し、あらかじめ定義した基準を満たさない個体は速やかに除外した。創傷感染の判定は、創周囲の赤み、腫脹、局所温度の上昇、悪臭を伴う異常な黄緑色の膿性滲出液、創口が閉鎖せず治癒が遅延している状態、壊死および拡大、ならびに体温上昇、嗜眠、摂食拒否などの全身症状に基づいて行った。その他の除外基準には、30分以内に麻酔から回復しなかった個体、術中の筋肉切断または神経血管損傷、術後の自傷行為、モデル作製に失敗した個体、および後肢麻痺や切開痛とは無関係な荷重不能などの神経学的欠損を含めた。創傷感染または創部離開が認められたラットは、本研究から除外した。

行動測定

後肢の機械的逃避閾値（PWMT）および熱逃避潜時（PWTL）を、群割り付けを知らされていない試験者が測定した。テストは、少なくとも10分間の馴化後、一日の一定の時間に静かな部屋で実施した。囲い、メッシュまたはガラス床、周囲の光、および熱源の強度は、すべての群で一定に保った。PWMTの測定では、校正済みのvon Freyフィラメント（0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g, および 15.0 g）を、フィラメントが約1–2 mm曲がるまで、創傷に隣接する足底面に垂直に適用した。連続的な刺激の間隔は2分とし、アップダウン法を用いて50% PWMTを決定した²⁸。PWTLの測定では、ラットをガラス床上の個別の透明な囲いに入れ、輻射熱源を創傷横の足底面に合わせた。組織損傷を防ぐために30 sのカットオフ時間を設定し、連続的な曝露の間隔は2分とし、3回の測定値の平均を記録した²⁹。足の挙上、振戦、または舐め動作を陽性の逃避反応とした。グルーミング、移動、または熱源のずれの影響を受けた試行は、再馴化後に繰り返した。

ウェスタンブロット解析

規定の時間に、ラットを頸椎脱骨により安楽死させ、L4–L6腰髄をプロテアーゼ阻害剤を添加したラジオ免疫沈降アッセイ（RIPA）溶解バッファーに100:1の比率で速やかに回収した。組織をホモジナイズして氷上で20分間保持し、4 °Cで15,000 × gで20分間遠心分離した。上清を4×ローディングバッファーと3:1の比率で混合し、沸騰水で5分間加熱した後、−80 °Cで保存した。タンパク質サンプル（1レーンあたり30 µg）を10%ドデシル硫酸ナトリウム–ポリアクリルアミドゲルで分離し、0.45または0.22 µmのポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に転写した。プレステイン分子量マーカーが期待通りに移動していること、および明らかなムラや転写の途切れがないことを確認し、転写の成功を検証した。膜を5%脱脂粉乳および3%ウシ血清アルブミンで室温で2時間ブロッキングし、NeuN（1:8,000）、GFAP（1:4,000）、Iba-1（1:3,000）、p-ERK1/2（1:1,000）、t-ERK1/2（1:3,000）、またはGAPDH（1:2,000）に対する一次抗体を用いて4 °Cで一晩インキュベートした。0.05% Tween 20を含むTris緩衝生理食塩水（pH 7.4）で洗浄後、対応するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（1:5,000）を用いて室温で1時間インキュベートした。シグナルを化学発光で検出し、各ターゲット内で同一の露光範囲を用いてフィルムに記録した。群分けを知らされていない解析者が、画像解析ソフトウェアを用いてバンド密度を分析した。画像を8ビットのグレースケールに変換し、各バンドに同一の矩形関心領域を適用し、隣接する空白領域の局所的なバックグラウンドを差し引いて、統合密度を記録した。1つのブロット上のすべてのレーンに対して、同一の領域サイズとバックグラウンド処理を用いた。NeuN、GFAP、Iba-1、およびt-ERK1/2はGAPDHで、p-ERK1/2はt-ERK1/2で標準化した後、値をブランク群に対する相対値として的に算出した。

免疫蛍光染色法

あらかじめ設定した時間に、ラットを3%ペントバルビタールナトリウム（1.5 mL/kg）で麻酔し、あらかじめ冷却した0.01 mol/Lリン酸緩衝生理食塩水（PBS; pH 7.4）300 mLを心臓から灌流させた後、あらかじめ冷却した4%パラホルムアルデヒド250 mLを灌流した。L4–L6脊髄を4%パラホルムアルデヒドで6時間後固定し、4 °Cで20%–30%ショ糖–PBSを用いて一晩凍結保護し、−22 °Cで10 µmの厚さに切断した。切片を0.01 mol/L PBSで洗浄し、室温で1時間、10%ヤギ血清でブロッキングした後、NeuN (1:100)、GFAP (1:1,000)、Iba-1 (1:100)、p-ERK1/2 (1:100)、TNF-α (1:200)、またはCOX-2 (1:50)に対する一次抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、対応する緑色または赤色の蛍光標識二次抗体（1:400）を用いて室温で1時間インキュベートし、さらに3回PBSで洗浄し、抗退色剤とカバーガラスを用いて封入した。各染色のバッチには、一次抗体を用いずに処理したネガティブコントロール切片を含めた。画像は、盲検化した調査者が蛍光顕微鏡を用いて取得した。低倍率の概観画像は10×対物レンズを用いて取得し、細胞の免疫反応性および共局在画像は、対応する図のパネルに従い20×または40×対物レンズを用いて取得した。同一の図および染色バッチ内での比較のため、対物レンズの倍率、照明強度、露光時間、検出器ゲイン、カメラ設定、および画像処理パラメータは、飽和以下で最適化した後に固定した。チャネルの重なりを最小限に抑えるため、個別の蛍光チャネルを順次取得した。動物1匹につき、同側の後角から重複しない3つの視野を撮影した。蛍光強度は、8ビット変換、細胞のない領域を用いた背景減算、および各染色バッチ内で同一の関心領域（ROI）と閾値を適用した後、画像解析ソフトウェアで定量化した。視野ごとの値を平均し、動物1匹あたりの1つの値とした。露光過多、組織の折り畳み、破れ、焦点不良、または背景が不均一な視野は除外し、同一の非飽和設定下で再取得した。組織構造が維持されており、標的シグナルが一次抗体なしのコントロールを上回り、かつ分析に影響を与える大きな折り畳み、破れ、または飽和領域がない場合に、染色を採択した。

In vitro一次脊髄アストロサイト実験

ラット一次脊髄アストロサイトを、完全培地を用いて、37 °C、5% CO₂の加湿インキュベーター内という標準的な無菌条件下で培養した。細胞が約70%–80%のコンフルエンスに達した時点で、コントロール群、LPS刺激群、LPS + PPF群、LPS + U0126群、およびERK1/2レスキュー群に割り当てた。PPFおよびU0126は10 µMの濃度で添加した。LPS刺激、薬剤処理、および回収条件は、各実験におけるパラレルウェル間で同一に維持した。経路選択性解析のため、細胞ライセートを回収し、p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-p38、total p38、p-JNK、total JNK、および対応するローディングコントロールについてウェスタンブロッティングを行った。パラレルウェルから培養上清を回収し、遠心分離により清澄化した後、製造元の指示に従い、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いてTNF-α、PGE2、およびIL-6を分析した。ウェスタンブロットのデンシトメトリーは、上述した画像解析原理に従って行った。レスキュー実験では、siRNAトランスフェクションにより内因性ERK1/2を抑制し、処理前に構成的活性型ERK1/2（CA-ERK1/2）発現コンストラクトを導入した。サイトカインのデータを解析する前に、ウェスタンブロッティングによりノックダウンおよび過剰発現の効率を確認した。活性siRNAまたはコンストラクトを用いずにトランスフェクション試薬に曝露させた細胞を、必要に応じて処置コントロールとして用いた。

実験デザイン

実験動物のサブグループ分け

乱数表法を用いてラットを6群に割り付け、行動試験および組織採取の前に群分けを完了させた。6群は、ブランク群（n = 6）、切開痛（IP）群（n = 18）、生理食塩水（NS）群（0.9% NS, 10 µL; n = 9）、PPF群（10 µg in 10 µL; n = 12）、ジメチルスルホキシド（DMSO）群（10% DMSO, 10 µL; n = 9）、およびU0126群（10 µg in 10 µL; n = 12）で構成した。ブランク群のラットには、足底切開および髄腔内投与のいずれも行わず、未処置の対照群とした。IP群のラットには、髄腔内投与による前処理を行わずに足底切開を施した。NS群、PPF群、DMSO群、およびU0126群のラットには、足底切開の30分前に、それぞれの薬剤を髄腔内に投与した。NS群をPPFの溶媒対照とし、DMSO群をU0126の溶媒対照とした。

プロペントフィリンおよびU0126の投与量

プロペントフィリンはグリア修飾薬であり、研究グループによる先行研究において急性痛覚過敏を緩和したことから、10 µgの用量を選択しました。U0126は、ERK1/2のリン酸化を阻害するために使用される、非ATP競合性MEK1/2阻害剤です。さまざまな疼痛モデルにおいて1–10 µgの有効な髄腔内投与量が報告されており^30,31,32、本研究では10 µgの用量を使用しました。U0126は10%ジメチルスルホキシドに溶解し、PPFは0.9%生理食塩水に溶解させました。最終濃度は1 µg/µLとしました。薬剤および溶媒は手術前に調製し、4 °Cで保存し、12 h以内に使用しました。

術前のプロペントフィリンまたはU0126の髄腔内投与による痛覚過敏への影響

各群から6匹のラットをランダムに抽出し、手術の24時間前に行動測定を行い、得られたPWMTとPWTLをベースラインとした。髄腔内投与は手術の30分前に行った。術前のPPFおよびU0126の髄腔内投与が機械的および熱的痛覚過敏に及ぼす影響を評価するため、切開後2時間、4時間、8時間、24時間、および72時間にPWMTとPWTLを測定した。

切開後の脊髄ニューロンおよびグリアマーカーの発現に対する、術前髄腔内投与プロペントフィリンまたはU0126の効果を評価するための実験デザイン

治療効果を評価するための適切な切開後のタイムポイントを決定するため、まずIP群において予備的なタイムコース解析を実施した。具体的には、IP群のラットを切開後2 h、4 h、24 h、および72 hに安楽死させ、脊髄における細胞マーカーNeuN、GFAP、およびIba-1の発現レベルをウェスタンブロット法で測定した（各タイムポイントにおいてn = 3）。この予備解析に基づき、NeuNの発現が4 hの時点で最高レベルに達したこと、および初期の分子変化が切開後痛覚過敏の初期形成に最も関連していると考えられたことから、切開後最初の4 hを早期観察ウィンドウとして選択した。ただし、4 hというタイムポイントは、切開後のすべての時間的な分子変化を代表させることを意図したものではない。

この選択したタイムポイントにおいて、髄腔内投与を受けたラットを安楽死させ、さまざまな細胞マーカーのWestern blot解析（各群 n = 3）および、さまざまな細胞種の形態の免疫蛍光評価（各群 n = 3）を行った。ブランク群では、ラットをランダムに屠殺し、Western blotによる脊髄におけるさまざまな細胞マーカー（NeuN、GFAP、およびIba-1）の基本発現レベル（n = 3）と、免疫蛍光によるさまざまな細胞（ニューロン、アストロサイト、およびミクログリア）の形態（n = 3）を測定した。したがって、ブランク群は切開および処置を行っていないベースラインコントロールとして機能した。

脊髄p-ERK1/2および炎症性メディエーターへの治療効果

p-ERK1/2の発現および炎症性サイトカインレベルに対する治療効果を評価するための適切な切開後時間点を決定するため、まずIP群において予備的なタイムコース解析を実施した。具体的には、IP群のラットを切開後2 h、4 h、24 h、および72 hに安楽死させ、ウェスタンブロット法を用いて脊髄のp-ERK1/2発現を測定した（各時間点につきn = 3）。このタイムコース実験の結果、および切開後にNeuN発現が最大となる時間点を踏まえ、術前の髄腔内PPFまたはU0126投与が脊髄のp-ERK1/2発現および炎症性サイトカインに及ぼす影響を評価するための固定時間点として、切開後4 hを選択した。この時間点は、切開後のあらゆる時間的変化を包括的に代表させるためではなく、初期のメカニズム観察ウィンドウとして選択したものである。

この選択したタイムポイントにおいて、髄腔内注射を投与したラットを安楽死させ、p-ERK1/2発現のWestern blot解析（各群 n = 3）および炎症性サイトカインの免疫蛍光評価（各群 n = 3）を行いました。ブランク群では、ラットをランダムに屠殺し、Western blotによる脊髄におけるp-ERK1/2の基本発現レベル（n = 3）および免疫蛍光による炎症性サイトカイン（TNF-αおよびCOX-2）の発現レベル（n = 3）を決定しました。これにより、ブランク群を非切開・非処置のベースラインコントロールとしました。

ニューロン、アストロサイトおよびミクログリアにおける脊髄p-ERK1/2の細胞内局在

切開後の脊髄におけるp-ERK1/2の細胞内分布をさらに評価するため、切開から4時間後にBlank群およびIP群において免疫蛍光染色を実施した（n = 3）。

統計解析

データは平均値 ± 標準偏差として表示している。サンプルサイズは、研究グループによる先行研究および予備実験に基づき決定した。行動データは、群を被験者間因子、時間を被験者内因子とする二元配置反復測定分散分析（ANOVA）により解析した。時系列のウェスタンブロットデータは、一元配置ANOVAの後、ボンフェローニ補正によるペア比較を用いて評価した。固定時点のウェスタンブロットおよび免疫蛍光データは、ボンフェローニ補正を伴う計画比較を用いた一元配置ANOVAで評価し、2群間の比較はStudentのt検定で評価した。正規性と分散の均一性は、それぞれShapiro–Wilk検定およびLevene検定で評価した。両側 p値 < 0.05を統計的に有意とした。統計解析は、Table of Materialsに記載の統計解析ソフトを用いて行った。in vitro アストロサイト実験では、独立した培養実験を解析単位として扱い、ウェスタンブロットのデンシトメトリーおよびサイトカイン濃度は、適宜、一元配置ANOVA後のボンフェローニ補正計画比較、またはあらかじめ指定した2群間比較に対するStudentの t-testを用いて比較した。

データの利用可能性：

本研究の結果を裏付けるデータは、Supplementary File 1に提供されています。

結果

切開および術前のプロペントフィリンまたはU0126の髄腔内投与が、切開後の痛覚過敏に及ぼす影響

機械的痛覚過敏

術前24時間において、6群間にPWMTの有意な差は認められなかった（p > 0.05; Figure 1A,B）。IP群では、切開後にPWMTが低下し、切開後2時間から72時間までベースラインよりも有意に低い値を示した（ベースラインと比較して p < 0.05; Figure 1A）。NS群およびDMSO群では、切開後の各時点間でPWMTに有意な差は認められなかった（IP群と比較して p > 0.05; Figure 1B）。PPF群では、切開後2時間から72時間までPWMTがIP群よりも有意に高く（IP群と比較して p < 0.05; Figure 1A）、切開後72時間において、ベースラインとの間に有意な差は認められなくなった（ベースラインと比較して p > 0.05; Figure 1A）。U0126群では、切開後24時間までPWMTがIP群よりも有意に高かったが（IP群と比較して p < 0.05; Figure 1A）、この効果は切開後72時間まで持続せず、PWMTはベースラインより有意に低いままであり、IP群との間に有意な差は認められなくなった（ベースラインと比較して p < 0.05; IP群と比較して p > 0.05; Figure 1A）。

熱痛覚過敏

術前24時間時点において、6群間にPWTLの有意な差は認められなかった（p > 0.05; Figure 1C,D）。IP群では、PWTLは術前の24.85 s ± 1.06 sから、切開後4時間で4.38 s ± 1.02 sまで低下し、その後切開後72時間で18.37 s ± 1.38 sまで部分的に上昇したが、観察期間を通じてベースラインよりも有意に低いままであった（p < 0.05 vs ベースライン; Figure 1C）。NS群およびDMSO群では、切開後の各時点間でPWTLに有意な差は認められなかった（p > 0.05 vs IP群; Figure 1D）。PPF群では、72時間の観察期間を通じて、PWTLはIP群よりも有意に高く（p < 0.05 vs IP群; Figure 1C）、切開後72時間には、ベースラインと有意な差がないレベルまで回復していた（p > 0.05 vs ベースライン; Figure 1C）。U0126群では、切開後24時間まではPWTLがIP群よりも有意に高かったが（p < 0.05 vs IP群; Figure 1C）、この効果は切開後72時間まで維持されず、PWTLはベースラインより有意に低いままであり、IP群とも有意な差は認められなくなった（p < 0.05 vs ベースライン; p > 0.05 vs IP群; Figure 1C）。

切開後の脊髄細胞マーカー発現および細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）リン酸化の経時的変化に関するウェスタンブロット解析

PVDFメンブレン上で、特定の抗体を用いて、NeuN (48および50 kD)、GFAP (50 kD)、Iba-1 (17 kD)、p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD)、t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD)、およびGAPDH (36 kD) を含む、正確な分子量における複数のバンドが同定された。GAPDHのバンドはNeuN、GFAP、Iba-1、およびt-ERK1/2のコントロールとして使用され、t-ERK1/2のバンドはp-ERK1/2のコントロールとして使用された。

IP群の脊髄におけるウェスタンブロッティングデータでは、切開後にさまざまな程度の増加が認められた(Figure 2A)。ニューロン特異的核タンパク質の発現は、切開後4時間で最大値に達し(p < 0.001 vs baseline; Figure 2A)、切開後72時間後でも有意に高い値を示した(p < 0.001 vs baseline; Figure 2A)。グリア線維性酸性タンパク質のレベルは、72時間の観察期間を通じて緩やかに増加し(p < 0.001 vs baseline; Figure 2A)、測定した時間点の中では72時間後で最高値となった。同様に、Iba-1も切開後4時間で有意に増加し(p < 0.001 vs baseline; Figure 2A)、その後は狭い範囲内で変動した。注目すべき点として、IP群の脊髄のウェスタンブロッティングデータでは、ERK1/2の活性化は切開後24時間までのみ増加したが(p < 0.05 vs baseline; Figure 2B)、切開後72時間では減少しており(p < 0.05 vs baseline; Figure 2B)、一方でt-ERK/2の発現はいずれの時間点においても有意な変化を示さなかった。

術前のプロペントフィリンまたはU0126の髄腔内投与が脊髄における細胞マーカーおよびリン酸化細胞外信号調節キナーゼ1および2（phospho-extracellular signal-regulated kinase 1 and 2）の発現に及ぼす影響のウェスタンブロット解析

ウェスタンブロッティングのデータから、NeuNの発現は切開後4時間で最高レベルに達し、このとき行動測定値が最低しきい値にあることが示されました。したがって、手術30分前に髄腔内投与したPPFおよびU0126が細胞マーカーの発現およびERK1/2のリン酸化に及ぼす影響を、切開後4時間で評価しました。

ウェスタンブロッティングのデータにより、切開4時間後において、空白群と比較してIP群ではすべての細胞マーカーの脊髄における発現が有意に増加していることが示された（p < 0.05 vs baseline; Figure 3）。IP群と比較して、術前の髄腔内PPF投与は、NeuN（p < 0.05 vs IP群; Figure 3A）、GFAP（p < 0.05 vs IP群; Figure 3B）、およびIba-1（p < 0.01 vs IP群; Figure 3C）の脊髄における発現を減少させた。また、IP群と比較して、術前の髄腔内U0126投与も、NeuN（p < 0.01 vs IP群; Figure 3D）、GFAP（p < 0.05 vs IP群; Figure 3E）、およびIba-1（p < 0.01 vs IP群; Figure 3F）の脊髄における発現を減少させた。しかしながら、空白群と比較した場合、PPF群のNeuN発現はベースラインよりも有意に高いままであったが（p < 0.01 vs baseline; Figure 3A）、U0126群のNeuN発現は空白群よりも有意に低かった（p < 0.01 vs baseline; Figure 3D）。GFAPおよびIba-1については、Figure 3に示す通り、IP群との比較を重点的に記載している。術前の髄腔内NSおよびDMSO投与は、いずれの細胞マーカーの発現にも有意な影響を及ぼさなかった。

ウェスタンブロッティングのデータにより、切開から4時間後において、脊髄t-ERK1/2の発現はBlank群、IP群、NS群、およびPPF群の間で有意な差がないことが示された（図4A）。対照的に、切開後4時間において、ブランク群と比較してIP群およびNS群ではp-ERK1/2の発現が有意に増加していた（p < ブランク群に対して0.001； 図4B）。IP群と比較して、術前の髄腔内PPF投与により、切開4時間後のp-ERK1/2発現が有意に抑制された（p < 0.001 対 IP群； 図4B）。NS群と比較して、PPF群におけるp-ERK1/2の発現も有意に低かった（p < 0.01 対 NS群； 図4B）。しかし、ブランク群と比較して、PPF群におけるp-ERK1/2の発現は切開から4時間後においても有意に高いままであった。同様に、切開から4時間後における脊髄t-ERK1/2の発現は、ブランク群、IP群、DMSO群、およびU0126群の間で有意な差は認められなかった（図4C）。ブランク群と比較して、切開4時間後のIP群およびDMSO群では、p-ERK1/2の発現が有意に増加した（p < 0.001 対比 ブランク群； 図4D）。IP群と比較して、術前の髄腔内U0126投与により、p-ERK1/2の発現が有意に抑制された（p < 0.001 対 IP群； 図4D）。DMSO群と比較して、U0126群におけるp-ERK1/2の発現も有意に低かった（p < 0.001 vs DMSO群； 図4D）。注目すべきことに、切開4時間後におけるU0126群のp-ERK1/2発現は、ブランク群と比較して有意な差は認められなかった。また、NSまたはDMSOによる前処理は、IP群と比較してp-ERK1/2発現に有意な影響を及ぼさなかった。

脊髄細胞マーカーおよび炎症性メディエーターの免疫蛍光観察

免疫蛍光染色の結果から、切開後4時間において、対側と比較して同側の後角でNeuN免疫反応性が定性的に強くなることが示された（Figure 5）。空白群では、代表的な画像において、同側脊髄後角におけるNeuN、GFAP、およびIba-1のベースラインの免疫反応性が示された（Figure 6A–C）。IP群では、NeuN免疫反応性は空白群よりも定性的に強く（Figure 6D vs Figure 6A）、GFAP免疫反応性も強く（Figure 6E vs Figure 6B）、Iba-1免疫反応性も同様に増加していた（Figure 6F vs Figure 6C）。同時に、IP群のアストロサイトおよびミクログリアは、細胞体が肥大し、突起が太く、より高度に分枝しており、肥大化したように見られた（Figure 6E,F）。

PPF群では、代表的な画像から、IP群と比較してNeuNの免疫反応性が弱く(Figure 6G vs Figure 6D)、GFAPの免疫反応性が弱く(Figure 6H vs Figure 6E)、Iba-1の免疫反応性が弱い(Figure 6I vs Figure 6F)ことが示唆された。U0126群においても同様に、代表的な画像から、IP群と比較してNeuNの免疫反応性が弱く(Figure 6J vs Figure 6D)、GFAPの免疫反応性が弱く(Figure 6K vs Figure 6E)、Iba-1の免疫反応性が弱い(Figure 6L vs Figure 6F)ことが示唆された。PPF群とU0126群の両方において、アストロサイトとミクログリアは肥大化が軽減しているように見え、細胞体が小さく、突起の数も少なく細くなっていた(Figure 6H,I,K,L)。NeuN、GFAP、およびIba-1の対応する蛍光強度解析の結果は、これらの代表的な免疫蛍光観察の結果と一致していた(Figure 6M–O、それぞれ)。

切開から4時間後、IP群の同側後角におけるTNF-αおよびCOX-2の免疫反応性と相対蛍光強度は、ブランク群と比較して増加していた。術前の髄腔内PPFまたはU0126投与後、これら両方の指標は低下した（図7A–C）。

免疫蛍光染色による脊髄p-ERK1/2の細胞内局在化

免疫蛍光染色の結果、コントロール群では、脊髄におけるp-ERK1/2の免疫反応性は弱く、NeuN陽性ニューロンでのみ観察された（Figure 8A–C）。対照的に、切開から4時間後には、同側の脊髄後角においてp-ERK1/2の免疫反応性が著しく増加し、ニューロンだけでなく、GFAP陽性アストロサイトおよびIba-1陽性ミクログリアとも共局在していた（Figure 8D–I）。この知見は、切開によってp-ERK1/2の細胞分布が拡大し、基線状態のニューロンのみから、損傷後のニューロン、アストロサイト、およびミクログリアへと広がったことを示している。

In vitro における脊髄アストロサイトの ERK1/2 依存性メカニズムの検証

PPFが細胞レベルでERK1/2関連シグナリングを介して炎症性メディエーターの放出を抑制できるかどうかをさらに評価するため、ラット一次脊髄アストロサイトをLPSで刺激し、PPFまたはU0126（10 µM）で処理した。ウェスタンブロット分析の結果、PPFはLPS誘発性のp-ERK1/2発現を減少させた一方、p-p38およびp-JNKのリン酸化には顕著な変化は見られず（Figure 9A）、これらの条件下におけるERK1/2経路への相対的な選択性が裏付けられた。並行して、培養上清中のTNF-α、PGE2（COX-2活性の下流産物）、およびIL-6レベルは、Stim群と比較してPPFにより減少しており、U0126でも同様の抑制効果が認められた（Figure 9B）。

持続的なERK1/2活性化がPPFの抗炎症作用を弱めるかどうかを検証するため、レスキュー実験を行った。siRNAを用いて内因性ERK1/2をノックダウンし、その後、構成的に活性化されたERK1/2（CA-ERK1/2）構築物を導入した（図9C）。CA-ERK1/2を発現するアストロサイトにおいて、PPFによるTNF-α、PGE2、またはIL-6レベルの減少幅は低下した（図9D）。この結果は、このin vitroアストロサイト系において、ERK1/2リン酸化の抑制がPPFの抗炎症作用に寄与していることを示している。

総合的に見て、これらのin vitroでの知見は、PPFが脊髄アストロサイトにおいてERK1/2依存的なメカニズムを通じて炎症性メディエーターの放出を抑制するという細胞レベルでの機序的根拠を提供し、in vivoでの観察データを補完するものである。

図1: 切開誘発性の機械的および熱的痛覚過敏に対する術前髄腔内PPFまたはU0126の効果。 (A) blank、IP、PPF、およびU0126群におけるPWMT。 (B) IPおよびvehicle-control群におけるPWMT。 (C) blank、IP、PPF、およびU0126群におけるPWTL。 (D) IPおよびvehicle-control群におけるPWTL。 データは平均値 ± SD（各群 n = 6 匹のラット）であり、二元配置反復測定分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）により解析した。 ***p < 0.001（ベースラインと比較）、#p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001（IP群と比較）。 こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 2: 切開後の脊髄細胞マーカー発現および ERK1/2 リン酸化のタイムコース。 (A) 切開後ベースラインから 72 h までの IP 群における NeuN、GFAP、および Iba-1 の定量化および代表的なウェスタンブロット。 (B) 同期間における t-ERK1/2 および p-ERK1/2 の定量化および代表的なウェスタンブロット。値はブランク群 (100%) に対して正規化し、平均値 ± SD (各時点につき n = 3 匹のラット) として示した。全体的な差異は、示されたペア比較を用いた一元配置分散分析 (one-way ANOVA) により解析した。ベースラインに対し、*p < 0.05, **p < 0.01 および ***p < 0.001。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 3: 切開後 4 時間における脊髄神経およびグリアマーカーに対する術前髄腔内 PPF または U0126 の影響。 (A–C) blank群、IP群、生理食塩水群、および PPF 群における NeuN、GFAP、および Iba-1。 (D–F) blank群、IP群、ジメチルスルホキシド群、および U0126 群における NeuN、GFAP、および Iba-1。代表的なウェスタンブロットを右に示す。値は blank 群（100%）に対して標準化し、平均値 ± SD（各群 n = 3 匹のラット）として示した。*p < 0.05, **p < 0.01 および ***p < 0.001 は blank 群に対して、#p < 0.05 および ##p < 0.01 は IP 群に対して、Δp < 0.05, ΔΔp < 0.01 および ΔΔΔp < 0.001 は対応する溶媒群に対して有意差があることを示す。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 4: 切開後 4 時間における脊髄 ERK1/2 リン酸化に対する術前髄腔内 PPF または U0126 の影響。 (A,B) blank群、IP群、生理食塩水群、および PPF群における t-ERK1/2 および p-ERK1/2。 (C,D) blank群、IP群、ジメチルスルホキシド群、および U0126群における t-ERK1/2 および p-ERK1/2。代表的なウェスタンブロットを右に示す。値は blank群（100%）に標準化し、平均値 ± SD (n = 各群 3 匹のラット) として示した。**p < 0.01 および ***p < 0.001 は blank群に対して； ###p < 0.001 は IP群に対して； ΔΔp < 0.01 および ΔΔΔp < 0.001 は対応する溶媒投与群に対して。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 5: 切開後の同側および対側脊髄におけるNeuN免疫反応. 切開から 4 h 後のIP群における代表的な腰髄横断面で、対側および同側の後角にNeuN染色が見られる。この画像は n = 3 匹のラットの代表例であり、定性的な解剖学的比較のために提供されている。スケールバー = 500 µm. こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 6: 切開 4 時間後の脊髄神経細胞およびグリア細胞の免疫反応性に及ぼす PPF および U0126 の影響。 (A–C) 空白群における NeuN、GFAP、および Iba-1。 (D–F) IP 群における対応する染色。 (G–I) PPF 投与後の対応する染色。 (J–L) U0126 投与後の対応する染色。 (M–O) それぞれ NeuN、GFAP、および Iba-1 の相対蛍光強度。バーは平均 ± SD (1 群あたり n = 3 匹のラット) を示す。示された比較において *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。スケールバー = 200 µm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 7: 切開および治療後の脊髄における TNF-α および COX-2 の免疫反応。 (A) 切開 4 時間後における、blank群、IP群、PPF群、および U0126群の代表的な TNF-α および COX-2 の画像。 (B) TNF-α の相対的蛍光強度。 (C) COX-2 の相対的蛍光強度。棒グラフは平均 ± SD (各群 n = 3 匹のラット) を示す。***p < 0.001 は示された比較における有意差を示す。スケールバー = 200 µm。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 8: 切開 4 時間後における脊髄 p-ERK1/2 の細胞内局在。 (A–C) 空白群における p-ERK1/2 と NeuN、GFAP、Iba-1 それぞれとの共染色。 (D–F) IP 群における対応する共染色。矢印は代表的な共局在細胞を示す。赤色は p-ERK1/2、緑色は細胞マーカー、黄色は共局在を示す。 (G–I) それぞれ NeuN 陽性、GFAP 陽性、Iba-1 陽性領域に関連する相対的蛍光強度。棒グラフは平均 ± SD (各群 n = 3 匹のラット) を示す。示された比較において **p < 0.01 および ***p < 0.001。スケールバー = 100 µm。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 9: ラット一次脊髄アストロサイトにおけるPPFのERK1/2依存的な抗炎症効果。 (A) PPFが、p-p38またはp-JNKに顕著な影響を与えることなく、LPS誘導性のp-ERK1/2を減少させたことを示す代表的なウェスタンブロット。 (B) LPS、PPF、またはU0126処理後の培養上清におけるTNF-α、PGE2、およびIL-6濃度。 (C) siRNAによるERK1/2ノックダウンおよび恒常活性型ERK1/2（CA-ERK1/2）の発現を確認するウェスタンブロット。 (D) PPF存在下または非存在下でのCA-ERK1/2発現後のTNF-α、PGE2、およびIL-6濃度。棒グラフは独立したin vitro実験の平均値 ± SDを示す。 ***p < 0.001（示された比較において）、nsは有意差なし。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足ファイル 1：本研究の結果を裏付けるデータ。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

多くの患者が手術後に、身体的な面だけでなく、時には精神的な面でも急性疼痛に苦しみます³³が、術後急性疼痛の詳細なメカニズムについては依然として不明な点が多くあります。鎮痛薬の強力な効果に伴い、避けられない副作用が生じるため、より安全で効果的な鎮痛薬の探索が極めて重要となっています。本研究は、準備が容易で実現可能な、術後急性疼痛をシミュレートするためにあらかじめ検証されたラット切開モデルに基づいています²⁷。本研究では、切開後の脊髄ニューロンおよびグリアマーカー、ERK1/2のリン酸化、および炎症性メディエーターの変化を評価し、術前の髄腔内PPF投与による抗痛覚過敏効果が、脊髄におけるERK1/2のリン酸化および炎症性サイトカイン発現の並行した変化と関連しているかどうかを検討しました。

切開後、IP群のラットでは強力な機械的および熱的痛覚過敏が発現したが、溶媒による前処理は行動的または分子的な結果のいずれに対しても検出可能な影響を及ぼさなかった。これらの所見はモデルの安定性を裏付けるものであり、PPF群およびU0126群で観察された効果が、注射の手順や溶媒自体に起因する可能性は低いことを示している。加えて、切開後にNeuNの発現が増加したが、この変化はニューロンの活性化の直接的な証拠ではなく、ニューロンマーカーの発現変化として慎重に解釈されるべきである。以上の観察結果を合わせると、切開痛の初期発生におけるグリアおよびERK1/2関連の反応を検討するための根拠となる。

グリア細胞は、シナプス形成、シナプス情報の伝達と統合、およびシナプス可塑性の調節において重要な役割を果たすことが示されています。痛み処理におけるグリア細胞の免疫学的および前炎症的機能、特に活性化された脊髄アストロサイトおよびミクログリアの機能は、痛覚過敏や術後の行動変化の媒介に関与する中枢性感作を増強させる可能性があります^7,34。脊髄における不適応的な神経学的変化は、有害刺激または非有害刺激に対する反応性の増大につながる可能性があります。脊髄アストロサイトおよびミクログリアの活性化が、脊髄神経損傷モデル³⁵、t-PA（組織プラスミノーゲン活性化因子）誘発性疼痛¹⁶、切開痛^11,12、および骨がん痛^19,31における痛覚過敏の発現と維持に関与していることを示す多くの証拠があります。したがって、脊髄グリアの活性化は複数の疼痛状態に共通する特徴であると考えられ、切開痛におけるその役割をさらに探索することは、術後疼痛メカニズムに関する現在の理解を深めることにつながる可能性があります。

今回の知見は、切開後の早期の神経炎症反応に脊髄のアストロサイトとミクログリアが関与しているという見解を支持するものである¹²。GFAP、Iba-1、およびp-ERK1/2は、同一の時間的パターンを示すのではなく、部分的に異なるタイムコースを示した。このことは、術後痛の発生の異なる段階に、それぞれ異なるグリア関連プロセスが寄与している可能性を示唆している^31,35。免疫蛍光染色の結果において、切開後にアストロサイトとミクログリアに肥大化した形態学的変化が見られたことも、この解釈をさらに裏付けている。TNF-αおよびCOX-2の免疫反応性の増加と合わせると、これらの観察結果は、グリアに関連する炎症性シグナル伝達が急性切開後痛覚過敏に寄与するという概念と一致している^7,36。

メチルキサンチンの誘導体であるプロペントフィリン（PPF）は、抗血小板活性および長期記憶維持のサポート作用があることから、当初は脳血管活性薬として研究されていました³⁷。しかし、PPFのグリア細胞に対する調節効果により、鎮痛薬としても有用である可能性があります。研究によれば、PPFは細胞内サイクリックAMPの分解を抑制し、細胞外アデノシンの再取り込みを減少させることで、ミクログリアの活性化を阻害できることが示されています^4,5。また、in vitro研究において、PPFはTNF-α誘発性の哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mTOR）経路を妨げることで、アストロサイトの増殖を抑制しました⁶。したがって、PPFのグリア細胞に対する調節効果が、疼痛プロセスの調節への関与を可能にしています。

本研究におけるPPFの持続的な抗痛覚過敏効果は、GFAPおよびIba-1の発現減少とともに、本モデルにおけるPPFの鎮痛作用においてグリア変調が重要な要素であるという解釈を裏付けている。先行研究においても、疼痛状態においてPPFがグリア関連の炎症性シグナリングを抑制する可能性が示唆されている^5,31。加えて、TNF-αとCOX-2の並行した減少は、PPFがグリア関連の炎症反応を抑制することで切開痛を一部軽減させている可能性を示唆している。しかし、本データは機序を証明するものではなく相関を示すものであるため、これらの知見は直接的な因果経路の証明ではなく、グリアの関与を支持するものとして解釈されるべきである。

重要な細胞内信号調節キナーゼであるERK1/2が、（脳および脊髄における神経興奮性とシナプス可塑性を媒介することで）さまざまな疼痛プロセスの発生と維持に関与していることが証明されています²¹。例えば、ある研究では、カプサイシンまたはホルマリンの注射により脊髄内でp-ERK1/2が短時間かつ急速に増加しましたが、完全フロイントアジュバントまたは蜂毒の注射後には（短期間の潜伏期を経て）脊髄のERK1/2活性化がより長時間持続することが示されました^38,39。逆に、別の研究では、神経損傷によって誘発された脊髄のERK1/2活性化は極めて早期にピークに達し、その後しばらく持続し、p-ERK1/2のピーク後に痛覚過敏が発現しました³⁵。したがって、ERK1/2のリン酸化はさまざまな疼痛プロセスの異なる段階で起こる可能性があり、脊髄におけるp-ERK1/2の上昇は、即時的な誘発と長期的な遺伝子応答の両方にとって重要であると考えられます。

本研究において、切開によるERK1/2のリン酸化は、対照群と比較して切開後24時間以内に有意に増加し、p-ERK1/2の発現は切開後4時間でピークに達した（既報の通り）²⁴。これはNeuNの発現が最高となる時点と一致していた。同時に、免疫蛍光染色の結果により、切開誘導性のERK1/2リン酸化は、同側脊髄後角のニューロン、アストロサイト、ミクログリアに同時に分布していることが明らかになり、ERK1/2関連シグナル伝達が切開後痛覚過敏の早期段階に特に関与しているという見解を支持する結果となった。さらに、術前の髄腔内へのU0126投与により、切開後4時間における脊髄グリアマーカー、NeuN、およびp-ERK1/2の発現が抑制され、切開後早期における機械的および熱的痛覚過敏が緩和された。このことは、脊髄のp-ERK1/2が切開後の急性痛覚過敏の早期段階に関与している可能性を示唆している。しかし、GFAP、Iba-1、p-ERK1/2、および行動学的結果はそれぞれ異なる時間的プロファイルを示したため、本研究におけるメカニズムの解釈は、術後全期間に一般化させるのではなく、4時間時点に代表される切開後早期段階に限定されるべきである。

さらに、本研究において、術前の髄内PPF投与は切開後4時間におけるERK1/2のリン酸化も抑制しており、脊髄のNeuN、GFAP、およびIba-1の発現に認められた変化が、少なくとも部分的にはERK1/2関連シグナル伝達に関連している可能性が示唆された。術前の髄内U0126投与においてもTNF-αおよびCOX-2の免疫反応性が低下しており、切開後のERK1/2リン酸化と炎症性メディエーターの発現との間に、関連がある可能性が支持された。図9に示す追加のin vitroアストロサイト実験では、ERK1/2の持続的な活性化によってTNF-α、PGE2、およびIL-6の放出を抑制するPPFの能力が弱まったため、ERK1/2依存的な抗炎症成分が存在するという細胞レベルでの裏付けが得られた。しかしながら、これらのレスキュー実験は、無傷の脊髄ではなく培養アストロサイトを用いて行われており、またin vivoでのレスキュー実験や細胞型特異的な操作が行われていないため、in vivoにおける結論は、因果的なERK1/2依存的メカニズムの決定的な証明ではなく、あくまでそれを支持するものとして解釈されるべきである。

グリア細胞の活性化、p-ERK1/2の発現、および炎症性サイトカインの放出の間の相関関係をさらに考察するため、免疫蛍光染色で観察された空間的局在パターンについて検討した。切開後4時間において、脊髄後角ではp-ERK1/2がGFAP陽性アストロサイトおよびIba-1陽性ミクログリアと共発現していた。PPFおよびU0126の両者がp-ERK1/2、TNF-α、およびCOX-2の発現低下に関連していることを示すウェスタンブロットおよび免疫蛍光染色の結果と合わせると、これらのデータは、脊髄グリア細胞におけるERK1/2のリン酸化が切開後の炎症反応に関与している可能性を示唆している。初代アストロサイトを用いたin vitroデータは、PPF処置、ERK1/2の抑制、および炎症性メディエーターの放出との間の直接的な細胞内連携をさらに支持している。しかしながら、in vivoでの証拠は相関関係および処置に伴う平行的な変化を示すにとどまっており、細胞実験はin vivoにおける細胞型特異的な因果関係の検証を補完するものではあるが、それに代わるものではない。免疫蛍光分析は限られた数の動物および視野に基づいているため、これらの観察結果は、ウェスタンブロットおよびin vitroの結果と併せて慎重に解釈されるべきである。

いくつかの手順上のステップは、再現性に不釣り合いなほど大きな影響を及ぼします。髄腔内注射では、特徴的な尾の反応と髄液の確認の両方が必要です。注射中の抵抗がある場合、確認が不十分な場合、または新たな神経学的欠損が現れた場合は、同一部位への再注射ではなく、除外を検討すべきです。行動テストは、馴化、ケージ条件、刺激の配置、および研究者の期待に敏感であるため、ブラインド化、固定の間隔、および一貫した環境条件が不可欠です。組織採取の時間、均一なタンパク質転写、抗体インキュベーション、および各染色バッチ内での同一の顕微鏡設定も同様に重要です。よくある問題としては、不十分な馴化による逃避閾値のばらつき、不完全な転写や過剰露出によるウェスタンブロットバンドの弱化または不均一化、および洗浄不足、過剰な抗体濃度、または飽和した撮像設定による高い蛍光背景などが挙げられます。

本プロトコルは、研究目的に応じて変更することが可能です。後期のグリア反応に関心がある場合は、より広範なタイムコースを設定でき、トランスレーショナルな実現可能性を優先する場合は、用量設定試験や代替の投与経路を追加できます。炎症性または神経障害性疼痛モデルと比較して、足底切開モデルは比較的迅速かつ実用的であり、定義された術後損傷を再現します²⁷。行動試験、ウェスタンブロッティング、および細胞関連免疫蛍光染色を組み合わせることで、機能的、分子的な情報および空間的な相補的情報を得ることができます。しかし、この手法は単一エンドポイントのアッセイよりもリソースを多く消費し、それだけでは細胞特異的な因果関係を立証することはできません。U0126を用いた薬理学的比較は経路の解釈を強化しますが、遺伝的操作や細胞型選択的な操作よりも特異性は低くなります^{20,21,22,23,24,25}。

今後の応用としては、雌雄両性の検証、より広範囲な外科的損傷、臨床的に可能な投与経路の検討、術後の追加時点での評価、および特定のグリア細胞集団を標的とした介入などが挙げられます。本ワークフローは、切開モデルの手技が簡便であり、行動学的エンドポイントの再現性が高く、分子アッセイに標準的な研究室手法を用いているため、鎮痛薬またはグリア調節治療の候補薬剤をスクリーニングするのに実用的です。とはいえ、再現性を確保するには、事前に規定した除外基準、盲検化によるアウトカム評価、一貫した画像取得、ならびに生データと解析設定の完全な報告が不可欠です。

限界

本研究にはいくつかの限界がある。第一に、足底切開モデルは比較的軽微な外科的損傷を模したものであり、開胸術や開腹術のようなより大規模な外科的手術を完全に反映していない可能性がある。したがって、本知見を他の形式の術後疼痛に外挿する際には注意が必要である。加えて、雄のSprague–Dawleyラットのみを対象としたため、これらの知見を雌雄にわたって一般化することには限界がある。疼痛反応、鎮痛効果、およびグリア細胞の活性化パターンに性差があることが知られているため、雌の動物を含めたさらなる研究が必要である。

主要な分子生物学的および組織学的観察は、切開後 4 h の時点で重点的に行われました。GFAP、Iba-1、p-ERK1/2、および行動結果を含む異なるエンドポイントが、切開後に異なる時間的プロファイルを示したため、本知見のメカニズム的な解釈は、主に切開後の早期段階に限定されるべきです。さらに、本研究における分子実験は比較的限られたサンプルサイズで実施されており、これらの観察結果の統計的な堅牢性が低下している可能性があります。

細胞外信号調節キナーゼ1および2はp-ERK1/2としてまとめて評価され、それぞれの個別の寄与については検討しませんでした。したがって、切開誘発性疼痛処理におけるERK1とERK2のそれぞれの役割を本研究で特定することはできませんでした。加えて、蛍光強度の定量化は限られた数の動物および視野に基づいており、立体学的細胞数カウントや正式な共局在係数は含まれていません。したがって、これらの観察結果はウェスタンブロットの結果と併せて慎重に解釈されるべきです。

最後に、in vitroでのアストロサイト救済実験は、ERK1/2依存的な炎症介在物質の制御に関するメカニズム的な裏付けを提供しましたが、切開後の上流の調節イベントおよび無傷の脊髄組織における下流のイベントについては詳細な検討が行われていません。また、in vitro培養系では、脊髄後角におけるニューロン、アストロサイト、ミクログリア、および浸潤免疫細胞間の相互作用を完全に再現することはできません。したがって、本研究はERK1/2に関連するメカニズムを支持するものではありますが、完全なin vivoでの細胞特異的な因果関係を立証するまでには至っていません。

結論

本研究では、切開によって誘導される脊髄のNeuN、GFAP、およびIba-1の発現増加が、PPFの術前髄腔内投与によって抑制されることを示した。この効果に伴い、急性機械的および熱的痛覚過敏の緩和、ならびに切開後のERK1/2リン酸化およびTNF-αとCOX-2の発現低下が認められた。ただし、これらの知見は、PPFの抗痛覚過敏効果と脊髄グリア細胞におけるERK1/2リンカーンの抑制（および炎症性メディエーターの発現低下）との関連性を支持するものであり、（確定的なメカニズムの証明を提供するものではない）。PPFの抗痛覚過敏効果は、切開後の観察期間を通じて持続したが、MEK1/2阻害剤であるU0126の効果は主に切開後の早期段階に限定されていた。これらの結果は、ERK1/2シグナル伝達が、特に切開痛の発生早期において重要である可能性を示唆している。PPFの効果がより長期にわたることは、その作用機序にERK1/2阻害以外の経路が関与している可能性を示している。したがって、PPFは生物学的標的というよりも、術後急性痛の管理を改善するための潜在的な治療介入手段となる可能性がある。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.01 M PBS緩衝液	Solarbio	P1020
1.0 M Tris-HCl緩衝液 (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl緩衝液 (pH 8.8)	Solarbio	T1010
10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Solarbio	S1010
10× TBSTストック溶液	Solarbio	T1081
30% アクリルアミド	Solarbio	A1010
4× タンパク質ローディングバッファー	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
過硫酸アンモニウム	Solarbio	A1030
自動フレーク氷製造機	Changshu Xueke	IMS-40
ウシ血清アルブミン (BSA)	Solarbio	A8020
クリオスタット CM150	Leica	CM150
デジタルpHメーター	—	PHS-3C
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Solarbio	D8371
電子分析天秤	Cany	—
強化化学発光 (ECL) 試薬	Solarbio	PE0010
フィルム	Kodak	—
蛍光顕微鏡 DP71	Olympus	DP71
凍結切片包埋剤	Sakura	4583
ゲル電気泳動装置	BIO-RAD	—
グリセロール	Solarbio	IG0910
グリシン	Solarbio	G8200
ヤギ抗マウス Alexa Fluor 594 二次抗体	Proteintech	SA00013-3
ヤギ抗マウス horseradish peroxidase-標識二次抗体	ZSGB-BIO	ZB2305
ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488 二次抗体	Proteintech	SA00013-2
ヤギ抗ウサギ horseradish peroxidase-標識二次抗体	ZSGB-BIO	ZB2301
ヤギ血清	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
高速冷却遠心機 3K15	Sigma	3K15
水平型オービタルシェーカー TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
メタノール	Tianjin Guangfu	—
マウス抗ラット GAPDH 一次抗体	Proteintech	60004-1-Ig
マウス抗ラット p-ERK1/2 一次抗体	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
パラホルムアルデヒド	Biosharp	BL539A
病理用顕微鏡スライド	Shitai	—
フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF)	Beyotime	ST506
プランターテスト 37370	UGO BASILE	37370
ポリビニリデンフルオリド膜	Solarbio	—
プロペントフィリン (PPF)	Taosu	T19812
ウサギ抗ラット COX-2 一次抗体	Abcam	Ab179800
ウサギ抗ラット GFAP 一次抗体	Proteintech	16825-1-AP
ウサギ抗ラット Iba-1 一次抗体	Proteintech	10904-1-AP
ウサギ抗ラット NeuN 一次抗体	Abcam	Ab279297
ウサギ抗ラット t-ERK1/2 一次抗体	Proteintech	11257-1-AP
ウサギ抗ラット TNF-α 一次抗体	Proteintech	29652-1-AP
RIPA溶解バッファー	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
脱脂粉乳	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
超低温冷凍庫	Haier	—
超低温冷凍庫	Sanyo	—
超純水精製装置	Heal Force	—
von Freyフィラメント	North Coast Medical	—