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研究記事

プロペントフィリンは、脊髄のアストロサイトおよびミクログリアにおけるERK1/2リン酸化を調節することで、切開術後痛覚過敏を緩和する

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DOI:

10.3791/70927

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2026年8月14日

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1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

この記事について

サマリー

本研究では、ラットにおいて髄腔内に投与したプロペントフィリンが切開後痛覚過敏を軽減させる効果があるか、また、その効果が脊髄のグリアマーカーの変化および細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）のリン酸化に関連しているかについて検討します。

要約

脊髄アストロサイト、ミクログリア、および細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）は、疼痛処理に関与していることが示唆されています。本研究では、術前の髄腔内プロペントフィリン（PPF）投与がラットの術後急性切開痛による痛覚過敏を軽減するか、またその効果が脊髄グリアマーカーおよびERK1/2のリン酸化に関連しているかを検討しました。66匹の雄性Sprague–Dawleyラットを、ブランク群、切開痛群、生理食塩水群、ジメチルスルホキシド群、PPF群、およびU0126群にランダムに割り付けました。機械的および熱的痛覚過敏を、ベースライン時および切開後2、4、8、24、72時間で評価しました。脊髄の神経およびグリアマーカー、p-ERK1/2、および炎症性メディエーターを、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法により評価しました。さらに、一次脊髄アストロサイトを用いた実験を行い、ERK1/2依存的な炎症性メディエーターの放出を検討しました。術前の髄腔内PPF投与は、72時間の観察期間を通じて機械的および熱的痛覚過敏を軽減したのに対し、U0126は主に切開後の早期に痛覚過敏を軽減しました。切開後4時間において、両治療ともに脊髄におけるGFAP、Iba-1、およびp-ERK1/2の発現低下と、TNF-αおよびCOX-2の免疫反応性の低下に関連していました。培養アストロサイトにおいて、PPFはLPS誘導性の炎症性メディエーター放出を抑制しましたが、構成的活性型ERK1/2はこの効果を減弱させました。これらの知見は、PPFの抗痛覚過敏効果が、切開後の脊髄グリア、ERK1/2関連、および炎症反応の調節に関連していることを支持しています。

概要

切開痛は、外科的手術後に一般的に見られる急性疼痛の一種であり、通常は7日を超えて持続することはありませんが、炎症性疼痛や神経障害性疼痛とは異なる複雑な病理学的メカニズムを有しています1,2。切開痛の発生過程において管理が不十分な場合、慢性疼痛症候群へとさらに進行する可能性があり、その性質が急性組織損傷痛から神経障害性疼痛または混合性疼痛へと変化することがあります3。一般的に、切開後の鎮痛法としては、オピオイドや非ステロイド性抗炎症薬などの鎮痛薬の投与が最も一般的です。しかし、これらの薬剤を継続的または高用量で使用すると、多くの副作用が生じる可能性があり、より安全で効果的な鎮痛戦略の必要性が浮き彫りとなっています。

プロペントフィリン（PPF）がさまざまな疼痛プロセスにおける痛覚過敏を緩和することは、信頼できる根拠によって示されています4,5。さらに、PPFの鎮痛効果は、p38やc-Jun N末端キナーゼ（JNK）などのミトゲン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）の脊髄での発現を抑制することによって、部分的に達成されることが分かっています6。p38およびJNK経路に対するPPFの効果は確立されていますが、疼痛シグナル伝達に関与するもう一つの重要なMAPKサブファミリーである細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）経路を調節する可能性については、急性切開痛においては未だ解明されていません。ERK1/2の活性化はp38やJNKとは異なる時間的・細胞的なパターンを示すため、独自の治療機会がある可能性が示唆されており、この知識の空白を埋めることは特に重要です。

アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイトを含むグリア細胞は、当初、神経組織の接続および支持構造であると考えられていました。しかし、近年の研究により、アストロサイトとミクログリアがシナプス可塑性の調節や痛みの情報の伝達において重要な役割を果たすことが示されています7。脳および脊髄の常在性マクロファージであるミクログリアは、疼痛プロセスの非常に早い段階で、いくつかの細胞外刺激信号によって活性化され、その後増殖して大量の炎症性サイトカインを放出することで、脊髄から脳への痛み信号の伝導を増強させます8,9。同時に、活性化したアストロサイトは、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の放出をアップレギュレートし、細胞間コミュニケーションを強化することで、感覚ニューロンに直接情報を送信することができます10。

切開誘発痛の初期段階（最初の24時間以内）ではアストロサイトの活性化が起こり、一方でミクログリアの活性化はかなり後になってから現れることが研究で示されています11,12。さらに、ある研究では、切開誘発痛における機械的痛覚過敏に対して、活性化ミクログリアの影響は限定的であることが示されました13。これらの知見は、急性疼痛におけるアストロサイトとミクログリアの異なる役割について、依然として疑問が残っていることを強調しています。グリア変調剤であるプロペントフィリン（Propentofylline）は、慢性神経締め付け損傷、急性神経損傷、および急性組織損傷後のアストロサイトおよびミクログリアの活性化を調節することで、痛覚過敏を緩和することが報告されています4,5。しかし、現在の知る限り、急性切開誘発痛におけるアストロサイトまたはミクログリアの活性化に対するPPFの効果を検討した研究はありません。

mitogen-activated protein kinase 1および2（MEK1/2）の下流で活性化される主要なMAPKサブファミリーである細胞外信号調節キナーゼ1および2（ERK1/2）は、侵害受容処理および神経可塑性に広く関与している14,15。先行研究により、リン酸化ERK1/2（p-ERK1/2）は侵害刺激によって脊髄ニューロンで誘導されること、また炎症性または神経障害性疼痛状態でアストロサイトやミクログリアにおいても検出されることが示されている16,17,18,19。さらに、MEK1/2–ERK1/2シグナリングを薬理学的に阻害することで、複数の疼痛モデルにおいて機械的および熱的痛覚過敏が軽減することが報告されている20,21,22,23,24,25。

しかしながら、急性切開によって活性化される脊髄ERK1/2の細胞分布、特にアストロサイトおよびミクログリアにおける分布と、切開誘発痛におけるその役割については、まだ十分に定義されていません。当研究グループによる先行研究では、PPFが脊髄のJNKおよびp38シグナリングを抑制することで、ラットの急性切開後痛覚過敏を緩和することが示されていますが、切開誘発痛においてPPFが脊髄グリア細胞のERK1/2関連シグナリングも調節するかどうかは不明なままです。したがって、本研究は、完全に独立したメカニズム的なパラダイムではなく、疼痛研究における既存のグリアおよびMAPKの枠組みを拡張するものと見なされるべきです。先行研究との主な相違点は、具体的に急性切開痛に焦点を当てていること、MAPK成分としてp38/JNKではなくERK1/2を検討していること、そしてPPF投与に関連してp-ERK1/2の初期の脊髄細胞分布を評価していることにあります。

本研究は、術前の髄腔内PPF投与がラット足底切開モデルにおける切開後痛覚過敏を軽減するかどうか、また、この効果がERK1/2のリン酸化や、脊髄神経およびグリアマーカーの発現変化、ならびに炎症性メディエーターである腫瘍壊死因子-α（TNF-α）およびシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）に関連しているかどうかを検討することを目的として設計されました。具体的に、本研究は、行動評価と時系列的なウェスタンブロット解析を組み合わせた点、MEK1/2阻害剤U0126との薬理学的比較を行った点、および急性切開痛モデルにおいて脊髄ニューロン、アストロサイト、ミクログリアにおけるp-ERK1/2の定性的な免疫蛍光局在解析を行った点で、先行報告とは異なります。本研究のメカニズム的枠組みは、グリア変調およびMAPKシグナル伝達と痛みの関連を示す既存の文献に基づいたものですが、切開後痛覚過敏の早期段階における脊髄ERK1/2関連のグリア反応の関与の可能性について、さらなる証拠を提供することを意図しています。

従来の術後鎮痛剤と比較して、経路標的アプローチでは特定のシグナル伝達成分を検証できますが、効果が限定的な時間に留まる可能性があり、侵襲的な投与が必要となる場合があります。MEK1/2–ERK1/2の阻害は、いくつかの実験的疼痛モデルにおいて抗痛覚過敏効果を示しています20,21,22,23,24,25。PPFは、グリア応答を調節し、複数のMAPK関連プロセスに関与しているため、単一経路阻害剤とは異なります4,5,6。実用的な臨床応用への移行は、前臨床デザイン、術前の髄腔内投与、雄ラットのみの使用、およびより大規模な外科モデルにおける用量設定および安全性試験の欠如によって依然として制限されています。

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プロトコル

実施された実験は、中国甘粛省の蘭州大学第二附属病院倫理委員会（倫理承認番号：2017-070）によって承認されました。すべての手順は、国際疼痛研究協会のガイドライン26に従って行われました。認定された実験動物センターから入手した、体重 200–250 g の成人雄性Sprague–Dawleyラット計66匹を使用しました。性別依存的なホルモンの影響に関連する潜在的な変動を抑えるため、本研究では雄性ラットのみを対象としました。すべてのプロトコルは国際疼痛研究協会のガイドライン26に準拠して実施され、苦痛を最小限にするために必要な措置が講じられました。本研究で使用した試薬、消耗品、器具、およびソフトウェアの詳細な情報は、材料表に記載されています。

動物

ラットは手術前は2匹ずつ、切開後は個別に飼育し、餌と水は ad libitum（自由摂取）とした。室内は12時間明期・12時間暗期のサイクルで維持し、温度は24 °C ± 2 °Cに制御した。

髄腔内投与および切開痛モデル

溶液の髄腔内投与のため、ラットを1.5%–3%のセボフルラン（ノーズコーン経由で投与）で麻酔し、脊柱を屈曲させた腹臥位に配置した。腰部領域の被毛を剃除し、L5–L6椎間隙上の皮膚を消毒した。マイクロシリンジをL5–L6椎間隙から経皮的に挿入した。針を刺進させる際の突然の尾の跳ね上がりまたは尾の動きにより、クモ膜下腔への進入成功が示され、さらに緩やかな吸引時に脳脊髄液が出現することで確認した。これらの徴候が観察されない場合は、注入前に針の位置を調整した。両方の確認基準が満たされた後にのみ注入を行い、注入後に異常な神経学的徴候を示した動物は除外した。その後、各溶液をゆっくりと注入し、注入後に再び皮膚を洗浄した。手術時間は約3分で、ラットは通常5–10分以内に麻酔から回復した。

切開痛のラットモデルは、既報の手法に従って作製した27。麻酔後、後肢の足底面を10%ポビドンヨードで消毒した。かかとから約0.5 cmの位置から始まり、指先に向かって足底の皮膚に1 cmの縦切開を加えた。切開は皮膚および筋膜まで到達させた。足底筋を眼科用鉗子で慎重に挙上し、組織全体の連続性を維持しながら縦方向に切開した。その後、筋肉を元の位置に戻し、軽く圧迫して止血を行い、3-0ナイロンを用いて2箇所のマットレス縫合で創部を閉鎖した。閉鎖後、切開部位を再度消毒した。手術後、ラットは個別に飼育し、強い光を避け、食物と水に自由にアクセスできる静かで暖かい環境で回復させた。術後に動物を観察し、あらかじめ定義した基準を満たさない個体は速やかに除外した。創傷感染の判定は、創周囲の赤み、腫脹、局所温度の上昇、悪臭を伴う異常な黄緑色の膿性滲出液、創口が閉鎖せず治癒が遅延している状態、壊死および拡大、ならびに体温上昇、嗜眠、摂食拒否などの全身症状に基づいて行った。その他の除外基準には、30分以内に麻酔から回復しなかった個体、術中の筋肉切断または神経血管損傷、術後の自傷行為、モデル作製に失敗した個体、および後肢麻痺や切開痛とは無関係な荷重不能などの神経学的欠損を含めた。創傷感染または創部離開が認められたラットは、本研究から除外した。

行動測定

後肢の機械的逃避閾値（PWMT）および熱逃避潜時（PWTL）を、群割り付けを知らされていない試験者が測定した。テストは、少なくとも10分間の馴化後、一日の一定の時間に静かな部屋で実施した。囲い、メッシュまたはガラス床、周囲の光、および熱源の強度は、すべての群で一定に保った。PWMTの測定では、校正済みのvon Freyフィラメント（0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g, および 15.0 g）を、フィラメントが約1–2 mm曲がるまで、創傷に隣接する足底面に垂直に適用した。連続的な刺激の間隔は2分とし、アップダウン法を用いて50% PWMTを決定した28。PWTLの測定では、ラットをガラス床上の個別の透明な囲いに入れ、輻射熱源を創傷横の足底面に合わせた。組織損傷を防ぐために30 sのカットオフ時間を設定し、連続的な曝露の間隔は2分とし、3回の測定値の平均を記録した29。足の挙上、振戦、または舐め動作を陽性の逃避反応とした。グルーミング、移動、または熱源のずれの影響を受けた試行は、再馴化後に繰り返した。

ウェスタンブロット解析

規定の時間に、ラットを頸椎脱骨により安楽死させ、L4–L6腰髄をプロテアーゼ阻害剤を添加したラジオ免疫沈降アッセイ（RIPA）溶解バッファーに100:1の比率で速やかに回収した。組織をホモジナイズして氷上で20分間保持し、4 °Cで15,000 × gで20分間遠心分離した。上清を4×ローディングバッファーと3:1の比率で混合し、沸騰水で5分間加熱した後、−80 °Cで保存した。タンパク質サンプル（1レーンあたり30 µg）を10%ドデシル硫酸ナトリウム–ポリアクリルアミドゲルで分離し、0.45または0.22 µmのポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に転写した。プレステイン分子量マーカーが期待通りに移動していること、および明らかなムラや転写の途切れがないことを確認し、転写の成功を検証した。膜を5%脱脂粉乳および3%ウシ血清アルブミンで室温で2時間ブロッキングし、NeuN（1:8,000）、GFAP（1:4,000）、Iba-1（1:3,000）、p-ERK1/2（1:1,000）、t-ERK1/2（1:3,000）、またはGAPDH（1:2,000）に対する一次抗体を用いて4 °Cで一晩インキュベートした。0.05% Tween 20を含むTris緩衝生理食塩水（pH 7.4）で洗浄後、対応するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（1:5,000）を用いて室温で1時間インキュベートした。シグナルを化学発光で検出し、各ターゲット内で同一の露光範囲を用いてフィルムに記録した。群分けを知らされていない解析者が、画像解析ソフトウェアを用いてバンド密度を分析した。画像を8ビットのグレースケールに変換し、各バンドに同一の矩形関心領域を適用し、隣接する空白領域の局所的なバックグラウンドを差し引いて、統合密度を記録した。1つのブロット上のすべてのレーンに対して、同一の領域サイズとバックグラウンド処理を用いた。NeuN、GFAP、Iba-1、およびt-ERK1/2はGAPDHで、p-ERK1/2はt-ERK1/2で標準化した後、値をブランク群に対する相対値として的に算出した。

免疫蛍光染色法

あらかじめ設定した時間に、ラットを3%ペントバルビタールナトリウム（1.5 mL/kg）で麻酔し、あらかじめ冷却した0.01 mol/Lリン酸緩衝生理食塩水（PBS; pH 7.4）300 mLを心臓から灌流させた後、あらかじめ冷却した4%パラホルムアルデヒド250 mLを灌流した。L4–L6脊髄を4%パラホルムアルデヒドで6時間後固定し、4 °Cで20%–30%ショ糖–PBSを用いて一晩凍結保護し、−22 °Cで10 µmの厚さに切断した。切片を0.01 mol/L PBSで洗浄し、室温で1時間、10%ヤギ血清でブロッキングした後、NeuN (1:100)、GFAP (1:1,000)、Iba-1 (1:100)、p-ERK1/2 (1:100)、TNF-α (1:200)、またはCOX-2 (1:50)に対する一次抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、対応する緑色または赤色の蛍光標識二次抗体（1:400）を用いて室温で1時間インキュベートし、さらに3回PBSで洗浄し、抗退色剤とカバーガラスを用いて封入した。各染色のバッチには、一次抗体を用いずに処理したネガティブコントロール切片を含めた。画像は、盲検化した調査者が蛍光顕微鏡を用いて取得した。低倍率の概観画像は10×対物レンズを用いて取得し、細胞の免疫反応性および共局在画像は、対応する図のパネルに従い20×または40×対物レンズを用いて取得した。同一の図および染色バッチ内での比較のため、対物レンズの倍率、照明強度、露光時間、検出器ゲイン、カメラ設定、および画像処理パラメータは、飽和以下で最適化した後に固定した。チャネルの重なりを最小限に抑えるため、個別の蛍光チャネルを順次取得した。動物1匹につき、同側の後角から重複しない3つの視野を撮影した。蛍光強度は、8ビット変換、細胞のない領域を用いた背景減算、および各染色バッチ内で同一の関心領域（ROI）と閾値を適用した後、画像解析ソフトウェアで定量化した。視野ごとの値を平均し、動物1匹あたりの1つの値とした。露光過多、組織の折り畳み、破れ、焦点不良、または背景が不均一な視野は除外し、同一の非飽和設定下で再取得した。組織構造が維持されており、標的シグナルが一次抗体なしのコントロールを上回り、かつ分析に影響を与える大きな折り畳み、破れ、または飽和領域がない場合に、染色を採択した。

In vitro一次脊髄アストロサイト実験

ラット一次脊髄アストロサイトを、完全培地を用いて、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内という標準的な無菌条件下で培養した。細胞が約70%–80%のコンフルエンスに達した時点で、コントロール群、LPS刺激群、LPS + PPF群、LPS + U0126群、およびERK1/2レスキュー群に割り当てた。PPFおよびU0126は10 µMの濃度で添加した。LPS刺激、薬剤処理、および回収条件は、各実験におけるパラレルウェル間で同一に維持した。経路選択性解析のため、細胞ライセートを回収し、p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-p38、total p38、p-JNK、total JNK、および対応するローディングコントロールについてウェスタンブロッティングを行った。パラレルウェルから培養上清を回収し、遠心分離により清澄化した後、製造元の指示に従い、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いてTNF-α、PGE2、およびIL-6を分析した。ウェスタンブロットのデンシトメトリーは、上述した画像解析原理に従って行った。レスキュー実験では、siRNAトランスフェクションにより内因性ERK1/2を抑制し、処理前に構成的活性型ERK1/2（CA-ERK1/2）発現コンストラクトを導入した。サイトカインのデータを解析する前に、ウェスタンブロッティングによりノックダウンおよび過剰発現の効率を確認した。活性siRNAまたはコンストラクトを用いずにトランスフェクション試薬に曝露させた細胞を、必要に応じて処置コントロールとして用いた。

実験デザイン

実験動物のサブグループ分け

乱数表法を用いてラットを6群に割り付け、行動試験および組織採取の前に群分けを完了させた。6群は、ブランク群（n = 6）、切開痛（IP）群（n = 18）、生理食塩水（NS）群（0.9% NS, 10 µL; n = 9）、PPF群（10 µg in 10 µL; n = 12）、ジメチルスルホキシド（DMSO）群（10% DMSO, 10 µL; n = 9）、およびU0126群（10 µg in 10 µL; n = 12）で構成した。ブランク群のラットには、足底切開および髄腔内投与のいずれも行わず、未処置の対照群とした。IP群のラットには、髄腔内投与による前処理を行わずに足底切開を施した。NS群、PPF群、DMSO群、およびU0126群のラットには、足底切開の30分前に、それぞれの薬剤を髄腔内に投与した。NS群をPPFの溶媒対照とし、DMSO群をU0126の溶媒対照とした。

プロペントフィリンおよびU0126の投与量

プロペントフィリンはグリア修飾薬であり、研究グループによる先行研究において急性痛覚過敏を緩和したことから、10 µgの用量を選択しました。U0126は、ERK1/2のリン酸化を阻害するために使用される、非ATP競合性MEK1/2阻害剤です。さまざまな疼痛モデルにおいて1–10 µgの有効な髄腔内投与量が報告されており30,31,32、本研究では10 µgの用量を使用しました。U0126は10%ジメチルスルホキシドに溶解し、PPFは0.9%生理食塩水に溶解させました。最終濃度は1 µg/µLとしました。薬剤および溶媒は手術前に調製し、4 °Cで保存し、12 h以内に使用しました。

術前のプロペントフィリンまたはU0126の髄腔内投与による痛覚過敏への影響

各群から6匹のラットをランダムに抽出し、手術の24時間前に行動測定を行い、得られたPWMTとPWTLをベースラインとした。髄腔内投与は手術の30分前に行った。術前のPPFおよびU0126の髄腔内投与が機械的および熱的痛覚過敏に及ぼす影響を評価するため、切開後2時間、4時間、8時間、24時間、および72時間にPWMTとPWTLを測定した。

切開後の脊髄ニューロンおよびグリアマーカーの発現に対する、術前髄腔内投与プロペントフィリンまたはU0126の効果を評価するための実験デザイン

治療効果を評価するための適切な切開後のタイムポイントを決定するため、まずIP群において予備的なタイムコース解析を実施した。具体的には、IP群のラットを切開後2 h、4 h、24 h、および72 hに安楽死させ、脊髄における細胞マーカーNeuN、GFAP、およびIba-1の発現レベルをウェスタンブロット法で測定した（各タイムポイントにおいてn = 3）。この予備解析に基づき、NeuNの発現が4 hの時点で最高レベルに達したこと、および初期の分子変化が切開後痛覚過敏の初期形成に最も関連していると考えられたことから、切開後最初の4 hを早期観察ウィンドウとして選択した。ただし、4 hというタイムポイントは、切開後のすべての時間的な分子変化を代表させることを意図したものではない。

この選択したタイムポイントにおいて、髄腔内投与を受けたラットを安楽死させ、さまざまな細胞マーカーのWestern blot解析（各群 n = 3）および、さまざまな細胞種の形態の免疫蛍光評価（各群 n = 3）を行った。ブランク群では、ラットをランダムに屠殺し、Western blotによる脊髄におけるさまざまな細胞マーカー（NeuN、GFAP、およびIba-1）の基本発現レベル（n = 3）と、免疫蛍光によるさまざまな細胞（ニューロン、アストロサイト、およびミクログリア）の形態（n = 3）を測定した。したがって、ブランク群は切開および処置を行っていないベースラインコントロールとして機能した。

脊髄p-ERK1/2および炎症性メディエーターへの治療効果

p-ERK1/2の発現および炎症性サイトカインレベルに対する治療効果を評価するための適切な切開後時間点を決定するため、まずIP群において予備的なタイムコース解析を実施した。具体的には、IP群のラットを切開後2 h、4 h、24 h、および72 hに安楽死させ、ウェスタンブロット法を用いて脊髄のp-ERK1/2発現を測定した（各時間点につきn = 3）。このタイムコース実験の結果、および切開後にNeuN発現が最大となる時間点を踏まえ、術前の髄腔内PPFまたはU0126投与が脊髄のp-ERK1/2発現および炎症性サイトカインに及ぼす影響を評価するための固定時間点として、切開後4 hを選択した。この時間点は、切開後のあらゆる時間的変化を包括的に代表させるためではなく、初期のメカニズム観察ウィンドウとして選択したものである。

この選択したタイムポイントにおいて、髄腔内注射を投与したラットを安楽死させ、p-ERK1/2発現のWestern blot解析（各群 n = 3）および炎症性サイトカインの免疫蛍光評価（各群 n = 3）を行いました。ブランク群では、ラットをランダムに屠殺し、Western blotによる脊髄におけるp-ERK1/2の基本発現レベル（n = 3）および免疫蛍光による炎症性サイトカイン（TNF-αおよびCOX-2）の発現レベル（n = 3）を決定しました。これにより、ブランク群を非切開・非処置のベースラインコントロールとしました。

ニューロン、アストロサイトおよびミクログリアにおける脊髄p-ERK1/2の細胞内局在

切開後の脊髄におけるp-ERK1/2の細胞内分布をさらに評価するため、切開から4時間後にBlank群およびIP群において免疫蛍光染色を実施した（n = 3）。

統計解析

データは平均値 ± 標準偏差として表示している。サンプルサイズは、研究グループによる先行研究および予備実験に基づき決定した。行動データは、群を被験者間因子、時間を被験者内因子とする二元配置反復測定分散分析（ANOVA）により解析した。時系列のウェスタンブロットデータは、一元配置ANOVAの後、ボンフェローニ補正によるペア比較を用いて評価した。固定時点のウェスタンブロットおよび免疫蛍光データは、ボンフェローニ補正を伴う計画比較を用いた一元配置ANOVAで評価し、2群間の比較はStudentのt検定で評価した。正規性と分散の均一性は、それぞれShapiro–Wilk検定およびLevene検定で評価した。両側 p値 < 0.05を統計的に有意とした。統計解析は、Table of Materialsに記載の統計解析ソフトを用いて行った。in vitro アストロサイト実験では、独立した培養実験を解析単位として扱い、ウェスタンブロットのデンシトメトリーおよびサイトカイン濃度は、適宜、一元配置ANOVA後のボンフェローニ補正計画比較、またはあらかじめ指定した2群間比較に対するStudentの t-testを用いて比較した。

データの利用可能性：

本研究の結果を裏付けるデータは、Supplementary File 1に提供されています。

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結果

切開および術前のプロペントフィリンまたはU0126の髄腔内投与が、切開後の痛覚過敏に及ぼす影響

機械的痛覚過敏

手術の24時間前において、6群間にPWMTの有意な差は認められなかった（p > 0.05; Figure 1A,B）。IP群では、切開後にPWMTが減少し、切開後2時間から72時間までベースラインよりも有意に低い値で推移した（ベースラインに対してp < 0.05; Figure 1A）。NS群およびDMSO群では、切開後の各時点間でPWMTに有意な差は認められなかった（IP群に対してp > 0.05; Figure 1B）。PPF群では、切開後2時間から72時間までPWMTがIP群より...

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ディスカッション

多くの患者が手術後に、身体的な面だけでなく、時には精神的な面でも急性疼痛に苦しみます33が、術後急性疼痛の詳細なメカニズムについては依然として不明な点が多くあります。鎮痛薬の強力な効果に伴い、避けられない副作用が生じるため、より安全で効果的な鎮痛薬の探索が極めて重要となっています。本研究は、準備が容易で実現可能な、術後急性疼痛をシミュレートするためにあらかじめ検証されたラット切開モデルに基づいています27。本研究では、切開後の脊髄ニューロンおよびグリアマーカー、ERK1/2のリン酸化、および炎症性メディエーターの変化を評価し、術前の髄腔内PPF投与による抗痛覚過敏効果が、脊髄におけるERK1/2のリン酸化および炎症性サイトカイン発現の並行した変化と関連しているかどうかを検討しました。

切開後、IP群のラットでは強力な機械的および熱的痛覚過敏が発現したが、溶媒による前処理は行動的または分子的な結果のいずれに対しても検出可能な影響を及ぼさなかった。これらの所見はモデルの安定性を裏付けるもので...

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開示事項

著者らは、個人的、財務的、商業的、または学術的な利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、技術的支援をいただいたHaijiao Zhou氏とMing Wang氏に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.01 M PBS緩衝液SolarbioP1020
1.0 M Tris-HCl緩衝液 (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl緩衝液 (pH 8.8)SolarbioT1010
10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)SolarbioS1010
10× TBSTストック溶液SolarbioT1081
30% アクリルアミドSolarbioA1010
4× タンパク質ローディングバッファーSolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
過硫酸アンモニウムSolarbioA1030
自動フレーク氷製造機Changshu XuekeIMS-40
ウシ血清アルブミン (BSA)SolarbioA8020
クリオスタット CM150LeicaCM150
デジタルpHメーター—PHS-3C
ジメチルスルホキシド (DMSO)SolarbioD8371
電子分析天秤Cany—
強化化学発光 (ECL) 試薬SolarbioPE0010
フィルムKodak—
蛍光顕微鏡 DP71OlympusDP71
凍結切片包埋剤Sakura4583
ゲル電気泳動装置BIO-RAD—
グリセロールSolarbioIG0910
グリシンSolarbioG8200
ヤギ抗マウス Alexa Fluor 594 二次抗体ProteintechSA00013-3
ヤギ抗マウス horseradish peroxidase-標識二次抗体ZSGB-BIOZB2305
ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488 二次抗体ProteintechSA00013-2
ヤギ抗ウサギ horseradish peroxidase-標識二次抗体ZSGB-BIOZB2301
ヤギ血清SolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad Software5
高速冷却遠心機 3K15Sigma3K15
水平型オービタルシェーカー TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJNational Institutes of Health1.51j8
メタノールTianjin Guangfu—
マウス抗ラット GAPDH 一次抗体Proteintech60004-1-Ig
マウス抗ラット p-ERK1/2 一次抗体CST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
パラホルムアルデヒドBiosharpBL539A
病理用顕微鏡スライドShitai—
フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF)BeyotimeST506
プランターテスト 37370UGO BASILE37370
ポリビニリデンフルオリド膜Solarbio—
プロペントフィリン (PPF)TaosuT19812
ウサギ抗ラット COX-2 一次抗体AbcamAb179800
ウサギ抗ラット GFAP 一次抗体Proteintech16825-1-AP
ウサギ抗ラット Iba-1 一次抗体Proteintech10904-1-AP
ウサギ抗ラット NeuN 一次抗体AbcamAb279297
ウサギ抗ラット t-ERK1/2 一次抗体Proteintech11257-1-AP
ウサギ抗ラット TNF-α 一次抗体Proteintech29652-1-AP
RIPA溶解バッファーSolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
脱脂粉乳SolarbioD8340
SPSSIBM22
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
超低温冷凍庫Haier—
超低温冷凍庫Sanyo—
超純水精製装置Heal Force—
von FreyフィラメントNorth Coast Medical—

参考文献

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