ペプチドアレイおよびネイティブヌクレオソームプルダウンによるヒトスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)の結合基質としての修飾ヒストンの同定

サマリー

ヒトのスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)における遺伝的変異が最近、骨の過剰増殖という新しい発達障害の患者で確認されました。ヌクレオソームの文脈における修飾ヒストンの生化学的同定をSPIN4結合基質として記述するプロトコルと新しい結果が提示されています。

要約

ヒトスピンドリンファミリーメンバー4(SPIN4)は、骨成長の新しい調節因子として新たに登場しました。SPIN4における機能喪失変異は、X連鎖優性で遺伝する出生前および出生後の過剰増殖症候群を示す患者で確認されました。SPIN4はチューダードメインの3つのタンデムリピートを含み、それぞれが個別の芳香族ケージを形成しています。これらのチューダードメインは、配列相同性に基づきヒストンのメチル化アルギニンおよびリジン残基のエピジェネティックリーダードメインと見なされています。しかし、SPIN4の正確な結合基質は依然として不明です。野生型および病原性変異体のヒトSPIN4は、昆虫細胞発現系を通じて成功裏に生成されました。ヒストン修飾ペプチドアレイにより、野生型と変異型SPIN4の結合親和性の違いが決定されました。機能的検証により、SPIN4はヒストンH3リジン4メチル化(H3K4me)の正真正銘のリーダーであることが示されており、これはネイティブ単核小体の生化学的なプルダウンによって示されています。この統合アプローチにより、エピジェネティックリーダータンパク質の迅速な結合標的同定が可能となります。

概要

スピンドリン家族メンバー4(SPIN4)はエピジェネティックリーダーであり、最近では過成長症候群の関与が指摘されており、出生前および出生後の過剰成長と背の高い身長の星座を呈しています^1,2。Spin4ノックアウト(KO)マウスは、正確な人間の表現型を再現し、因果関係を支持しました。これまでのところ、SPIN4は骨成長を負の調節する唯一の排他的なエピジェネティックリーダーです。しかし、成長における重要なエピジェネティックリーダーであるSPIN4の生化学的特性はまだ明らかにされておらず、この新規発達障害における根本的で疾患を引き起こすメカニズムを理解する上で重要な知識のギャップを残しています。SPIN4は、一般的にメチル化されたアルギニンまたはリジンヒストンリーダータンパク質ドメインと考えられるチューダードメインの3つのタンデムリピートを含み^ます。最近、出生前および出生後の骨増殖症候群の患者でSPIN4^D82Hミスセンス変異が確認されました。この変異はSPIN4の第一チューダードメインに影響を与えます。しかし、これらのチューダードメインの関連する結合基質は不明であり、骨発生中のクロマチンおよび遺伝子発現のSPIN4依存的な調節の機能的解明を制限しています。

リーダータンパク質ドメインの新しいヒストン結合基質の同定は、単一の標準化されたアプローチに依存しません。ヒストンの翻訳後修飾(PTM)は主にコアヌクレオソーム粒子から外側に突き出たヒストンの尾部で起こります。リーダータンパク質ドメインによるヒストン尾部のPTM認識は非常に変動が大きく、リーダーと標的の相互作用を安定化させるためには、核小体DNA、リンカーDNA、その他のヒストンドメインを含む多価な静電的相互作用を必要とすることが多い⁴。現在、ヒストンテールペプチドのPTMはマイクロアレイの形で構築され、複数のベンダーによって商業化^{されています。}ヒストンテールペプチドベースのPTMスクリーニングはリーダータンパク質ドメインの結合標的を検出するハイスループットですが、ヌクレオソームがない場合に誤陽性が出ることが多いです。さらに、このようなスクリーニングの実験条件は非常に実証的であり、タンパク質ごとに異なるため、技術的には対処が難しいです。合成ヌクレオソームベースのPTMスクリーニングまたはプルダウンははるかに堅牢な読み取りを提供しますが、変動するPTMの組み合わせを持つヌクレオソームを再構成するのは本質的に困難なため、コストが高くスループットも低くなります。

このプロトコルは、SPIN4の結合標的としてヌクレオソーム内のヒストンPTMを迅速に同定する方法を説明しています。組換えSPIN4を再構成し、市販のヒストンPTMペプチドアレイと比較して潜在的な結合標的を特定しました。その後、多様な内因性ヒストンPTMを含むネイティブのモノヌクレオソームが生細胞から生成されました。単核体のSPIN4プルダウンにより、初期スクリーニング後の抗体を用いたヒストンPTMの標的検証が可能となりました。この統合生化学的戦略は、時間とコスト効率の良い標的発見のための原理実証アプローチを示し、他の十分に特徴づけられていないエピジェネティックリーダータンパク質の結合基質同定に容易に応用可能です。

プロトコル

HEK293FT細胞を用いたすべての実験手順は、バージニア・コモンウェルス大学の機関バイオセーフティ委員会(IBC)ガイドラインに従って実施されました。

1. 組換えヒトSPIN4の精製

1. 全長野生型SPIN4またはSPIN4^D82Hを、N末端1×FLAGエピトープタグをバキュロウイルスベ^クター6,7にクローニングします。
2. バクロウイルスを製備し、Sf9細胞にバクロウイルスベクターをトランスフェクトし、細胞が破裂した際にウイルスを収穫し、アリコートして−80^°C6,7でウイルスを保存します。
3. 500 mLのエルレンマイヤーフラスコに、100 mLの培地、1.5個×8個の^Sf9 細胞1.5個、1 mLのP1バクロウイルスを加えます。
4. 培養液は27.5°Cで、軌道シェーカーインキュベーターで125回転に設定され、暗闇の中で72時間培養します。
5. プロテアーゼ阻害剤を含むBC150溶解バッファー内のFLAG親和性ゲルを用いてFLAG-SPIN4を精製し、0.1 mg/mLの1× FLAGペプチドでタンパク質を溶出します。
6. 1× FLAGペプチドを完全に除去するために、BC150タンパク質貯蔵バッファーに対して4°Cで以下の順に透析液で脱出したFLAG-SPIN4を行いました。
   1. 最初の透析:1リットル、1時間。
   2. 2回目の透析:2リットル、一晩。
   3. 3回目の透析:1リットル、1時間。
7. 透析タンパク質を所定の体積(SPIN4の場合、600μLから150μLまで)まで濃縮します。
8. ビシンコニン酸(BCA)アッセイでタンパク質濃度を測定し、それに応じてモル濃度を計算します。
9. 各精製工程で回収される原油タンパク質の量とそれに対応する推定収量は 補足表1にまとめられています。250mLのSf9培養から400μLのアンチフラッグ親和性ゲルスラリーを用いて精製が行われました。
10. BC150タンパク質貯蔵バッファーでSPIN4を10×濃縮して希釈しました(補足表2)。1、2、5、10、20 μLを15%のSDS–PAGEゲルに負荷し、クーマッシーブルー染色(図1A)で可視化します。
11. 画像解析ソフトウェアを用いてバンド強度を定量化し、同じ体積を載せるレーン間の相対的な信号強度を測定します。
12. 強度比を各タンパク質の分子量で割ると、モル比が得られます。
13. このモル比を使ってステップ1.8で推定されたモル濃度を補正します。
14. 精製タンパク質をアリコウトし、液体窒素でスナップ冷凍し、−80°Cで保存します。 短期使用の場合は、次の実験に進む前に4°Cで一晩保存してください。

2. ヒストンペプチドアレイ

1. 5gの牛血清アルブミン(BSA)をBC150タンパク質貯蔵バッファーに溶解し、最終体積100mLにしてペプチドアレイブロッキングバッファーを準備します。
2. 試薬消費を最小限に抑えるために、疎水性マーカーペンでペプチドアレイ上の反応領域を描画することもできます。
3. 15cmのペトリ皿に数枚のろ紙を置き、水で湿らせます。
4. 湿らせたフィルターペーパーの上にペプチドアレイを配置します。
5. 各アレイ領域を完全にカバーするために慎重に300μLのブロッキングバッファを追加してください。
6. ペトリ皿を蓋をして室温で1〜3時間孵化します。
7. FLAG-SPIN4をブロッキングバッファーで最終濃度1μMに準備します。
8. ブロッキングバッファーに1× FLAGペプチドを最終濃度1μMまで準備します。
9. 信号対雑音比を改善し、望ましくない背景音を減らすために、冷たい部屋で以下の手順を行います。タンパク質を加える前に、ペトリ皿と一緒に詰まったアレイを冷蔵室に移してください。
10. 配列から余分なブロッキングバッファを削除してください。
11. 各ブロックに、コントロールとして目的のFLAG-SPIN4タンパク質またはFLAGペプチドを慎重に添加します。
12. ペトリ皿を蓋をして、冷蔵室で一晩孵化させてください。
13. ウェスタンブロットウォッシュボックスに約50mLのペプチドアレイウォッシュバッファーを加え、冷蔵室に持ち込みます。
14. タンパク質溶液を捨て、すぐにアレイをウォッシュバッファーに反応面を上に移します。
15. 配列を5回洗います。最初の2回は1回1分、残りの3回はそれぞれ5分の洗いです。
16. 残留洗剤を除去するためにペプチド配列ブロッキングバッファーでアレイをすすいで洗浄し、その後ペトリ皿に戻します。
17. 1:2000希釈で抗FLAG抗体溶液を準備し、1ブロックあたり300μLを加えます。
18. 室温で1時間孵化します。
19. 2.14から2.16までの手順を繰り返して配列を洗い流します。
20. HRP結合ヤギ抗マウスIgG(二次抗体)溶液を1:6000希釈で準備し、1ブロックあたり300μLを加えます。
21. 室温で1時間孵化します。
22. 2.14から2.16までの手順を繰り返して配列を洗い流します。
23. アレイを透明なシートプロテクターの中に収めます。
24. 反応表面の均一な被覆を確保するために、約1mLの強化化学発光(ECL)基質を追加します。
25. 空気の泡を除去し、適切なイメージングシステム(例:デジタルイメージャーやオートラジオフィルム)を用いて化学発光および明視野画像を撮影します(図1B)。
26. ペプチドアレイソフトウェアおよび関連するオンラインツールに基づいて信号強度を解析します(図2A–C)。

3. プルダウンアッセイにおけるFLAG-SPIN4の大規模表現

1. 500 mLのエルレンマイヤーフラスコに、125 mLのESF921培地、1.8個×10個^の8 個のSf9細胞、および1.2 mLのP1バクロウイルス(FLAG-SPIN4またはFLAG-SPIN4^D82Hを発現)を加えます。
2. 軌道シェーカーインキュベーター(125 rpm)で27.5°Cで72時間培養します。
3. 文化を次のように分類します:
   1. 4mLの培養液を15mLのチューブに投与し、滴定します。
   2. 30mLの培養液を4本の50mLチューブに分けます。
4. チューブを600 × gで15分間遠心分離し、上清液を捨てます。
5. ペレットは液体窒素で速凍し、−80°Cで保存して使用します。

4. FLAG-SPIN4およびFLAG-SPIN4^D82Hのビーズと溶解液比の滴定

1. セクション3、ステップ3.1で説明した5 mLのSf9培養ペレットから、各Sf9ペレットに1 mLのBC150溶解緩衝液を加えます。
2. 溶解液を完全に破壊するためにソニック化してください:振幅30%、オン5秒/オフ5秒、合計15秒のソニック処理時間。
3. 20,000 × g、4°Cで10分間遠心分離し、上清液を新鮮な1.5 mLチューブに移します。
4. 各プルダウン反応ごとに20μLのアンチFLAG親和性ゲルスラリーを準備します(3回滴定で60μL)
5. ビーズをBC150リゾースバッファーで洗う:
   1. BC150溶解バッファー1mLを加え、短時間ボルテックスします。
   2. 遠心分離機で3,000 × g で1分間。
   3. 吸引して上清液を捨てます。
6. ビーズを40μLのBC150分解バッファーに再懸濁し、1プルダウン反応ごとに(3滴定で120μL)します。
7. 溶解液をBC150溶解バッファーとビーズ懸濁液を含む1.5 mLチューブに混合します(補足表3)
8. チューブを15回転、4°Cで1.5時間培養します。
9. 3,000 g× 遠心分離機で1分間、上清液を吸引します。
10. ビーズは以下の通り3回洗います:
    1. ビーズを500μLのBC150リシスバッファーとボルテックスに短時間再懸濁します。
    2. 遠心分離機は3,000 × g で1分間加熱します。
    3. 上清液を吸引してください。
11. ビーズを20 μL 1× Laemmliバッファーに再懸浮させ、95°Cで5分間インキュベーションします。
12. 遠心分離機で3,000 g× 1分間。
13. 上清液を15%のSDS–PAGEゲルにかけ、クマッシーブルーで染色してタンパク質収量を推定します。
14. データに基づき、ビーズ上の抗体結合部位を飽和させる溶除液とビーズの比率を選択します。実験では、20 μLのビーズに対して≥300 μLの溶解液が完全な結合能力を達成するのに十分でした。
    注:「抗体結合部位の飽和度」とは、溶解液の量を増やすことで標的タンパク質の回復が大きくなくなるポイントと定義されます。
    注:同じモル濃度で、SPIN4^D82H は野生型ゲルよりもFLAG親和ゲルへの結合親和性が低いです。
    注:この実験環境では、600万個のSf9細胞から1mLの溶解液が抽出されました(1.5 × 10個⁶ 細胞/mL ×4 mLと計算)。これは、約600万個のSf9細胞から発現したSPIN4が、20μLの抗FLAG親和性ゲルスラリーを飽和させるのに十分であることを示しています。

5. 抗FLAG親和性ゲル結合型FLAG-SPIN4を餌として大規模に調製する方法

1. 検査対象のタンパク質ごとに、30mLの培養から2粒のペレットを集めます。各ペレットを6 mLのBC150リシスバッファーに再懸濁し、15 mLの遠心分離チューブに移し、BC150リシスバッファーで総容量を13 mLに調整します。
2. 各サンプルを氷上で100%振幅で超音波処理し、オン15秒、オフ30秒で合計2分間の超音波処理を行います。
3. 溶解液を事前に冷却した高速遠心分離機管に移し、20,000 × g(4°C)で15分間遠心分離機に移します。
4. 1.5mLの遠心分離機チューブに200×(サンプル数+1)×1.1μLのアンチFLAG親和ゲルスラリーを加えます。
5. ビーズはBC150溶解バッファーの>5カラム容量(CV)で一度洗浄します。
6. ビーズを400 ×(サンプル数+1)×1.1 μLのBC150溶解バッファーに再懸濁します。
7. ステップ4から15mLの遠心分離機チューブで得られた上清液を移します。
8. 各チューブにStep 5.7ビーズサスペンションを500μL追加します。
9. 1本のチューブに3 mLのBC150溶解バッファーと、陰性コントロールとして1× FLAGペプチド60 μL(100 mM)を加えます。
10. サンプルは120rpm、4°Cで1.5時間のチューブローテーターでキュベートします。
11. 2,000gで遠心分離機 × 5分間処理し、上清液を捨てます。
12. ビーズを適切な量の上清液に再懸浮させ、1.5mLのチューブに移します。
13. 3,000 g× gで遠心分離機で1分間過ごし、上清液を吸引します。
14. ビーズをBC150溶解バッファーで5回洗い、次のように洗います。
    1. ビーズを1 mLのBC150溶解バッファーに再懸浮させます。
    2. 4回目と5回目の洗浄では、試料を20回転、4°Cで10分間設定したチューブローターに置きます。
    3. 3,000 × gで遠心分離機で1分間吸い、上清液を吸引します。
15. ビーズを200μLのBC150溶解バッファーに再懸濁します。
16. ビーズ/バッファー懸濁液9μLを取り、15%のSDS–PAGEでタンパク質含有量を分析し、その後クーマッシーブルー染色を行います。
17. タンパク質の入力量がビーズ結合能力を超えるため、ビーズ体積あたりの結合タンパク質量はサンプル間で似ているはずです。デジタル画像解析でバンド強度を半定量化し、その後の反応のためにビーズの量を調整します。

6. HEK293FT細胞からの単核小体の製剤

1. 15cmの組織培養皿で、10%胎児用牛血清(FBS)を5%_CO2 加湿インキュベーターで37°CのDMEM培地に10%の胎児用牛血清(FBS)を用いて約90%の合流率まで培養HEK293FTします。
2. 早期通過HEK293FT細胞は商業的に入手され、STRプロファイリングによって認証されます。
   注:15cmの皿1皿で~2,700万個の細胞が得られ、これは1〜2回のプルダウン反応に十分な量です。6つの反応(陰性対照を含む)には、少なくとも3つの15cm皿を準備します。標的ヒストン翻訳後修飾(PTM)が稀または不安定の場合は×細胞数2〜10を増加させます。
3. (任意) 関心のあるヒストン修飾に応じて、適切なPTM阻害剤(補足表2)を培養培地に加え、24時間インキュベートします。
   注:ヒストンPTMが豊富な場合はこのステップを省略してもよい。
4. 細胞がほぼ100%の合流に達したら、以下のように収集します:
   1. 培養培地を吸引してください。
   2. 10mLの氷で冷たPBSで優しく細胞をすい流し、その後吸引します。
   3. 氷のように冷たいPBSを5mL加えます。
   4. 細胞を氷でこそげ、50mLのチューブに移します(すべての皿を組み合わせて使用可能です)。
   5. 遠心分離機は 13,000× g、4°Cで10分間。
   6. 上清液は捨てる。
5. (任意) すぐに進めるか、後で使うためにセルペレットを冷凍してください。
   1. ペレットの体積を推定してください。
   2. バッファーGのペレット容量9×に再懸浮し、最終グリセロール濃度20%にします。
   3. 液体窒素でスナップ冷凍し、−80°Cで保存します。
6. 冷凍ペレットを使用する場合は、氷で解凍し、1,300 × g、4°Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。
7. (新鮮または解凍済みの)ペレットを、血清学的ピペットを用いて、プロテアーゼ阻害剤を含むTMSDバッファー(40 mM Tris-HCl、pH 7.5、5 mM MgCl₂、250 mM スクロース、1 mM DTT)のペレット容量10×に再懸浮させます。
8. TMSDバッファーに10%のNP-40を新たに準備し、総反応体積を0.11×加えて最終的なNP-40濃度~1%にします。
9. サスペンションを120rpm、4°Cに設定したチューブローテーターに5分間孵化させます。
10. 懸濁液10μLと10μLのトリパンブルーを混ぜ、顕微鏡で核染色を観察します。核が細胞質から完全に分離されていることを確認してください(図3A)。
11. 約95%の核がトリパンブルー陽性になったら次のステップに進みます。HEK293FT細胞の場合、通常1%のNP-40を5分間の培養で十分です。他の細胞タイプについては、培養時間を検証・調整してください。
12. 1,300 × g、4°Cで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。
13. ペレットを10×のTMSDバッファーのペレット容量に再懸浮させます。
14. 6.12から6.13までのステップを5回繰り返し、残留NP-40を完全に除去します。
15. ペレットをバッファーBのペレット容量5×に再懸浮させます。
16. 10,000個の核ごとに1ユニットの微小球球ヌクレアーゼ(MNase)を加え、37°Cの水浴で培養します。培養中にチューブを時折攪拌して核を均等に再懸浮させてください
17. 指定された時刻(0.5、1、2.5時間)で、反応の50μLを1.5 mLチューブに取り出し、すぐに0.5 M EDTA-Na(pH 8.0)1 μLを加え、渦巻きます。
18. 以下の手順に従って各時刻からDNAを抽出します。
    1. H₂O80μL、SDS30μL、5M NaCl20μLを加えます。ボルテックス。
    2. フェノール/クロロホルム200μLを加えます。徹底的にボルテックス。
    3. 遠心分離機で20,000 g×、RT、3分。
    4. 上清液を新しい1.5mLチューブに慎重に移してください。
    5. 100%エタノール1mLと20μLの酢酸ナトリウム3M(pH5.2)を加えます。ボルテックス。
    6. 遠心分離機は20,000 g×、RT、5分。
    7. 上清液を取り除き、70%エタノールを1mL加えます。
    8. 遠心分離機は20,000 g×、RT、1分。
    9. 上澄液を取り除き、キャップを開けたまま55°Cで10分間乾燥させます。
    10. ペレットを50μLのTEバッファーに再懸浮させます。
19. 1%のTBEアガロースゲルでサンプルを走査し、単一塩基体DNAサイズ(147 bp)を確認します(図3B)。
20. (任意) 微小球性ヌクレアーゼ(MNase)の消化効率は細胞タイプによって異なりますが、必要に応じて反応の途中に追加で追加され、ポリヌクレオソームを完全に除去することもあります。例えば、1時間と2時間のサンプルが似ている場合は、3時間でさらにMNaseを追加します。
21. 優勢な~147 bpバンドが観察された場合、または追加のMNaseや延長培養で断片サイズが変化しなくなった場合は、最終濃度2 mMに0.5 M EDTA-Na(pH8.0)を加えて反応を停止させます。
22. 遠心分離機は1,300 × g、4°Cで5分間。上清液(S1)を採取します。
23. ペレットを10×ペレット容量のTEバッファー+プロテアーゼ阻害剤に再懸浮させ、試料を20rpm、4°Cで少なくとも30分間培養します。
    注:単核体抽出効率は細胞の種類によって異なります。0-300 mMのNaClは、ヌクレオソームを効率的に抽出するために用いられます。
24. 遠心分離機は1,300 × g、4°Cで5分間。上澄液(S2)を採取します。
25. S1とS2をそれぞれ50 μLずつ1.5 mLのチューブに移します。
26. すべての画分をアガロースゲル電気泳動(ステップ6.17から6.18)で解析し、DNAのサイズ分布と抽出効率を評価します。ほとんどのモノクロソームはS2分画に存在します(図3C)。
27. S2を高速遠心分離機管に移し、 20,000 × g(4°C)で10分間回転させて不溶性物質を除去します。
28. 上清液を採取し、阻害剤なしのBC150溶解バッファーに対して透析を行います。
    1. 最初の透析:1リットル、1時間。
    2. 2回目の透析:2リットル、一晩。
29. 透析後、再び20,000 × g、4°Cで10分間遠心分離し、残った不溶性ゴミを除去します。
30. 最後の上澄液を採取してください。
31. 上清液5 μLを35 μL BC150溶解バッファーおよび10 μL 5× Laemmli緩衝液と混合し、95°Cで5分間加熱し、15% SDS–PAGEゲルに1、2、5、10、20 μLをロードします。
32. 収量推定の基準として、0.1 mg/mLのBSAを1、2、5 μLをLaemmlバッファーに負荷。
33. クーマッシーブルーで染色し、画像解析ソフトウェアを用いて半定量的にヌクレオソーム収量を推定します(図3D)。

7. 修正ヌクレオソームプルダウン

1. 2×ビードブロッキングバッファーを1gのBSAをBC150溶解バッファーに溶かし、最終体積10 mLにし、完全に溶解するまで渦巻きます。
2. 同量のモルタンパク質を含むFLAG-SPIN4-WTおよびFLAG-SPIN4^D82H ビーズ(セクション5、ステップ5.16から5.17より)を別々の1.5 mLチューブに移す。
3. FLAG-SPIN4-WTサンプルに、同じ量のネガティブコントロールビーズ(セクション5、ステップ10より)を加えます。
4. BC150溶解バッファーを使って、すべてのビーズサンプルの総体積を同一に調整します。
5. ビーズとBC150溶解バッファーを含む各チューブに、同じ量の2×ビードブロッキングバッファーを追加します。
6. サンプルをチューブローターで20回転、4°C(O/N)で一晩キュベートします。
7. 氷の上でHEK293FT細胞から抽出した適切な量の1×ヌクレオソームを解凍します。必要な体積は、望ましいヌクレオソームとSPIN4のモル比に依存します。初期最適化には、ヌクレオソームとSPIN4のモル比を1:1にします。
8. 1×ヌクレオソームと2×ビードブロッキングバッファーの同量を十分に混ぜます。
9. ステップ7.8の混合物を、あらかじめブロックされたビーズと15mLチューブで混ぜます。
10. 混合物はチューブローテーターで4°Cで20rpmに設定し、4時間または一晩孵化します。
11. 遠心分離機は3,000 × g、4°Cで3分間加熱します。
12. 上澄液は慎重に捨てます。
13. ビーズを1 mLのBC150溶解バッファーに再懸浮させ、1.5 mLのチューブに移します。
14. ビーズは以下の通り3回洗います:
    1. 3,000 g× 1分で遠心分離し、上清液を吸引します。
    2. ビーズを1 mLのBC150溶解バッファーに再懸浮させます。
    3. 洗濯中にビーズが均等に再浮下するように、時々チューブをかき混ぜてみてください。
15. ビーズはさらに2回洗い、以下の通りです:
    1. 3,000 g× 1分で遠心分離機をかけ、上清液を吸引します。
    2. ビーズを1 mLのBC150溶解バッファーに再懸濁します。
    3. 20回転、4°Cで10分間回転させます。
16. 洗浄後、ビーズをBC150溶解バッファーの9カラム容量(CV)に再懸浮します。
17. 各サンプルから160μLを取り、40μLの5×レームリバッファーと混ぜて95°Cで5分間加熱します。
    注:タンパク質-ヌクレオソーム複合体のフラッグペプチド洗脱が推奨されており、背景情報が少なくクリーンな結果が得られます。
18. 3,000 × gで室温で5分間遠心分離機に入れます。
19. 5μLの上清液を15%のSDS–PAGEゲルに注入し、銀染色を行います(図4A)。
20. さらに5μLの上清液を15%のSDS–PAGEゲルに積み込み、PVDF膜に移し、標的ヒストンPTMに特異的な一次抗体および二次抗体でプローブします(図4B)。

結果

ヒトSPIN4の結合基質を調べるため、野生型SPIN4および過増殖症候群に関連する患者由来変異体をSf9昆虫細胞発現系を用いて再構成しました。具体的には、これは残基82(D82H)におけるアスパラギン酸(D)からヒスチジン(H)へのミセンス変異であり、SPIN4の第一チューダードメイン内に存在し、SPIN4の基質結合を調節する役割を示唆しています。Sf9細胞内でタンパク質発現には、単一のFLAGタグ付きSPIN4をコードするバクロウイルスベクターを使用し、その後1段階のFLAG親和性精製と1×FLAGペプチド競合的溶出を行いました(図1A)。精製されたSPIN4タンパク質の等量モル数を、384種類のユニークなヒストンPTM結合からなるヒストンペプチドアレイでインキュベートしました。特異的ヒストンPTMに結合したSPIN4タンパク質は、FLAG抗体およびHRP結合二次抗体によって検出されました(図1B)。化学発光信号はデジタルで定量化されました。SPIN...

ディスカッション

不十分な特徴を持つタンパク質の標的として特定のヒストンPTMを生化学的に特定し、その疾患関連変異が標的の結合親和性にどのように影響するかを評価するための時間的かつコスト効率の高い方法が提示されました。この方法の利点は、合成ヌクレオソームの高価または時間のかかる再構成を必要としないことです。このアプローチは、市販のヒストンPTMペプチドアレイの利便性を活用しつつ、生理学的に重要な結合基質としてネイティブモノヌクレオソームを使用することで、SPIN4が正真正銘のH3K4meリーダーであることを保証しました。この方法の重要なステップは、関心のあるタンパク質の再構成に成功することです。経験的で、挑戦的でもあります。場合によっては、候補タンパク質の短縮版を用いて技術的な障害を克服することも可能です。この方法の制約は、生化学的に定義されていないネイティブヌクレオソームの使用です。しかし、この方法に従うことで、プルダウン後の単核体を質量分析法でさらに詳しく調べ、結合特異性の全体像を得て、シス中のヒストンPTMの組み合わせを解剖することで、この制限を克服

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL マイクロ遠心分離機チューブ	サーステット	72.690.001	一般的な実験
15cm組織培養皿	サーステット	83.3903.300	一般的な実験
15 mL円錐遠心分離機チューブ	サーステット	62.554.101	一般的な実験
50 mL円錐遠心分離機チューブ	サーステット	62.548.004	一般的な実験
500 mL エルレンマイヤーフラスコ	ステラー・サイエンティフィック	CT229809	Sf9細胞培養
アマーシャムImageQuant 800 CCDイメージャー	シチバ	IMQ800	CCDイメージングシステム
アンチFLAG M2アフィニティジェル	シグマ・オルドリッチ	A2220	生化学的なプルダウン
アンチFLAG M2抗体	シグマ・オルドリッチ	F1804	ウェスタン・ブロット
アプロチニン	メドケムエクスプレス	HY-P0017	プロテアーゼ阻害剤
Array Analyze Sofrware	アクティブモチーフ	https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip	MODifiedペプチドアレイデータ解析
ASIアガロースLE	アルカリ・サイエンティフィック	A7700	DNAゲル
Bac-to-Bac バクロウイルス発現系	サーモ・サイエンティフィック	10359016	基状血管発現
ベンザミジン塩酸塩	メドケムエクスプレス	ハイW018781	プロテアーゼ阻害剤
牛血清アルブミン(BSA)	シグマ・オルドリッチ	A9647	タンパク質定量標準
ブロモフェノールブルー	サーモ・サイエンティフィック	A18469.08	ラメリバッファー
クーマッシー・ブリリアント・ブルー R-250	サーモ・サイエンティフィック	20278	プロチエンゲル染色
ジチオスレイトール(DTT)	シグマ・オルドリッチ	D5545	溶解バッファー
EDTA	RPIの研究成果物	E58100	溶解バッファー
増強化学発光(ECL)基質	シチバ	RPN2232	ウェスタン・ブロット
ESF 921 昆虫細胞培養培地	表現システム	96-001	Sf9細胞培養
エタノール(200プルーフ)	スペクトラム・ケミカル	ET107	DNA沈殿
EVOS M5000イメージングシステム	インビトロジェン	M5000	一般イメージング
FLAGペプチド	メドケムエクスプレス	HY-P7006	プルダウン洗脱
グリセロール	シグマ・オルドリッチ	G77893	ストレージバッファ
H3K4me1抗体	アクティブモチーフ	39300	ウェスタン・ブロット
H3K4me2抗体	細胞シグナル伝達	9725T	ウェスタン・ブロット
H3K4me3抗体	細胞シグナル伝達	9751T	ウェスタン・ブロット
HEK293FTセル	サーモ・サイエンティフィック	R70007	ヒト胚性腎線維芽細胞株
ヘペス	シグマ・オルドリッチ	H3375	溶解バッファー
イメージJ	国立衛生研究所	https://imagej.net/ij/download.html	Javaベースの画像処理プログラム
ロイプチンヘミスルフェート	メドケムエクスプレス	HY-18234A	プロテアーゼ阻害剤
微小球菌ヌクレアーゼ(MNase)	NEB	M0247S	クロマチン消化のためのエンドヌクレアーゼ
モデル120 ソニック・ディスメンブレーター	フィッシャー・サイエンティフィック	FB120110	超音波処理
MODified ヒストンペプチドアレイ	アクティブモチーフ	13005	タンパク質結合アッセイ
ペプスタチンA	メドケムエクスプレス	HY-P0018	プロテアーゼ阻害剤
ペルオキシダーゼIgGフラクション モノクローナルヤギ抗マウスIgG、ライトチェーン特異的	ジャクソン免疫研究	115-035-174	ウェスタン・ブロット
pFastBac1-フラグ-SPIN4	サーモ・サイエンティフィック	10360014	バキュロウイルス発現ベクター
pFastBac1-フラグ-SPIN4-D82H	サーモ・サイエンティフィック	10360014	バキュロウイルス発現ベクター
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)	シグマ・オルドリッチ	P2069	DNA精製
ピアース ラピッドゴールド BCAタンパク質アッセイキット	サーモ・サイエンティフィック	PIA53226	タンパク質定量子
ピアースシルバーステインキット	サーモ・サイエンティフィック	24612	タンパク質検出
PMSFプロテアーゼ阻害剤	サーモ・サイエンティフィック	36978	プロテアーゼ阻害剤
ポリアクリルアミドゲル	社内制作	該当なし	プロテインジェル
Sf9昆虫細胞	ATCC	CRL-1711	バクロウイルス発現のための昆虫細胞株
スライド・A・ライザーMINI透析装置、10K MWCO	サーモ・サイエンティフィック	69572	タンパク質透析
酢酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S8750	DNA沈殿
塩化ナトリウム	Fischer	BP358-1	一般的なバッファ
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	シグマ・オルドリッチ	L3771	一般的なバッファ
トライパンブルー溶液(0.4%)	サーモ・サイエンティフィック	15250061	核染色