鉄過剰負荷は膵臓組織内のMEG3発現を減少させました。 MEG3は鉄誘導の孤島β細胞アポトーシスに対する保護的役割を担い、NF-ĸB経路の調節に関与する可能性があります。このメカニズムは、鉄過負荷を伴うβ-TM患者のアイレット機能障害に寄与する可能性があります。
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鉄過剰負荷は膵臓組織内のMEG3発現を減少させました。 MEG3は鉄誘導の孤島β細胞アポトーシスに対する保護的役割を担い、NF-ĸB経路の調節に関与する可能性があります。このメカニズムは、鉄過負荷を伴うβ-TM患者のアイレット機能障害に寄与する可能性があります。
ベータサラセミア・メジャー(β-TM)患者は、一般的なブドウ糖代謝異常を示し、鉄過剰、慢性貧血、ホルモンバランスの乱れ、肝機能障害、炎症関連インスリン抵抗性などの要因が膵島機能障害の重要な要因と考えられています。長く非コードリボ核酸(lncRNA)は、細胞のアポトーシスおよびグルコース恒常性における調節役割としてますます認識されています。本研究は、鉄誘発性膵島β細胞損傷における母体発現遺伝子3(MEG3)であるlncRNAの機能を探ります。鉄過負荷マウスモデルは、腹膜内の鉄デキストラ注射によって誘導されました。膵臓における鉄の沈着および組織損傷は、プルシアンブルーおよびヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて評価され、MEG3の発現は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって定量化された。in vitroでは、MIN6細胞にMEG3の小さな干渉RNAをトランスフェクトしてフローサイトメトリーによるアポトーシスを調べ、NF-kappa(ĸ)Bシグナル伝達経路の活性をウェスタンブロッティングで評価しました。組織学的染色により、鉄過剰なマウスの膵臓組織に著しい鉄沈着および構造的損傷が確認されました。RT-PCR解析では膵臓におけるMEG3発現の著しい減少(p<0.05)が認められました。in vitroでは、MEG3ノックダウンによりMIN6細胞のアポトーシスが対照群と比べて有意に増加しました。ウェスタンブロット解析ではNF-ĸBのレベルが上昇し、MEG3サイレンス細胞におけるNF-ĸBシグナル伝達経路の活性化を示しました。これらの発見は、MEG3のダウンレギュレーションが鉄過剰状態でNF-ĸBシグナル伝達を介してアイレットβ細胞アポトーシスを促進する可能性を示唆しています。MEG3遺伝子は鉄誘導の孤島β細胞アポトーシスに対する保護的な役割を果たす可能性があり、NF-ĸB経路の調節に関与する可能性があります。このメカニズムは、鉄過負荷を伴うβ-TM患者のアイレット機能障害に寄与する可能性があります。
ベータ(β)-サラセミアは、βグロビン鎖の産生が減少または欠如し、慢性貧血および効果的な赤血球生成を招く遺伝性血液疾患の一群です。輸血依存性βサラセミア・メジャー(β-TM)の患者では、繰り返される輸血や溶血がしばしば全身鉄過剰を引き起こし、複数の臓器を損傷し、異常なグルコース代謝を含むさまざまな内分泌合併症を引き起こす可能性があります。さらに、慢性貧血は膵臓への負担を増大させ、ホルモンバランスの乱れによる血糖調節、肝機能障害によるグルコース代謝の障害、炎症性過程によるインスリン抵抗性などがβ-TM患者の高血糖に寄与する可能性があります。したがって、β-TMにおけるグルコース代謝障害は多因子性である2,3。最近のメタアナリシスでは、β-TM患者における空腹時血糖障害、耐糖耐受障害(IGT)、糖尿病(DM)の有病率がそれぞれ17.21%、12.46%、6.54%であり、この集団におけるグルコース代謝障害の負担が増加していることを示しています3。
臨床的意義が高まっているにもかかわらず、β-TMにおける異常なグルコース代謝の根本的なメカニズムは依然として十分に解明されていません。過去の研究では、繰り返しの輸血や溶血による慢性的な鉄過剰摂取が膵臓、特に膵島β細胞内で過剰な鉄沈着を引き起こすことが示されています。この蓄積は活性酸素種の生成を促進し、酸化ストレスを悪化させてミトコンドリア機能障害を引き起こし、インスリン合成と分泌を妨げ、最終的にはβ細胞アポトーシスとインスリン欠乏を誘発します4,6。さらに、鉄過剰は酸化ストレス介在の炎症やインスリンシグナル伝達経路の妨害を通じて末梢インスリン抵抗性に寄与する可能性があります。しかし、鉄過剰とβ細胞損傷および全身性血糖調節障害を結びつける分子経路は複雑であり、まだ完全に解明されていません。タンパク質をコードしない200ヌクレオチドを超える長非コードリボ核酸(lncRNA)は、グルコース恒常性、インスリン分泌、酸化ストレス応答など多様な生物学的プロセスにおいて重要な調節因子として登場しています。膵島β細胞は1,000以上のlncRNAを発現することが知られており、内分泌機能の維持における調節役割の可能性を示唆しています10。
しかし、鉄過剰負荷誘発のアイレットβ細胞損傷、特にβ-TMにおけるlncRNA発現プロファイルとその機能的役割についてはほとんど知られていません。最近の進展により、LncRNA MEG3(MEG3)がインスリン分泌を促進し、膵臓β細胞のアポトーシス11を阻害することが明らかになりました。しかし、鉄過剰状態における膵臓β細胞への影響は依然として不明です。他の病理学的文脈では、lncRNAはNF-kappa (ĸ)B、JNK、Nrf2などの主要なシグナル伝達経路と相互作用することが示されており、これらは酸化ストレスや鉄過剰負荷に関連する細胞損傷にも関与しています12,13,14。具体的には、NF-ĸBは酸化ストレス下で活性化される中心転写因子であり、鉄過剰負荷状態15,16,17におけるβ細胞アポトーシスに関与することが示唆されています。したがって、本研究は、MEG3のダウンレギュレーションが鉄過剰状態下でNF-ĸBシグナル伝達を介してアイレットβ細胞アポトーシスを促進する可能性があることを調査します。本研究は、β-TMにおける異常なグルコース代謝の分子メカニズムに新たな洞察をもたらす可能性があります。
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本研究で用いられた実験プロトコルは、海南省総合病院倫理委員会(プロトコル番号2021-239)によって承認されました。米国国立衛生研究所の実験動物のケアと利用に関するガイドラインおよびヘルシンキ宣言は、すべての実験手順において厳格に遵守されました。本研究で使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。
1. 動物モデルと実験設計
本研究では36匹の雄C57BL/6Jマウス(生後4週間、約20g)が使用されました。すべてのマウスは標準的な実験室環境(20–25°C、相対湿度50%–65%、12時間の明暗サイクル)で飼育され、自由に餌と水を得られました。7日間の順応期間の後、マウスは無作為に2つのグループ(n=18人)に分けられました。鉄過剰群(モデル群)は、週に2回、4週間にわたり腹膜内に鉄デキストラン(0.2g/kg)注射を受けました。対照群は腹腔内注射で同等量の生理食塩水を受けます。4週間後、マウスは安楽死させられ、膵臓組織を採取して後続解析を行いました。
2. 血清鉄の測定
内発情時に1%のペントバルビタール麻酔下で後眼窩洞から血液サンプルを採取しました。室温で1時間放置した後、血液は4°C、3,000rpmで15分間遠心分離されました。血清は分離され、-80°Cで保存されました。 血清鉄の濃度は製造元のプロトコルに従い、鉄比色測定キットを用いて測定されました。
3. 組織学的分析
膵組織標本は4%パラホルムアルデヒドに浸漬して固定し、その後パラフィン埋め込みを施して切片準備を行った。厚さ4〜5μmの連続組織切片を取得し、標準的な脱硫および再水和手順で処理しました。組織形態学的検査はヘマトキシリンおよびエオシン染色を用い、膵臓組織内の鉄沈着は従来の組織学的染色プロトコルに従いプルシアンブルー染色で評価されました。
4. 細胞培養および小規模干渉リボ核酸トランスフェクション
MIN6マウス膵β細胞は、高グルコースのDulbecco's modified Eagle培地に15%胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、10 mM HEPES、50 mM ピルビン酸ナトリウム、50 μmol/L βメルカプトエタノールを補足して培養しました。すべての実験は80%の細胞コンフルエンスで実施されました。細胞培養中は毎回6〜8mlの培地が採取されます。細胞は5%のCO₂の加湿大気中で37°Cに維持されました。機能的研究のために、対数成長期のMIN6細胞にLNNa特異的小型干渉(si)RNA(マイクロアレイ結果に基づく選択的なlncRNA標的)をトランスフェクトしました。製造元の指示に従い、リポフェクタミン2000を使用した陰性対照のsiRNA(阻害剤NCグループ)を使用しました。24時間培養後、細胞は定量ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)またはウェスタンブロットで解析され、ノックダウン効率を測定しました。このsiRNAの標的配列は以下の通りです:siMEG3:GCGUCUCUCUGCCAUTAAAUGGCAGGAAGAGACGCT;siNC: UUCUCCGAACGUCACGUTTACGUGACGUGGAGAGAT。各実験は3回ずつ行われ、3回繰り返し行われました。
5. 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ
製造元の指示に従い、市販のフェノール系RNA分離試薬を用いて膵臓組織サンプルおよびMIN6細胞から総RNAを抽出しました。補完DNAは逆転写キットを用いて、総反応容積20μLで合成されました。逆転写後、ほとんどのサンプルのcDNA濃度は、サンプル定量解析に基づく約1 μg/μLでした。その後、定量的リアルタイムPCR増幅のために1μLのcDNAテンプレートが使用されました。qRT-PCRは、SYBR GreenベースのPCR検出キットを用いて、以下のサイクル条件下で実施されました:95°Cで30秒、90°Cで15秒、60°Cで34秒、68°Cで30秒。比較閾値サイクル法(2-ΔCT 法)を用いて相対的な遺伝子発現レベルを決定しました。GAPDHはリアルタイムPCRデータの正規化における内部参照遺伝子として使用されました。すべての実験手順は各メーカーのプロトコルに従って行われ、各実験は少なくとも3回独立して繰り返されました。本研究で使用されたプライマー配列は 補足表1 および 表2に記載されています。
6. 細胞計数キット-8アッセイ
細胞増殖能力は、製造元のガイドラインに従い細胞計数キット-8アッセイを用いて測定されました。簡単に言うと、miN6細胞はsi-MEG3またはsi-NCによるトランスフェクション後、1ウェルあたり5 x 103 細胞の密度で96ウェル培養プレートにプレートされ、24時間維持されました。指定された時間点で、各ウェルに10μLの細胞生存試薬が導入され、プレートは37°Cで2時間インキュベートされました。その後、マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸収度値を測定しました。細胞生存率は対照群に対する割合で計算されました。
7. フローサイトメトリーによるアポトーシス検出
製造元の指示に従い、ANNEXIN V-FITC/PI アポトーシス検出キットを用いてMIN6細胞のアポトーシス変化を調べました。siRNAトランスフェクションを48時間行った後、細胞を採取し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、結合バッファーに再懸濁させました。その後、細胞は5μLのAnnexin V-FITCと5μLのプロピジウムヨウ化物で室温、暗い環境で15分間培養されました。染色直後、サンプルはフローサイトメトリーで分析されました。初期および後期アポトーシス細胞集団はフローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いて定量化しました。その後、グループ間比較のためにアポトーシス細胞の割合が算出されました。各実験は独立して3回実施されました。
8. ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット実験は、以前に報告されたプロトコルに従って実施されました。細胞はまずトリプシンで消化され、採取後、放射免疫沈殿法解析用溶解バッファーを用いて氷上で溶解しました。タンパク質濃度を定量し、同量のタンパク質を10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルで分離させた後、ポリビニリデンフッ化物膜に移しました。膜ブロッキング後、サンプルはNF-κB(1:1000)、Bcl-2(1:1000)、Bax(1:1000)、カスパーゼ3(1:1000)、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)(1:2000)に対する一次抗体で所定希釈比でインキュベートされ、その後ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体でインキュベーションされました。タンパク質信号は化学発光システムを用いて検出され、ImageJソフトウェアで定量化されました。内部負荷制御としてGAPDHが用いられ、タンパク質発現レベルは対照群に対するフォールド変化として表されました。
9. 統計分析
データは平均±標準偏差(SD)として表されました。グループ間の比較は、統計解析を用いたMann–Whitney U検定19 を用いて実施されました。p値<0.05は統計的に有意とされました。
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鉄過負荷マウスモデルの評価および膵臓組織における母体発現遺伝子3の発現測定
MEG3の役割をin vivoで調査するため、マウスに鉄デキストランの腹膜内注射を用いて鉄過剰モデルを構築しました。対照群と比較して、モデル群の血清鉄分濃度は有意に増加しました(p<0.05)(図1A)。組織学的検査では、ヘマトキシリン・エオシン染色およびプルシアンブルー染色で膵臓組織に顕著な鉄沈着が認められました。さらに電子顕微鏡により、膵腺腺細胞の構造的損傷、特に腫れたミトコンドリアが確認され、モデル構築と膵臓損傷の成功が示されました(図1B)。
RT-PCRを用いて、鉄過剰なマウスの膵臓組織におけるMEG3発現を調べたところ、対照マウスと比較して発現がダウンレギュレーションされていることが判明しました(図2A)。MEG3は鉄過剰を...
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異常なグルコース代謝は、β-TM患者に共通して深刻な合併症であり、しばしばIGTやDMとして現れます。本研究では、鉄過剰が膵臓損傷を引き起こし、膵組織におけるlncRNA MEG3の発現が有意に低下し、膵島β細胞のアポトーシスが増加していることが分かりました。さらに、MIN6細胞におけるMEG3のノノックダウンはβ細胞アポトーシスを促進し、NF-ĸBの活性化と関連していることから、MEG3と鉄過剰負荷によるβ細胞機能障害との潜在的なメカニズム的関連を示唆しました。これらの結果は、MEG3が鉄過剰状態の膵β細胞で保護的な役割を果たし、β-TMにおける異常なグルコース代謝の病因に寄与する可能性を示唆しています。β-TMにおけるグルコース調節障害は、古典的な1型または2型糖尿病とは機械的に異なります。β-TMでは、膵臓の鉄沈着が主な原因であり、これが膵島細胞の損傷とインスリン分泌欠損を引き起こします21,22。過...
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著者たちは利益相反を一切認めていない。
本研究は中国海南省自然科学基金(822QN445)および海南省教育委員会基金(Hnky2024-30)から資金提供を受けました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCL (pH=6.8) | 北京索莱宝科技有限公司 | T1020 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TIANGEN | GH101-01 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TRANS | GH101-01 | |
| -80ºC refrigerator | BIOBASE | BDF-86V348 | |
| ABI 7500 real-time PCR system | Applied Biosystems, USA | ||
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit | MULTI SCIENCES | AP101-100-kit | |
| BCA Protein Assay Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd. | E-BC-K318-M | |
| Biopulverizer | biospec | ||
| BSA | 北京索莱宝科技有限公司 | A8020 | |
| C57BL/6J male mice | Gempharmatech Co,Jiangsu,China | ||
| CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit | KeyGEN BioTECH | KGA317 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| DMEM | KeyGEN BioTECH | ||
| Flow cytometry | ACEA Biosciences, USA | NovoCyte 2060R | |
| Fluorescence PCR instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | ||
| Glycine | 北京索莱宝科技有限公司 | G8200 | |
| High-capacity cDNA reverse transcription kit | Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA | ||
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Servicebio | GB23301 | 1/2000 |
| HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Servicebio | GB23303 | 1/2000 |
| Human LncRNA Array V5.0 | Arraystar,Rockville, Maryland, USA | ||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| Microarray scanner | Agilent Technologies,California, USA | ||
| MIN6 cell | procell | KGM12800N | |
| Mini-Bead-Beater-16 | biospec | ||
| Mouse Anti-GAPDH | TransGen Biotech | HC301 | 1/2000 |
| NanoDrop spectrophotometer | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | ND-2000 | |
| PAGE Pre-Solution | 北京索莱宝科技有限公司 | A1010 | |
| Primers | Generay Biotech,Anhui, China | ||
| PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Rabbit Anti Bax | proteintech | 50599-2-ig | 1/5000 |
| Rabbit Anti Bcl-2 | abcam | ab194583 | 1/1000 |
| Rabbit Anti Caspase3 | abcam | ab184787 | 1/2000 |
| Rabbit Anti P65 | abcam | ab32536 | 1/8000 |
| Rabbit Anti p-P65 | Affinity | af2006 | 1/1000 |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa, Japan | ||
| TRIzol | Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA | ||
| TRIzol reagent | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | Chemi DocTM XRS+ | |
| Ultraviolet spectrophotometer | NanoPhotometer | NP80 |