アコニチンは、JNK1/2シグナル伝達経路の活性化に関連するラットの心筋損傷を誘発します

サマリー

本研究は、ラットにおけるアコニチン誘発性心筋損傷におけるJNK1/2シグナル伝達の潜在的役割を調査しました。JNK1/2リン酸化の増加は心筋損傷と関連し、JNK経路の薬理学的阻害は心筋損傷を部分的に緩和したため、JNKシグナル伝達がアコニチン誘発性心毒性に関与している可能性を示唆しました。

要約

急性アコニチン(Acon)中毒は不整脈や心筋障害を引き起こすことがあります。しかし、その根本的なメカニズムは依然として不明です。本研究は急性アコン中毒による心筋損傷のメカニズムを調査しました。急性アコン中毒のラットモデル(n = 51)は胃内投与によって確立されました。心電図トレーシングを用いて心拍リズムの変化を記録しました。ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色およびマソン染色を行って、心筋の病理学的損傷およびコラーゲン沈着の評価を行った。静脈血中の心臓酵素およびタンパク質の発現レベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて検出されました。AconとJNK経路の構造・活性関係は分子ドッキングによって調査されました。リン酸化されたc-Jun N末端キナーゼ1/2(JNK1/2)タンパク質の発現レベルはウェスタンブロッティングによって検出されました。本研究では、アコンを胃内投与後にラットに心室性不整脈が観察されました。心筋組織は心筋線維と細胞の不規則な配置を示し、異常なコラーゲン沈着を伴いました。分子ドッキングの結果は、AconとJNK1/2の間に潜在的な相互作用があることを示しました。一方で、心臓酵素およびタンパク質の発現レベル、ならびにリン酸化されたJNK1/2の発現レベルは有意に増加しました。さらに研究により、JNK阻害剤による治療SP600125ラットにおけるAcon誘発心筋損傷が部分的に逆転することが示されました。これらの結果は、JNK1/2リン酸化が急性アコニチン中毒による心筋損傷の発症に関与していることを示しています。これらの発見は、JNK1/2シグナル伝達経路の活性化がアコニチン誘発性心筋損傷に寄与し、JNK1/2経路の阻害が急性アコニチン中毒による心筋損傷を緩和する可能性があることを示唆しています。

概要

アコンは、毛頭科のウ頭植物から取られる天然のジテルペンアルカロイドエキスです。抗^{炎症作用1,2}、鎮痛、抗腫瘍、抗リウマチ、免疫代謝、血液循環促進効果^3,4,5。しかし、アコンを含む製剤の不適切または過剰な使用は、深刻な中毒を引き起こす可能性があります。アコニチン中毒による症状には、心臓症状⁶、神経症状⁷、消化^器症状8が含まれます。近年、世界中でアコナイト中毒や死亡のケースが頻繁に報告^{されています。}アコン中毒は主に心血管系、神経系、消化器系に現れます。その中でも、中毒による主な死因は心毒性です。アコンによる心臓の損傷は非常に深刻です。特に、発症が短期間であるため、迅速な臨床治療を行うことが困難です。通常、急性のアコン中毒は吐き気、下痢、めまい、胸痛、呼吸困難、その他の初期症状を^数時間以内に引き起こします。現時点では、急性アコン中毒による心筋損傷の詳細なメカニズムはまだ明確ではなく、アコン中毒による心筋損傷を効果的に緩和できる臨床的に有効な薬剤は存在しない^12,13。

急性アコン中毒における損傷は、心筋損傷のメカニズムを探る可能性を秘めています。このようなモデルは、急性アコン中毒患者の将来の治療に応用可能であり、症候群の早期発症を早期に防ぐ可能性があります。研究では、毒に対する免疫応答におけるc-Jun n末端キナーゼ(JNK)シグナル伝達経路の役割が推測されています。JNKシグナル伝達経路は、ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路の一つです。JNKファミリーは3つの遺伝子(JNK1/MAPK8、JNK2/MAPK9、JNK3/MAPK10)を持っています。JNK1およびJNK2は心臓を含むほとんどの組織で発現し、JNK3は主に脳に存在^し、主に細胞の酸化ストレスおよび炎症反応に関連しています¹⁵。研究では、JNK介在シグナル伝達経路が脳および心筋虚血/再灌流損傷において重要な役割を果たすことが明らかになっています(^16,17)。C66の投与は、マウス心臓におけるJNK活性化を阻害することで高脂肪食による心筋炎症を緩和します¹⁸。クロロゲン酸はJNKシグナルを阻害することでTNF α誘発心筋細胞損傷を緩和します¹⁹。ピノセブリンはp38/JNK MAPKシグナル伝達経路を阻害することでLPS誘発性の心筋損傷と炎症反応を緩和し、心機能障害および不^整脈を緩和します。これらの研究は、主にJNK1/2のJNKシグナル伝達の変化が心筋損傷と密接に関連していることを示しています。一方、JNKは一連の活動でAconの下流標的にもなっています。ある研究では、高用量のAcon曝露がJNK酵素活性化経路を媒介し、ゼブラフィッシュ胚(幼体)において体長短縮、体形の曲線、脳発達障害などの発生毒性を引き起こすことがわかりました²¹。本研究は、AconがJNKシグナル伝達経路を活性化する可能性を示唆しています。しかし、急性アコニチン中毒による心筋損傷におけるJNKシグナル伝達経路の役割は不明です。

本研究は、異なる胃内投与量と時間間隔を設定し、心筋損傷に対する急性アコン中毒のラットモデルを確立しました。さらに、Aconが心筋におけるJNK1/2のリン酸化レベルに与える影響と、このモデルにおけるJNKシグナル伝達経路の活性化についても探りました。急性アコン中毒によるラットの心筋損傷におけるJNK1/2リン酸化の役割を探ることは、急性アコン中毒による心筋損傷の研究に理論的基盤を提供します。

プロトコル

実験設計および実施計画は、昆明医科大学動物実験委員会により承認され(承認番号:Kmmu20220652)、2022年6月に承認されました。すべての実験計画は「昆明医科大学動物実験ガイドライン」に従って実施されました。この研究で使用されたすべての材料のリストは 材料表に記載されています。

注意:Aconの高い毒性のため、すべての準備および投与手順は機関の検査室安全規則に従って行われました。Aconを扱う職員は、手袋、実験用コート、マスクなどの適切な個人用防護具を着用し、Aconの準備手順は曝露リスクを最小限に抑えるために適切な予防措置を取って実施されました。動物はAcon投与中および投与後に重篤な毒性や苦痛の兆候がないか厳重に監視され、必要に応じて人道的な結果が適用されて苦痛を最小限に抑えました。生物廃棄物およびアコン汚染物質は、機関のバイオセーフティ規則に従って処分されました。

動物治療

成体のオスのスプラグ・ドーリー(SD)ラット(2か月、230g)は、昆明医科大学のSPF動物実験棟、実験動物センターで飼育されました。すべてのSDラットの摂食条件はSPFラットの摂食要件に従って処理されました。実験前に1週間適応的に育てられ、12時間断食しました。Aconは0.05 Mの酢酸バッファー(Acet)に溶解され、SDラットはランダムコントロールの原則に従って4つのグループに分けられました。グループ1(Acon-1 mg)はガベージで1mg/kgのAconを投与しました。グループ2(Acon-2 mg)は胃内投与で2mg/kgのAcon投与;グループ3(アセット)、胃内緩衝で0.05 Mアセテート2 mL投与;およびグループ4(対照群、治療なし)。サンプルは胃内投与後1時間、3時間、6時間後に採取されました。合計36頭のラットが研究され、各グループにそれぞれ3頭ずつ、1時間、3時間、6時間で調査されました。指定された各時刻で、まず心電図の記録が行われました。その後、ラットに麻酔をかけ、血清生化学分析のために血液サンプルを採取しました。採血後、ラットは生贄にされ、心臓組織は迅速に切除されました。心筋組織の一部は組織学的解析(HEおよびマソン染色)のために固定され、残りの組織はウェスタンブロッティングによるタンパク質発現解析のために保存されました。JNK1/2活性化剤および阻害剤を試験する実験では、ランダムコントロールの原理に従いSDラットを5つのグループに分けます。モデル群は胃内Acon投与を2 mg/kg、阻害菌群は最初^22mg/kg SP600125腹腔内注射を受け、その後2時間後に2 mg/kgのAconをガヴェージで投与しました。作動薬群は最初に0.1 mg/kgの腹膜内注射を受けました(Anis)^23,24、その後2時間後に2 mg/kgのAconをガベージで投与されました。DMSO群は0.8%DMSOコ溶剤混合液2mLの腹膜内注射を受けました。対照群には治療を受けられませんでした。合計15匹のラットが研究されました。すべての染色結果は観察バイアスを最小限に抑えるためにブラインド方式で分析されました。実験期間中、ラットはアコニチン投与後の生存状況および重篤な毒性の兆候を継続的に監視しました。死亡率は各指定された観測時刻(1時間、3時間、6時間)で記録されました。死は呼吸と心拍の完全な停止と定義されました。持続的な呼吸困難、起立反射の喪失、歩行不能、または衰弱状態などの重度の苦痛を示す動物は、人道的な終末に達したとみなされ、苦痛を最小限に抑えるために直ちに深麻下で安楽死させられました。各ラットグループごとの死亡数(表1–4)。

ラット心電図(ECG)トレーシング

各グループのラットは心電図トレーシングを受けました。具体的な方法は以下の通りで、麻酔後に腹膜内注射でペントバルビタールナトリウムを30 mg/kgの用量で投与しました。ネズミたちは動物実験コンソールの上で仰向けに固定されていました。コンピュータはBL-420N生物信号取得・解析システムに接続され、心電図リードワイヤープラグはBL-420Nシステムの3チャンネル入力ポートに挿入されました。ピンはラットの右前肢の内側、右後肢、左後肢に皮下で挿入されました。手術前にピンは75%アルコールで浸され滅菌され、筋肉にピンを挿入しないように注意されました。その後、心電図のリード線電極クリップが各肢のピンに接続されました。BL-420N生物信号取得・解析システムの電源スイッチとシステムソフトウェアが起動されました。信号取得はチャンネル3が選択され、信号タイプはラット心電図として設定されました。パラメータは以下の通りに設定されました:サンプリングレート、1 kHz;航続距離は2.0 mV;時間定数(ハイパスフィルタリング)、200ms(0.80Hz);ローパスフィルタリング、100Hz;スキャン速度:200.0 ms/div;50Hzノッチフィルターはオフにされました。Lead II心電図を記録し、心電図の変化が観察されました。心電図が安定した後、3分間のモニタリングと記録が行われ、データはグループごとに保存され、後続の分析に備えられました。心電図記録後、電極クリップとピンは外され、ラットはケージに戻されました。ラットは温かく保たれ、窒息による死亡を防ぐため、麻酔から完全に回復するまで呼吸を監視しました。基線心電図記録は治療開始前1日に実施されました。2日目にはラットに胃内ガベージによるAcon投与し、投与後1時間、3時間、6時間後に同じ手順で心電図記録を行った。

ヘマトキシリンとイオシン(HE)染色およびマッソン染色

心臓は水平短軸面で切断され、SDラットの心臓先端の心組織を採取し、室温で4%ポリホルムアルデヒドに24時間固定した。固定組織は脱水され、キシレンで除去され、パラフィンワックスに埋め込まれました。その後、4μm厚のセクションを標準手順に従ってHEおよびマッソン染色で染色しました。HE染色では、ヘマトキシリン染色を2分間行い、その後サンプルを温水に1分間浸け、さらにエオシン染色を30秒間行いました。マッソン染色では、ワイガート鉄ヘマトキシリン溶液で5分間、次にマッソンブルー溶液で3〜5分、最後にアニリンブルー溶液で1〜2分間染色します。スライドは通常の光学顕微鏡で観察されました。各セクションに対して、重なり合わない5つの顕微鏡フィールドが同じ倍率でランダムに選ばれ、大きな血管や目立つアーティファクトを避けました。コラーゲン体積分数(CVF)はImageJを用いて式(1)に従って計算されました。

(1)

酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)

心電図を記録した後、ラットはペントバルビタールナトリウムで麻酔され、その後静脈血を採取するために正中開腹術が行われました。血液サンプルは使い捨ての静脈採血針で下大静脈を刺して採取しました。血液は4°Cで一晩培養され、遠心分離後に1000 × g で20分間上清液を採取しました。CK-MB、AST、LDH、CTn-1、h-FABPの濃度をELISAアッセイキットを用いて測定しました。ELISAは製造元の指示に従って実施されました。各井戸の光学密度(OD)値は450nmでマイクロプレートリーダーを用いて測定されました。

ウェスタンブロッティング解析

総タンパク質はタンパク質抽出キットを用いて心臓組織から抽出されました。タンパク質濃度の測定にはBCAタンパク質アッセイキットが用いられました。総タンパク質(検査対象のサンプル体積は10μL)は10%のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離され、PVDF膜に移し、5%脱脂乳で30分間ブロッキングしました。その後、膜をJNK1/2(1:500)、p-JNK1/2(1:1000)、およびGAPDH(1:4000)の一次抗体で一晩インキュベートしました。翌日、すべての膜をPBSTで3回洗浄し、適切な二次抗体(1:5000)で1時間インキュベートしました。最後に、信号検出のために強化化学発光試薬が用いられました。現像液はPVDF膜ストリップに均等に点滴して塗布し、10秒培養した後、露出、現像、画像検査を行いました。ウェスタンブロットバンドの強度はImageJソフトウェアを用いて測定されました。

分子ドッキングの検証

アコニチンのSDF 3D分子構造はPubChemデータベースからダウンロードされ、OpenBabelソフトウェアを用いてmol2構造に変換されました。JNK1およびJNK2の最高解像度かつ最長のPDBタンパク質構造は、UniprotおよびProtein Data Bankのデータベースからダウンロードされました。水素添加、配位除去、完全な水素付加は高分子タンパク質に対して行われ、完全な水素付加および電子負荷は小分子化合物に対して行われ、トーション結合が形成されました。分子ドッキング実験はAutoDock Vinaを用いて行われ、結合親和性≤-7.0 kcal/molが強いリガンド-タンパク質相互作用を示すものとして定義されました。PyMolはドッキング複合体の3D構造を可視化するために使用され、Discovery Studioはドッキング複合体の2D構造を可視化するために使われました。

統計解析

すべての実験は独立して3回繰り返し行われました。GraphPad Prism 8を用いてすべてのデータを統計的に解析・グラフ化しました。すべてのデータは平均±標準偏差(SD)として示されました。学生のt検定は2つのグループ間の比較に用いられました。同一時点の複数のグループ間の比較や同一グループ内の時間経過分析には、一方向ANOVAが用いられました。 p < 0.05は統計的に有意な²⁵を示していると考えられました。

結果

アコンガベージ後のラットの心電図結果

過去の研究では、アコニチンの毒性作用は投与後数時間以内に初期段階で起こることが示されています^26,27。したがって、この期間内で急性心毒性の早期発生と進行を捉えるために、実験には1時間、3時間、6時間の3つの時間点を選択しました。心電図の結果は、Acon作用を1時間、3時間、6時間行った後、対照群とAcet群で不整脈は発生せず、心電図の変化も明らかでないことを示しました。Acon-1mg群のラットは、それぞれ早期心室収縮と早期心室二重症、早発心室三連、短時間破裂心室頻脈、単型心室頻拍、両方向心室頻拍、および1つ以上の心室不整脈を経験しました。Acon-2 mg群のラットは、早期心室収縮、1つ以上の心室不整脈(早期心室二重性、短時間破裂性心室頻脈、両方向性心室頻脈を含む)を発症しました(図1、補足図1–2)。Aconは心筋の病的損傷を促進し、ラットの心筋組織におけるコラーゲン染色を増加させます。

心筋組織はHE染色で評価されました。結果は、対照群およびAcet群と比較して、Acon治療を1時間、3時間、6時間後に行った結果、Acon-1mg群のSDラットの心筋組織に心筋線維の部分破裂、心筋細胞の不規則な配置、心筋間質の拡大、心筋間質の浮腫が見られた。 ほとんどの心筋細胞は腫れ、核は深く染色・凝縮し、多数の心筋細胞が変性し、心筋線維細胞質には丸い液胞が形成されます(矢印で示されます)。Acon-2 mg群のSDラットの心筋組織における筋繊維条状は不明瞭または消失していました。筋束の配置は緩く乱れており、筋間空間は広がり、多数の細胞核が深く染色され、核、細胞間浮腫、心筋細胞は腫れ変性していた。心筋線維の細胞質は円形の液胞(矢印で示されている)を示しました(図2A、 補足図3A、補足図4A)。

マッソン染色は心筋組織内のコラーゲン沈着を評価するために実施されました。対照群およびアセット群では、心筋細胞は正常な形態を示し、心筋間質におけるコラーゲン沈着は最小限に抑えられていました。Acon-1 mg群では、一部の間質部で青色染色コラーゲンの軽度の増加が観察されました。Acon-2 mg群では、より広範囲にわたる青色染色領域が心筋組織全体に広がり、筋フィラメントの配置が乱れ、正常な心筋構造の乱れが伴っていました。アコン-2mg群のコラーゲン染色の程度はアコン-1mg群よりも大きかった。定量解析により、Acon-1 mgおよびAcon-2 mg群のコラーゲン体積分数(CVF)が対照群およびAcet群と比較して有意に増加していることが示されました(n=3ラット、一方変異分析値、 p < 0.05)。特に、胃内投与後6時間でAcon-2 mg群のCVF値は最高値に達しました(図2B、補足 図3B、補足 図4B)。観察期間が1〜6時間であることを考えると、これらの所見は既存の心筋線維症よりも、浮腫やコラーゲン染色パターンの変化などの急性間質変化を反映している可能性が高いです。さらに、Acon-1 mgおよびAcon-2 mg治療後1時間、3時間、6時間後の心率に有意な差は認められませんでした(表5)。

Aconはラットの静脈血中の心臓酵素および心臓タンパク質レベルを促進します

アコン誘発性心筋損傷を評価するため、CK-MB、AST、LDH、CTn-I、h-FABPなどの心損傷マーカーの血清レベルを測定しました。対照群およびAcet群と比較して、Acon-1 mgおよびAcon-2 mg群は、1時間、3時間、6時間でCK-MB、AST、LDH、CTn-I、h-FABPのレベルが有意に増加しました(n=3ラット、一方向ANOVA、 p < 0.05)。さらに、同時期において、これらのマーカーの増加はAcon-1 mg群よりもAcon-2 mg群でより顕著でした(p < 0.05)(図3)。

分子ドッキング結果

Aconがラットの心筋損傷のシグナル伝達経路に与える影響をさらに調査するため、分子ドッキングを用いてAcon関連経路タンパク質を特定しました。ドッキング結果は、Aconが複数の非共有結合を通じてJNK1およびJNK2の活性ポケットに安定的に結合できることを示しました。JNK1では、アコニチンはALA267およびSER299と2つの従来の水素結合を形成し、それぞれ2.0 Åと2.1 Åの結合距離を持ち、リガンドの固定に寄与する強い方向性相互作用を示しています。さらに、アコニチンと周囲残基間で広範なファンデルワールス相互作用が観察され、結合ポケット内での空間的相補性の密接な促進が促進されました。ILE304とのアルキル/π-アルキル相互作用を含む疎水性相互作用は、疎水性微小環境内でリガンドをさらに安定化させました。炭素-水素結合も同定され、配位結合を支える協調的な相互作用ネットワークを形成しました(図4A–C)。JNK2では、アコニチンがLEU302(2.1 Å)と1つの従来の水素結合を形成し、重要なアンカー相互作用として機能しました。JNK1と同様に、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、炭素-水素結合が結合して配位子-タンパク質複合体の安定化に寄与しました(図4D–F)。検査対象化合物のドッキング結果は結合スコア(kcal/mol)として報告され、 表6に示されています。全体として、水素結合は特異性と固定を提供し、疎水性相互作用はリガンドの埋め込みおよび結合親和性を高め、ファンデルワールス相互作用は全体の複雑体の安定性に寄与しました。これらの発見は、アコニチンがJNK1およびJNK2の両方と安定した複合体を形成できることを示し、標的化剤としての潜在力を支持しています。

AconはJNKリン酸化レベルをアップレギュレーションします

Aconが心筋組織におけるJNKシグナル伝達経路への影響をさらに調査するため、JNK1/2リン酸化の発現をウェスタンブロッティングで評価しました。対照群およびAcet群と比較して、Acon-1 mgおよびAcon-2 mg群はp-JNK1/2のレベルが有意に増加しました(n=3ラット、一方経算ANOVA、 p < 0.05)。さらに、JNK1/2のリン酸化レベルはAcon-2 mg群でAcon-1 mg群よりも有意に高かった(p < 0.05)(図5A)。Acon-2 mg群内では、異なる時間点間の比較でp-JNK1/2レベルが1時間、3時間、6時間で有意に増加し、最高値は6時間後に観察されました(n=3匹あたり、一方方向ANOVA、 p < 0.05)(図5B)。これらの結果に基づき、6時間のAcon-2 mg群が次の実験に選ばれました。

JNK阻害剤はラットの心筋組織における心筋病理学的損傷およびコラーゲン染色を緩和します

JNKシグナル伝達経路の調節役割をさらに評価するため、心筋組織におけるp-JNK1およびp-JNK2の発現レベルをウェスタンブロッティングで評価しました。対照群およびDMSO群と比較して、Acon群はp-JNK1およびp-JNK2の発現レベルが有意に増加しました(n=3ラット、1群あたり単方向ANOVA、 p < 0.05)。Acon群と比較して、Acon+SP600125群はp-JNK1およびp-JNK2のレベルが有意に減少しました(n=3ラット、一方方向ANOVA、 p < 0.05)。これに対し、Acon+SP600125群と比較すると、Acon + Anis群はp-JNK1およびp-JNK2の発現レベルが有意に増加しました(n=3ラット、一方方向ANOVA、 p < 0.05)(図6)。

アニスおよびSP600125が心筋損傷に与える影響についてもさらに調査されました。HE染色の結果、Acon群と比べてAcon+SP600125群の心筋組織の間質性浮腫が減少し、一部の心筋細胞の腫れが消失し、細胞質が均一であることが示された。筋空間は満たされ、筋間空間は薄くなり、一部の心筋線維はきつく秩序正しく配置され、少数の細胞核が深く染色され、心筋線維の細胞質には小さな丸い液胞が現れ、心筋の病理学的損傷が軽減されます。Acon+SP600125群と比較して、Acon + Anis群は心筋線維が破損し、筋肉の隙間が広がり、心筋線維が緩やかかつ無秩序に並び、心筋細胞が腫れ変性し、核染色質が深く染色され、細胞間浮腫が発生した(図7A)。

マソン染色は心筋組織のコラーゲン染色を評価するために実施されました。Acon+SP600125群では、心筋間質に中程度の青色染色が認められました。Acon群と比較して、Acon+SP600125群のコラーゲン体積比(CVF)は有意に減少し、アコニチン誘発性間質変化の減弱を示しました。対照的に、Acon+Anis群では、Acon+SP600125群に比べて心筋間質により広範囲な青色染色コラーゲン領域が観察され、CVFも有意に増加しました(n=3ラットあたり、一方方向ANOVA、 p .<0.05)(図7B)。さらに、群間で心拍数に有意差は認められませんでした(表5)。観察期間が短い(1〜6時間)を考慮すると、これらの変化は既存の心筋線維化よりも、浮腫やコラーゲン染色パターンの変化などの急性間質変化を反映している可能性が高いです。これらの結果は、SP600125がアコニチンによる心筋損傷を緩和する一方で、アニソマイシンはこれらの実験条件下で心筋損傷をさらに悪化させることを示唆しています。

JNK阻害剤はラット血清中の心臓酵素および心臓タンパク質の発現を緩和します

ELISAの結果、Acon群と比較して、ACON + SP600125群ではCK-MB、AST、LDHの発現が有意に減少した一方で、Anisの作用後にCK-MB、AST、LDHの発現が増加したことが示されました(N = 3ラット、1群、一方判定ANOVA、 P < 0.05)。さらに、Acon群と比較して、acon + SP600125群ではcTn-Iおよびh-FABPの発現が有意に減少しました(n=3ラット、一方方向ANOVA、 p < 0.05)。Acon + SP600125群と比較して、acon + Anis 群ではcTn-Iおよびh-FABPの発現が有意に増加しました(n=3ラット、一方経算ANOVA、 p < 0.05)(図8A–8B)。

データの利用可能性:

本研究で使用されたすべての生データは、原稿に添付された補足ファイルで入手可能です。

図1:ラットの不整脈の心電図図(Acon作用6時間後)。 上から下へ、対照群、アセット群、アコン-1mg群、アコン-2mg群です。Acon-1mg-A-ガベージおよびAcon-2 mg-A-ガベージの不整脈の種類(不整脈発生の順に):Acon-1mg-A-ガベージ:早期心室収縮;早熟心室二重症;両方向性心室頻脈。Acon-2 mg-A-ガバッジ:早期心室収縮;早熟心室二重症;心室頻拍の短いバースト。 略語;B-ガヴェージ=アコンガヴェージの前;A-ガヴェージ=アコンガヴェージの後。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:HE染色およびマッソン染色によるラット心筋組織における心筋損傷およびコラーゲン染色。 (A)ラット心筋組織の病理学的変化はHE染色によって検出されました(黄色の矢印は損傷した心筋細胞によって形成される円形液胞を示しています);スケールバー=100μm。(B) ラット心筋組織におけるコラーゲン染色はマッソン染色によって検出されました。スケール=50μm。平均 ± 標準偏差、n = 3。すべての P値は分散の独立一方向解析を用いて算出されました。*p < 0.05, **p < 0.01。40倍および400倍。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図3:ラット血清中のCK-MB、AST、LDH、CTn-I、h-FABPのレベルは心筋損傷を示した。(A–F)。CK-MB、AST、LDH、CTn-I、h-FABPのレベルはELISAキットを用いて測定されました。平均±SD、n = 3。すべての p値は分散の独立一方向解析を用いて算出されました。*p < 0.05, **p < 0.01.略語;CK-MB = クレアチンキナーゼ-MB;AST = アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ;LDH = 乳酸脱水素酵素;cTn-I = 心臓トロポニンI;h-FABP = 心臓型脂肪酸結合タンパク質。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:AconとJNK経路の分子ドッキング結果。 (A–B)および(D–E)AconとJNK1/2タンパク質の2次元相互作用図。(C)および(F)AconとJNK1/2タンパク質の3次元相互作用図。略語;JNK = c-Jun N末端キナーゼ。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:AconはJNKリン酸化レベルをアップレギュレートします。 (A–B) ラット心筋組織におけるp-JNK1/2およびJNK1/2の発現レベルはウェスタンブロッティングによって検出されました。平均 ± 標準偏差、n = 3。すべてのp値は分散の独立一方向解析を用いて算出されました。*p < 0.05, *p < 0.01。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:JNK阻害剤がAcon誘導のJNKリン酸化を阻害する。 ラット心筋組織におけるp-JNK1/2およびJNK1/2の発現レベルはウェスタンブロッティングによって検出されました。平均 ± 標準偏差、n = 3。すべての p値は分散の独立一方向解析を用いて算出されました。*p < 0.05, **p < 0.01. この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:JNK阻害剤はラットの心筋病的損傷およびコラーゲン染色を緩和します。 (A) ラットの心筋組織の病理学的変化はHE染色によって検出されました(黄色の矢印は損傷した心筋細胞によって形成される丸い液胞を示しています);スケール=100μm。(B) ラットの心筋組織におけるコラーゲン染色はマッソン染色によって検出されました。スケール=50μm。平均±SD、n = 3。すべての p値は分散の独立一方向解析を用いて算出されました。*p < 0.05, **p < 0.01.40倍と400倍。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図8:JNK阻害剤はラット血清中のCK-MB、AST、LDH、CTn-I、h-FABPのレベルをダウンレギュレートします。(A–B)CK-MB、AST、LDH、CTn-I、h-FABPの発現レベルはELISAアッセイキットで検出されました。すべてのp値は分散の独立一方向解析を用いて算出されました。平均±SD、n = 3。*p < 0.05, **p < 0.01.略語;CK-MB = クレアチンキナーゼ-MB;AST = アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ;LDH = 乳酸脱水素酵素;cTn-I = 心トロポニンI;h-FABP = 心臓型脂肪酸結合タンパク質。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

	制御	アセット	アコン-1mg	アコン-2mg
ネズミ	9	9	9	9
ネズミの死亡数	0	0	0	0

表1:アコンアクション1時間後のラット死亡数。Acon投与後1時間後、対照群、Acet群、Acon-1mg群、Acon-2mg群でラットは死亡しませんでした。(最終的に各グループあたりの分析対象数は3頭で、死んだラットは置き換えられませんでした。)

	制御	アセット	アコン-1mg	アコン-2mg
ネズミ	9	9	9	9
ネズミの死亡数	0	0	0	0

表2:アコンアクション3時間後のラットの死亡数。 Acon投与後3時間後、対照群、Acet群、Acon-1mg群、Acon-2mg群でラットは死亡しませんでした。(最終的に各グループあたりの分析対象数は3頭で、死んだラットは置き換えられませんでした。)

	制御	アセット	アコン-1mg	アコン-2mg
ネズミ	9	9	9	9
ネズミの死亡数	0	0	4	4

表3:アコンアクション6時間後のラットの死亡数。 Acon投与から6時間後、Acon-1 mg群で9匹中4匹、Acon-2 mg群で9匹中4匹が死亡しました。(最終的に各グループあたりの分析対象数は3頭で、死んだラットは置き換えられませんでした。)

	制御	DMSO	アコン	Acon + SP600125	アコン+アニス
ネズミ	9	9	9	9	9
ネズミの死亡数	0	0	3	1	3

表4:アニスとSP600125行動後のネズミ死亡数。 ラットの死亡数は治療群によって異なりました。Acon-2 mg群では9匹中3匹が死亡しました。Acon+SP600125グループでは、9匹中1匹が死亡しました。Acon + Anisグループでは、9匹中3匹が死亡しました。(最終的に各グループあたりの分析対象数は3頭で、死んだラットは置き換えられませんでした。)

グループ	心拍数(g)
制御	0.71 ± 0.03
アセット	0.73 ± 0.02
アコン-1mg(1時間)	0.73 ± 0.06
アコン-2mg(1時間)	0.75 ± 0.02
アコン1mg(3時間)	0.71 ± 0.04
Acon-2mg(3時間)	0.77 ± 0.03
アコン1mg(6時間)	0.72 ± 0.03
アコン-2mg(6時間)	0.77 ± 0.02
DMSO	0.70 ± 0.03
Acon + SP600125	0.74 ± 0.03
アコン+アニス	0.75 ± 0.04

表5:ラットの心重。 群間で心率に有意な差は認められませんでした。

配位子	JNK1	JNK2
アコン	-7.8 Kcal/mol	-8.41 Kcal/mol

表6:分子ドッキング研究の結果。AconとJNK1間のドッキングスコアは-7.8 Kcal/mol、AconとJNK2間のドッキングスコアは-8.41 Kcal/molです。

補足図1:ラットの不整脈(1時間のAcon作用後)の心電図図。 上から下へ、対照群、アセット群、アコン-1mg群、アコン-2mg群です。Acon-1mg-A-ガベージおよびAcon-2 mg-A-ガベージにおける不整脈の種類(不整脈発生の順に):早期心室収縮;早熟心室二重症;早発心室三連子;短時間バースト心室頻脈;単型心室心拍頻脈;両方向性心室頻脈。Acon-2 mg-A-ガベージ:両方向性心室頻脈。略語;B-ガヴェージ=アコンガヴェージの前;A-ガヴェージ=アコンガヴェージの後。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:ラットの不整脈の心電図図(Acon作用3時間後)。 上から下へ、対照群、アセット群、アコン-1mg群、アコン-2mg群です。Acon-1mg-A-ガベージおよびAcon-2 mg-A-ガベージにおける不整脈の種類(不整脈発生の順に):早期心室収縮;心室頻拍の短時間の発作;両方向性心室頻脈。Acon-2 mg-A-ガベージ:早期心室収縮;両方向性心室頻脈。 略語;B-ガヴェージ=アコンガヴェージの前;A-ガヴェージ=アコンガヴェージの後。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3:AconはAcon作用1時間後に心筋損傷とコラーゲン染色を促進します。(A) ラットの心筋組織の病理学的変化はHE染色によって検出されました(注:黄色い矢印は損傷した心筋細胞によって形成される丸い液胞を示しています);スケール=100μm。(B) ラット心筋組織における線維化はマッソン染色によって検出されました。スケール=50μm。平均 ± 標準偏差、n = 3。すべてのp値は分散の独立一方向解析を用いて算出されました。*p < 0.05、**p < 0.01、40x、400x。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図4:AconはAcon作用 3時間後に心筋損傷とコラーゲン染色を促進します。 (A) ラットの心筋組織の病理学的変化はHE染色によって検出されました(黄色の矢印は損傷した心筋細胞によって形成される円形液胞を示しています);スケール=100μm。(B) ラットの心筋組織におけるコラーゲン染色はマッソン染色によって検出されました。スケール=50μm。平均 ± 標準偏差、n = 3。すべての p値は分散の独立一方向解析を用いて算出されました。*p 0.05< **p < 0.01。40倍および400倍。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

アコンは不整脈や心筋障害を引き起こすことがあります。しかし、Aconによる心筋損傷の根本的なメカニズムは依然として不明です。本研究では、心筋損傷を伴う急性アコン中毒のラットモデルが成功裏に確立されました。これらの結果は、JNKシグナル伝達経路の活性化が、急性アコン中毒による心筋損傷の重要な下流メカニズムとなり得ることを示しました。具体的には、アコン誘発性不整脈および心筋損傷を持つラットでJNK1/2リン酸化レベルが有意に上昇しました。さらに、JNK経路の阻害により、急性アコン中毒による心筋損傷が部分的に逆転しました。これらの発見は、JNK経路の活性化がアコニチン誘発性心筋損傷の病因に重要な役割を果たすことを示唆しています。

急性アコン中毒の主な死因は心毒性です。過去の研究では、Acon治療後、ラットの心筋線維が変性・障害化し、核染色が深まり、好中球浸潤が起こり、丸い液^胞が現れたことが示されています。これは研究結果と一致しています。HE染色の結果、Acon治療群の心筋組織に病理学的変化が見られ、筋束の配置の乱れ、筋隙の拡大、筋繊維の破裂が含まれていました。さらに、通常の条件下では、心臓酵素CK-MB、AST、LDH、および心臓タンパク質cTn-Iおよびh-FABPが血清²⁹にごく少量存在します。心筋細胞が損傷すると、これらのマーカーは大量に血液中に放出されます。30,31,32,33。

本研究の結果、Aconガベージ群ラットの静脈血清中のCK-MB、AST、LDH、cTn-I、h-FABPが観察時点ごとに異なる程度で増加していることが示されました。発現レベルは胃内投与で6時間後に最も高くなります。この発見は^{以前の研究と}一致しています。彼らはAconがラットのH9C2心筋細胞に損傷を与え、ASTレベルを増加させることを発見しました。一方、以前の研究では、Aconを用いてラットの心筋損傷を誘導し、解毒剤が心^筋損傷に与える影響を調べました。その結果、心筋損傷を持つラットの血清中のLDHおよびCK-MBのレベルが上昇していることが分かりました。要するに、関節による心筋損傷マーカーの検出実験結果は、急性アコン中毒による心筋損傷のラットモデルが、1〜2 mg/kgのアコンを胃内投与後1時間、3時間、6時間後に成功裏に確立できることを示しています。胃内投与後の2 mg/kgのAconのモデリング効果は最良のものであり、その後の実験の要件を満たしています。

研究では、AconがNa⁺および^Ca2+イオンチャネルに与える影響が細胞内のカルシウムイオン濃度を増加させ、これがP38-MAPKシグナル伝達経路をさらに活性化し、続いてJNKカスケード反応36,37,38を引き起こすことがわかっています。JNKの活性化は心筋損傷を促進します^。39,40。これはこの実験の結果と一致しています。本研究では、Aconが心筋細胞におけるJNK1/2リン酸化を促進し、JNKシグナル伝達経路を活性化することがわかりました。これは、JNKの活性化がアコニチン誘発性心筋損傷に寄与する下流のシグナル応答である可能性を示唆しています。しかし、AconによるJNK1/2リン酸化の刺激の分子および薬理動態のメカニズムはさらなる調査が必要です。

研究によれば、大量のJNK1/2がリン酸化されるとJNKシグナル伝達経路が活性化され、それが心筋細胞核内の遺伝子の制御されていない発現を媒介し、細胞周期を妨害することが示されています。JNKシグナル伝達経路の阻害は心筋損傷を緩和できます^41,42。HEの結果では、JNK経路阻害剤SP600125がAconによって誘発される心筋組織の病理学的変化を有意に減少させることができます。一方、過去の研究では、冠動脈結紮による急性心筋梗塞のラットモデルでは、青色に染まったコラーゲン線維と心筋組織内のコラーゲン沈着が著しく増加し、JNKシグナル伝達経路の活性化が伴うことが示されました。伝統中国医学の顆粒治療により、JNKシグナル伝達経路の阻害により心筋コラーゲン沈着が減少しました^43,44。

糖尿病性心筋損傷を負ったラットでは、コラーゲン繊維含有量(青色染色)およびコラーゲン体積分数(CVF)が有意に増加しました。同時にJNK信号経路が起動されました。低用量エタノールはJNK経路の活性化を阻害し、ラット心筋組織におけるコラーゲン線維沈着およびCVFの増加を抑制することが報告されています⁴⁵。本研究では、分子ドッキング解析によりアコニチンが複数の非共有結合相互作用を通じてJNK1およびJNK2と相互作用する可能性が示されました。しかし、これらの結果は支持的な証拠とみなすべきであり、生理的結合の直接的な証明とはなりません。さらに、in vivo実験では、アコンがストレッサーとしてJNK1/2リン酸化を上位調節し、JNKシグナル伝達経路を活性化することが示されました。この活性化は、ラットの心筋組織におけるコラーゲン沈着の増加(青色染色)とCVFの上昇と関連し、最終的に心筋損傷を引き起こしました。しかし、JNK阻害剤の添加SP600125アコンの毒性を著しく抑制し、心筋組織のCVF値の増加を減少させました。心筋損傷は正常な心筋細胞膜の完全性を乱し、細胞外空間への細胞内内容の喪失を生み、血液中の心筋酵素のレベル増加として現れます(^46,47)。これらの結果は、ラット血液中の心筋酵素レベルの増加がAconが心筋損傷を引き起こすことも示していることを示しました。同時に、JNK阻害剤は心筋酵素の分泌を阻害し、JNK阻害剤がAconによる心筋損傷を部分的に緩和する可能性を示唆しました。

本研究にはいくつかの限界があることを認めておくべきです。まず、各時点のサンプルサイズが比較的小さく(グループあたりn=3個)、これが分析の統計的検出力を制限する可能性があり、サンプルサイズ決定前に正式な検出力分析は行われていませんでした。さらに、アコニチンの用量範囲は単一で、観察期間は比較的短い(1〜6時間)のみ評価され、長期的な病理学的変化や用量反応関係の評価が制限されました。第二に、JNK1/2リン酸化の増加と薬理学的介入により、アコニチン誘発性心筋損傷におけるJNKシグナル伝達経路の関与が示唆されましたが、アコニチン曝露とJNK活性化の上流メカニズムは十分に調査されていません。アコニチンは主に電位依存性Na⁺チャネルおよび細胞内のCa²⁺恒常性に影響を及ぼし、これが下流のJNK活性化に寄与する可能性があります。しかし、酸化ストレスやカルシウム過負荷経路などの関連するシグナル伝達イベントは、本研究では直接検討されませんでした。第三に、分子ドッキング解析はアコニチンとJNK1/2の相互作用の可能性を支持する証拠のみを提供し、直接的な生理的結合を示さなかった。表面プラズモン共鳴やプルダウンアッセイなどの追加の実験的検証は行われませんでした。さらに、JNK1/2のみが調査されており、アコニチン誘発性心毒性におけるJNK3の潜在的役割は依然として不明です。最後に、SP600125またはアニシン介入後に心電図評価は行われませんでした。したがって、JNK経路の調節がアコニチン誘発性心室不整脈に直接影響を与えるかどうかはさらなる調査が必要です。

まとめると、AconはJNKシグナル伝達経路を活性化し、JNK1/2のリン酸化が増加することで示されており、これはラット心筋組織におけるコラーゲン沈着の促進や心臓酵素放出の増加に見られる心筋損傷に寄与する可能性があります。アコニチン誘発性心毒性は、Na⁺チャネルの活性化、Ca²⁺の過剰負荷、酸化ストレスなど複数の上流イベントを伴うことを考えると、JNK経路の活性化は心筋損傷に寄与する重要な下流シグナル伝達イベントである可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4% パラホルマルデヒド	武漢サービスバイオ株式会社	HJ203501	組織固定
アコニタイン(アコン)	成都DeSiTe生物技術有限公司	DRK-0335-960330	ガベージモデル用の有害化合物
アニリンブルーソリューション	北京ソーラービオ株式会社	G1350	マッソン染色
アニソマイシン(アニス)	メドケムエクスプレス株式会社	153154	JNK経路活性化/制御
ASTエリサキット	武漢華美バイオテクノロジー有限公司	CSB-E13023r	心筋酵素検出
オートドック・ヴィナ	オープンソース	該当なし	分子ドッキング
BCAタンパク質アッセイキット	サンゴン・バイオテック(中国・上海)	詳細は不明です	タンパク質定量
遠心分離機	東莞CNZCN有限公司	TD5M-WS	1000 & times;G遠心分離
Chem3Dソフトウェア	パーキンエルマー	該当なし	リガンドエネルギー最小化
CK-MB エリサ・キット	武漢華美バイオテクノロジー有限公司	CSB-E14403r	心筋酵素検出
cTn-I ELISAキット	武漢華美バイオテクノロジー有限公司	CSB-E08594r	心臓タンパク質検出
使い捨て静脈採血針	KINDLY株式会社	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	採血
増強化学発光(ECL)試薬	ミリポーア株式会社	21302A4	ウェスタンブロット可視化
イオシン	北京ソーラービオ株式会社	20200905	H&E染色
GraphPad プリズム8	グラフパッド・ソフトウェア株式会社	該当なし	統計解析
ヘマトキシリン	武漢サービスバイオ株式会社	CR2203066	H&E染色
h-FABP ELISAキット	武漢華美バイオテクノロジー有限公司	CSB-E16184r	心臓タンパク質検出
ImageJソフトウェア	国立衛生研究所(NIH)	該当なし	ウェスタンブロット定量
JNK1/2一次抗体	華安バイオテクノロジー(中国、杭州)	ET1609-42	ウェスタンブロット抗体
LDH ELISAキット	上海酵素連結バイオテクノロジー	ML003416	心筋酵素検出
マッソン・ブルー・ソリューション	北京ソーラービオ株式会社	20220303	マッソン染色
マイクロプレートリーダー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	ME001000C	ELISA外径測定(450nm)
光学顕微鏡(オリンパスC33)	オリンパス(東京、日本)	C33	組織学イメージング
パラフィンワックス	ライカ 株式会社	2110068	組織埋め込み
PBSTバッファ	メイルンビオ株式会社	MA0015-Apr-27G2	洗浄バッファー
p-JNK1/2 一次抗体	華安バイオテクノロジー(中国、杭州)	ET1601-28	リン酸化JNK抗体
タンパク質データバンク(PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	タンパク質構造源
プロテイン抽出キット	サンゴン・バイオテック(中国・上海)	C510003-0050	組織タンパク質抽出
PubChemデータベース	NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	リガンド構造源
PVDF膜	ミリポーア株式会社	R1PB81493	ウェスタンブロットトランスファー膜
PyMOL	シュルドゥムル;ディンガー社	https://pymol.org/	ドッキングの可視化
SDS-PAGEゲル(10%)	北京ソーラービオ株式会社	817X031	タンパク質電気泳動
スキムミルクパウダー	北京ソーラービオ株式会社	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	ブロッキング試薬(5%)
ナトリウムペントバルビタール	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社	57-33-0	動物処置のための麻酔
SP600125(JNK阻害剤)	メドケムエクスプレス株式会社	112518	JNK経路阻害剤
SPF動物飼育施設	昆明医科大学	該当なし	動物の飼育環境
スプラグ・ドーリーラット(オス、2ヶ月、~230g)	北京華福康生物技術有限公司	http://www.hfkbio.com/	実験動物(n = 51)
ワイガート鉄ヘマトキシリン	広州ウェクシス有限公司	18092001	マッソン染色
キシレン	天津Tjhxsj有限公司	20220208	組織クリアリング