連続遠心マイクロ流体およびハイドロゲル免疫細胞化学 を用いた 循環希少細胞の堅牢な単離および多重同定

サマリー

本研究は、循環中の希少細胞を効率的に分離・同定するための連続遠心マイクロ流体ワークフローを提示します。このシステムは正確な液体制御を可能にし、細胞損失を最小限に抑えることで、CTCやcCAFを含む複数のCRCサブタイプを同時に解析して診断精度を向上させます。

要約

循環型希少細胞(CRC)、循環腫瘍細胞(CTC)や循環性がん関連線維芽細胞(cCAFs)は、がん診断と予後にとって有望なバイオマーカーです。しかし、極めて低い存在量と表現型の異質性から、効率的な分離やマルチパラメトリック解析は技術的に困難です。ここでは、全血からCRCsを逐次的に分離・同定するための連続遠心マイクロ流体ワークフローを提示します。カートリッジは5つの相互接続されたチャンバーと制御可能なバルブで構成されており、遠心分離中に密度勾配培地や血液層の精密な取り扱いを可能にします。既に検証済みの濃縮プラットフォームに基づき、現在のワークフローはハイドロゲルベースの細胞固定化と多重免疫細胞化学を統合し、CTCやcCAFを含む複数のCRCサブタイプの下流の同定と特徴付けを支援しています。分離後、細胞はハイドロゲルマトリックス内に固定され、繰り返しの免疫染色および画像診断による分析中の細胞保持をサポートします。このワークフローを用いて、同じサンプルからCTCとcCAFの両方を同定し、単一の液体生検ワークフロー内で複数の循環中の希少細胞集団を統合分析する可能性を示しました。このプラットフォームは、液体生検応用における下流の希少細胞特性解析において実用的かつ再現性の高いアプローチを提供します。

概要

循環希少細胞(CRC)とは、赤血球、白血球、血小板などの正常な血液成分に比べて、血流中に非常に低い頻度で存在する細胞を指します。CRCは生物学的プロセスの副産物、組織の再形成、創傷治癒、血管損傷など多様な原因から発生します。代表的な例としては、循環する内皮細胞、循環する胎児細胞、メガ核細胞、赤血球芽細胞、そして様々な前駆細胞や^幹細胞が挙げられます^1,2。CRCの存在だけで必ずしも病理的状態を反映するわけではありませんが、数値の上昇はしばしば異常な生理学的または病理的状態を示すことを示します^3,4。したがって、CRCの敏感な検出と特徴付けは、体内で起こる動的な生理学的および病理学的プロセスに関する貴重な洞察を提供します。

CRCサブタイプの中では、循環腫瘍細胞(CTCs)と循環がん関連線維芽細胞(cCAFs)ががんの主要なバイオマーカーです。CTCは腫瘍細胞の拡散を直接的に示し、広く研究^{されています。}CTCの列挙の変化は、^{治療反応の}早期発見、予後、モニタリングとしばしば関連しています。同時に、cCAFは血流に排出される間質成分を表し、腫瘍微小環境の相互作用や転移前^ニッチ7の形成を反映しています。しかし、CTCと比べてcCAFsの研究は限られており、その臨床的有用性はまだ探求が始まった^{ばかりです。}

CTCおよびcCAFは、CTCが腫瘍細胞の伝播や転移的形質を反映するのに対し、cCAFは間質の再構築や腫瘍微小環境に関連する進行シグナルを表すため、液体生検において補完的な生物学的情報を提供する可能性があります。これら2つの循環する希少細胞集団の同時解析は、どちらかの集団だけを分析するよりも、がん進行のより統合的な理解を支持する可能性がある。しかし、末梢血における極めて稀な存在、cCAFsの普遍的に受け入れられたマーカーの不在、そして細胞亜集団間でのマーカー発現の著しい異質性により、臨床的および翻訳的有用性は大きく制限されており、これらが共に信頼できる同定を妨げています。したがって、濃縮および同定中の細胞損失を最小限に抑えることは、堅牢で信頼性の高い解析を確保するために不可欠です。さらに、CTCおよびcCAFの機能的およびマーカー多様性の包括的な特性評価は、転移における役割を明らかにし、臨床的に意味のあるバイオマーカーを開発するために不可欠です(^8,9)。

ここでは、cCAFsとCTCs10,11を同時に分離し、希少細胞のハイドロゲルカプセル化を用いたマルチマーカー同定を組み合わせた方法を提示^します。現在のCRC分離法は、多段階処理中の細胞損失、表現型異質細胞の捕捉制限、マーカー依存的な濃縮戦略に伴う選択バイアスなど、技術的な制約に直面していることが多いです。対照的に、本研究で用いられた連続遠心マイクロ流体プラットフォームは包括的な濃縮フレームワークに基づいており、従来の正選択マーカーへの依存を減らしています。基盤となるエンリッチメントプラットフォームの分析およびワークフローパフォーマンスは、我々の^{過去の研究}9で説明されています。

この検証済みプラットフォームを基に、本研究はヒドロゲルベースの細胞固定化と多重免疫細胞化学の統合に焦点を当て、CTCやcCAFを含む複数の循環希少細胞集団を統合したワークフロー内で包括的に単離・同定することを目指しています。濃縮、安定した細胞保持、繰り返し染色適合分析を組み合わせることで、このプロトコルは液体生検サンプルからの統合希少細胞解析のための実用的な枠組みを提供します。

プロトコル

患者および健康なドナーからのヒト血液サンプルを含むすべての処置は、セブランス病院の機関審査委員会(IRB)のガイドラインに従って実施されました。この研究プロトコルはセブランス病院の機関審査委員会(IRB No. 4-2013-0059)によって承認されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. デバイス準備

1. 電源スイッチを押して楽器を起動します。
2. レーザーインターロックスイッチを作動させてから、レーザー電源スイッチをオンにしてください。
3. オペレーティングソフトウェアを起動し、システムが正常に初期化されているか確認してください。
4. メインのソフトウェアインターフェースから 「デバイス操作 」を選択し、標準的なEDTA全血サンプルの プリセットプロトコル を選択します。

2. 装置の動作 -^第一段階

注:吸気口の位置とカートリッジ構造の詳細は 図1Aに示されています。

1. 入口6から、初期チャンバーに試薬A(密度勾配媒体)2 mLを加えます。
2. 入口8から、試薬Aを875μL空虚室に追加します。
3. カートリッジをディスクラックに取り付け、遠心分離のために適切なバランスを確保します。
4. CTCeptorの ドア ボタンを押してマウントを開け、ディスクラックをCTCeptorに取り付けて固定ネジで固定します。
5. ドアボタンを押してマウントを閉じ、CTCeptorソフトウェアでスピンダウンステップを実行します(約30秒)。
6. 試薬Aが初期チャンバーの下部に移されたことを確認したら、固定ネジを外し、カートリッジを装着したままディスクラックを機器から取り外します。

3. デバイス動作 - 第^{2ステップ}

1. 血液サンプルを扱う前に、すべての手順を認定された生物学的安全キャビネット内で行い、機関のバイオセーフティガイドラインに従い、手袋、白衣、目の保護具などの適切な個人用防護具を着用してください。
2. カートリッジを機器から取り出した状態で、最初のチャンバーに3mLの血液を6番口から注入します。
3. ディスクラックをCTCeptorに取り付け、固定ネジで固定します。
4. CTCeptorソフトウェアを使って赤血球除去ステップを実行してください(約40分)。この工程では、遠心分離でカートリッジ内の血漿、赤血球、末梢血単核細胞(PBMC)を分離し、PBMCを含む部分は次のチャンバーに移され、その後の白血球枯渇が行われます。
5. RBCの取り外しステップが完了したら、ディスクラックを楽器から取り外します。

4. 装置操作 - 第^{3ステップ}

1. 作業エリアを丁寧に消毒し、無菌性を保ちましょう。
2. 均一な懸濁を保証するために試薬B(白血球分離ビーズ)を渦巻かせます。
3. 洗浄バッファーは、Ca²⁺/Mgの²⁺フリーDPBSと0.1%BSAおよび2 mM EDTA(pH 7.4)を混合して準備します。
4. 試薬Bの希望容量を1.5 mLのチューブ(例:1カートリッジあたり50 μL)に移します。
5. 試薬Bの5倍の量で洗浄バッファーを加え、ピペットで優しく混ぜます。
6. チューブを磁気スタンドに1分間置き、試薬Bのビーズが集まるのを待ってから、上澄液を慎重に捨てます。
7. ビーズを洗浄バッファー内に初期ビーズの体積と同じくらいの体積で再懸浮させます。
8. ビーズは使用まで4°Cで保存してください。
9. 使用直前に、準備済みビーズ50 μLとDPBS50 μLを混ぜ、100 μLをインレット7に注入します。
10. ディスクラックをCTCeptorに取り付け、固定ネジで固定します。
11. CTCeptorソフトウェアを使って 白血球除去 ステップを実行します(約50分)。このプログラムされたステップでは、充填された白血球分離ビーズをPBMC含有分画と振動させてビーズ–白血球結合を促進し、その後遠心分離でビーズ結合した白血球分画を除去します。
12. 白血球除去の手順が終わったら、ディスクラックを器具から取り外します。

5. サンプル回収

1. 最終チャンバーの出口9にピペットチップを挿入し、内容物を再懸浮させた後、採取したサンプルを15mLチューブに移します。
2. 出口9に2 mLのDPBSを注入し、ピペッティングでチャンバーをよくすすぎ、同じ15 mLチューブに洗浄液を移します。
3. 洗う手順を2回繰り返します。
4. 15mLチューブ内の液体の体積をDPBSで14mLに調整し、チューブにキャップをして逆回転で優しく混ぜます。
5. 380 × g で遠心分離機で4分間室温で加熱します。
6. 上清液を慎重に除去し、約1 mLを残し、残りの懸濁液を下流分析に使います。

6. CRCの識別

1. プレハイドロゲルポリマーの製製には、Ca^2⁺/Mg^2⁺フリーDPBS、ハイドロゲルペリクル免疫サイトケミスト(HypICC)溶液A(プレポリマー)、フォトイニシエーターを80:20:1の比率で混合します。
2. CRC懸濁液870μLと270μLのプレハイドロゲルポリマーを混ぜます。
3. 混合液をHypICCチャンバーに移し、500×gで遠心分離機で5分間冷却し、細胞がプラットフォームに沈殿するのを待つ。
4. 厚さコントローラーをHypICCチャンバーに挿入してハイドロゲルの厚さを設定します。
5. 試料を底部から20〜30秒間紫外線(365 nm)照射し、ハイドロゲル層を架橋させます。
6. 厚さ調整装置を取り外し、ハイドロゲルで包まれた細胞をDPBSで3回洗浄します。
7. 細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で10分間固定し、その後サンプルをDPBSで3回、各10分洗浄します。
8. 0.05%のTriton X-100で室温で10分間細胞を透過させます。その後、サンプルをDPBSで3回、10分ずつ洗います。
9. サンプルを2%BSAで室温で1時間ブロックします。
10. 一次抗体とともに4°Cで一晩培養します。
11. サンプルはDPBSで5回、1回20分洗います。
12. 核をHoechstで室温で10分間染色し、その後DPBSで3回、各10分洗浄します。
13. 必要に応じて、一次抗体培養と同じ一晩の条件下で二次抗体培養を行うことも可能です。
14. 蛍光顕微鏡撮影を行い、CRCの同定を行います。

7. CRCの多重免疫染色

1. 免疫染色と画像診断の後、CRCはクエンチング後に追加の抗体染色を受けることがあります。
2. PBS中に4.5%のH₂O₂ および24 mM NaOHからなる焼光溶液を準備します。
3. HypICCチャンバーからDPBSを取り出し、焼入れ溶液を加えます。
4. 室温で白光の下で1時間、振って孵化させます。
5. 冷却液を交換し、同じ条件下でさらに1時間培養します。
6. サンプルはDPBSで4回、1回の洗濯で10分間洗います。
7. 2%BSAを使ってブロッキングステップから免疫染色の手順を再開します。

結果

図1A は希少細胞分離に使われる単一のカートリッジの画像を示しています。カートリッジは5つの個別のチャンバーで構成され、マイクロチャネルと液体の流れを調整する制御可能なバルブで接続されています。カートリッジの構造は以下の通りです:(1) 全血から分離された血漿を収集する血漿チャンバー;(2) 全血を血漿、赤血球、PBMC層に分離する初期チャンバー;(3) 分離されたPBMCを白血球分離ビーズと結合する混合室;(4) 白血球を除去する空虚室;(5) 濃縮希少細胞分画を採取するための最終チャンバー;(6) 全血を充填するための入口;(7) 白血球分離ビーズを導入するための入口;(8) 密度勾配媒体を導入するための入口;(9)濃縮細胞を回収するための排出口となる収集孔。

初期のチャンバーは、密度に基づく分離後の赤血球(RBC)汚染を防ぐために傾斜構造をとっています(図1B)。処理中、まず密度勾配培地を初...

ディスカッション

CRCはがん診断と予後の両方に価値を持つ重要なバイオマーカーです。しかし、臨床的有用性を高めるためには、表現型的に多様なCRC集団をより広く捉え、並行したマルチパラ^{メトリック特性評価}を支援することが重要です。さらに、腫瘍免疫学の分野で増え続ける証拠は、免疫要素や腫瘍微小環境が治療反応の形成において重要な役割を果たしていることを示しており、腫瘍細胞中心情報だけにとどまらない必要性を浮き彫りにしています¹⁴。これらの考慮事項が、がんの進行や治療反応に関連する複雑な細胞相互作用をよりよく反映する統合的なCRC解析ワークフローの開発を支えています。

CRC分離アプローチは、単一のターゲット集団に最適化されているか、単一のワークフロー内で複数の循環希少細胞サブタイプの統合解析に容易に構成されていないことが多いです。本研究で使用された連続遠心マイクロ流体濃縮プラットフォームは、これまでに希少細胞の自動濃縮性能で検証されています。この...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	ディスクカートリッジ
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	ディスクラック
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	密度勾配培地
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	白血球分離ビーズ
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICCチャンバー
ラテックス手袋	Ansell	93743080
マグネットスタンド			3Dプリンターを使用して自社製造
マニュアルピペッティング  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
マニュアルピペッティング  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
マニュアルピペッティング  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
マニュアルピペッティング  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
マニュアルピペッティング  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pansitokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS（リン酸緩衝生理食塩水）	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
チップ、10 µL	TipOne	9104020333
チップ、1250 µL	TipOne	9104020740
チップ、200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			EDTAで採取し、4-8 °Cで保管
β actin antibody	abcam	ab8226