単細胞および免疫蛍光解析のために雌マウス尿道上皮を単離する最適化方法

サマリー

本プロトコルは、成マウス雌マウス尿道の上皮内膜を単離し、フローサイトメトリー、免疫染色、オルガノイド培養などの下流解析のための最適化方法を提示します。これらの手法により、フローサイトメトリー解析、全額イメージング、効率的なオルガノイド形成により、濃縮され生存可能な尿道上皮細胞が得られました。

要約

尿道は上皮細胞で覆われており、尿が体から流出する導管として機能します。尿道の上皮内膜は、抗菌および免疫防御の役割を示す遺伝子シグネチャーを持つ異なる細胞タイプで構成されています。尿道上皮層に埋め込まれた常住マクロファージは、免疫監視や抗原提示に関与するとされる転写的に異なるサブタイプを表します。尿路病原体は尿道を上って膀胱に到達します。尿道上皮の粘膜および関連する免疫細胞の研究により、下部尿路における宿主の防御機構が明らかになります。このプロトコルの中心的な目標は、メスのマウス尿道を解剖し、上皮内膜を分離して下流解析を行う最適化方法を提供することです。このプロトコルは、優しい酵素的および機械的分離によってメスのマウス尿道から上皮組織を分離する最適化された方法を記述しています。上皮分離後、孤立尿道上皮および関連する免疫細胞を穏やかに酵素的に消化し、高生存率の単一細胞懸濁を得る方法を記述します。また、このプロトコルは、単離マウスの尿道上皮細胞および上皮関連免疫細胞のフローサイトメトリー解析方法についても詳述しています。さらに、単離された上皮細胞から層別化された3D尿道上皮オルガノイドを生成する方法もここで示しています。また、尿道上皮シートの全額免疫染色の最適化方法も詳細に示しており、マウス尿道上皮および関連する免疫細胞の形態や分子構造を観察するために用いられます。全体として、ここで述べたマウス尿道上皮細胞の単離および単細胞消化法は、免疫染色、フローサイトメトリー、オルガノイド生成、単細胞RNAシーケンスなどの下流解析を可能にします。

概要

マウス下部尿路(LUT)は、膀胱と尿道の2つの部分から成り立っています。胚期には、LUTの構造が尾後腸に位置する一時的な内胚葉由来の構造である総肛門(cloaca)から発達します。肛門肛の腹側部分である尿生殖洞は、膀胱の前方を、尿道を後方に形成^します。膀胱の内膜はよく研究されています。尿素素はウロプラキンタンパク質^2,3,4からなる頂端結晶プラークを通じて尿成分に対して厳重なバリアを形成します。膀胱の内膜は移行上皮ですが、尿道は膀胱の首から遠位尿道口までの上皮構造に違いを示します。さらに、尿道は上皮構造や細胞構造において性的二形性を示します。オスのマウス尿道は、膀胱頸部の遷移上皮からなり、その後に柱状および層状上皮が続きます。メスのマウス尿道は膀胱首の移行上皮と、遠^位端に向かう分泌腺に終わる小さな管が点在する多層の非扁平上皮で覆われています。

女性は主に腸から尿道を経て膀胱に感染する尿路感染症(UTI)にかかりやすい^です。尿道はLUT内で最初に上昇する尿路病原体に接触する表面です。尿道上皮細胞の機能、特に能動的な免疫学的障壁としての役割については、十分に研究されていません。同じグループの最近の研究では、成虫メスの尿道⁵の単一細胞分解能空間マップが提供されました。基底、中間、頂端細胞からなる三重層の尿道内壁が確認されました。上皮内膜には希少な神経内^{分泌細胞が}散在しています^5,7。尿道の中央付近で、小さな管が主幹から分岐し、泌尿腺の群れを形成し、尿道の間質区画に埋め込まれています。トランスクリプトミクスデータにより、尿道の上皮細胞は宿主防御を形成する免疫調節および抗菌遺伝子を発現していることが明らか^{になりました5。}尿道上皮細胞の防御能力や免疫調節機能に関連する特性や特性を研究することで、尿路感染症と戦うための新しい戦略が生まれる可能性があります。

マウスを用いて尿道上皮を研究することで、時間的な研究や性的二形性の調査が可能になります。膀胱と尿道の細胞構造が人間と似ていること^{から、マウス}は下部尿路^1,8,9の胚発生の研究に広く用いられています。マウスは尿道内滴モデルでも用いられ、尿路病原体による尿路感染症の研究に用いられています 10,11,12。 下部尿路組織は、がんやその他の疾患のために切除手術を受けない限り、患者でアクセスが困難です。一貫した健康なヒト組織の供給源へのアクセスは困難であり、マウスは組織の恒常性、修復、炎症性損傷への反応研究のための下部尿路組織の研究に有用なモデルを提供します。メスのマウスと人間の尿道内膜は、膀胱頸部の遷移上皮と、遠位端に向かう非扁平上皮・非角質化の層状上皮で構成されています。扁平上皮はヒト女性尿道の遠位端に観察されますが、^5歳から13歳の年齢でヒト女性尿道内膜に変動が見られます。ヒトとマウスの尿道のトランスクリプトームレベルでの尿道内膜の比較はまだ行われていませんが、マウスは上皮のパターン形成、上皮-免疫相互作用、尿道感染への応答を捉える有用なモデルです。

本研究では、全長の成体メスマウス尿道の解離方法、尿道上皮の分離、そして単細胞懸浮液の準備のための穏やかな酵素的消化方法を説明しています。これはメスのマウス尿道上皮組織の分離と消化に関する初の詳細なプロトコルです。最適化されたプロトコルにより、上皮細胞の濃縮集団が得られ、さまざまな下流解析に利用可能です。研究で示されたように、著者らは尿道上皮細胞分離株の単一細胞懸濁液に対してフローサイトメトリーを実施しており、主に上皮性の生存可能な単一細胞の存在を示しています。さらに、これらの上皮細胞は3次元培養中に、層状マウス尿道内膜に似たオルガノイドを生成することができます。著者らはまた、尿道上皮シートの全マウント染色を実証し、上皮関連免疫細胞、特にマクロファージと尿道上皮細胞の関連を研究しています。本論文で述べた方法は、尿道内膜とその免疫防御における役割の研究に役立ちます。

プロトコル

マウスに関するすべての研究は、BRIC幹細胞科学・再生医学研究所(バンガロール)の機関動物倫理委員会(INS-IAE 2022/01(R 1 M2))および機関的バイオセーフティ委員会(inStem/G-141(3)-22/DBJ)の承認を得て実施されました。本研究には、国立生物科学センター(NCBS)、バンガロール生命科学クラスター(BLiSC)動物ケア資源センター(ACRC)に所属する6〜12週齢の雌のCD-1またはC57BL6/Jマウスが使用されました。マウスは、12時間の明暗サイクルの下、特定の病原体のない環境に飼育され、自由に餌と水を得ました。

使用されるすべての材料は 材料表に記載されています。

1. 成虫メスの尿道の解離および採取

1. ネズミが呼吸を止めるまで_CO2 を使って安楽死させてください。二次安楽死の一環として子宮頸部脱臼を行うこと。
2. マウスを仰向けにし、腹部の毛を湿らせるために70%のエタノールをスプレーします(図1A)。
3. 鉗子で腹部の皮膚を持ち上げ、下半身に向かって垂直に切開し、外尿道口で終わらせます(図1B および 1C)。
4. 膀胱を特定し、鉗子で優しく持ち上げます。場合によっては尿で満たされていることもあります。鉗子の間で膀胱を優しく圧迫して空にします。
   注意:膀胱は膨らんだ構造として見えます。
5. 小さなスプリングハサミで膀胱の脂肪と結合組織をトリミングし、恥骨結合部で2つの恥骨骨が合流する蝶状の構造を露出させます(図1D)。尿道は恥骨結合の下を通っています。
6. 恥骨結合を鉗子で持ち上げ、小さなバネハサミで切り開いて切開します(図1E)。恥骨の断片を取り除き、尿道が膀胱から下に流れているのが見えるようにします(図1F)。
   注:尿道は膣壁の腹面に細い赤い管状に見えます(図1G)。
7. 細かい鉗子を使って膀胱を体腔から優しく引き上げ、尿道と膣壁の間に小さなバネハサミを通して尿路と生殖管を分けます。
8. 尿道の奥に沿って切断し、膣壁から膀胱を切り離す際に膀胱にわずかなテンションをかけてください(図1H–J)。遠位尿道口まで切り込むと、全長のマウス尿道(長さ1.2〜1.5 cm)(図1K および1L)が得られます。
9. 膀胱の首に一つだけ切開して尿道と膀胱を切り離します。

2. 尿道上皮組織の単離

注:尿道から上皮シートを分離するプロトコルは、子宮内膜上皮¹⁴を分離するためのプロトコルから修正・最適化されました。 図2 は、周囲の間質区画から尿道上皮層を分離する手順を示しています(図2A)。

1. 解離した尿道を、新鮮なハンクスバランスソルト溶液1個(HBSS、Ca、Mgフリー、補 足表1に詳細記載)を入れた無菌ペトリ皿に移します。
   注:この段階では上皮分離と単細胞消化のために4〜5個の尿道をまとめることが推奨されます。
2. 解剖顕微鏡の下で、細かいピンセットと小さなスプリングハサミを使って尿道周囲の脂肪や結合組織を切除します(図2B)。
3. 各尿道を横向きに等大きさの2つに切り分け、100ミクロンのナイロンメッシュストレーナーの上に置きます(図2C–G)。
4. 組織を洗うには、1mLのHBSS(カリウムおよびMgフリー)を1mL塗って洗い流します。
5. 組織片を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブ(MCT)(図2H)に移し、1%トリプシン(1%トリプシン、1×1xsHBSSa、詳細は 補足表2参照)を含みます。
6. 4°Cでサンプルローテーター(30rpm)で15〜30分間培養して組織を消化します。
7. 孵化後、4°Cからチューブを除去します。 MgCl₂ (1 M MgCl₂、1x HBSSで調製)を最終濃度10 mMに加え、DNase I(10 mg/mL DNase I、1x PBSで調製)を組織片と共に10 μg/mLの最終濃度で加えます。
8. チューブをサンプルローターの37°Cハイブリダイゼーションオーブンに移し、15〜30分間培養します。
   注:トリプシンの4°Cおよび37°Cでの培養時間は、下流の適用状況に応じて調整可能です。全植株染色には15分の培養時間、単細胞分解には30分の培養が望ましいです。
9. 組織を10%の羊血清を含む1.5mLのMCTに移し、1xのHBSS(CaおよびMgフリー)でトリプシン活性を抑制します。
10. 尿道組織を氷のように冷たい1倍のHBSS(CaおよびMgフリー)を含む新しいチューブに移します。その後、氷冷の1回HBSSを入れた無菌ペトリ皿に移します。
11. 2本の細かい鉗子を使って尿道から上皮を絞り出します。尿道片の片側を鉗子1組で押さえます。
12. もう一方の手では、鉗子の爪で尿道の部分を挟み、全長に沿って上皮を絞り出します。この方法を皿内の残りの尿道断片についても繰り返し、上皮を分離します(図2I–J)。
    注:機械的分離時に、尿道腔から透明な上皮組織の薄い層が押し出されます。尿道上皮は、間質組織よりも色が薄く透明に見える薄いシート状の組織断片として識別できます。上皮分離物は薄く透明な組織片で、ペトリ皿に移してミンチにすることができます。組織分離株は完全に分解されるべきではありません。組織断片が完全に分解されれば、トリプシンの潜伏期間を短縮できます。

3. 消化から単細胞懸濁への移行

1. 小さなプラスチック製転移ピペットまたは200μLピペットチップを使って、分離した上皮片を無菌ペトリ皿に移送します。上皮を小さなスプリングハサミで、1×HBSSを直接かけて小さな断片に刻みます(図2K)。
   注:上皮分離後に残った間質組織は、分離された上皮と同じ方法で消化できます。
2. みじん切り片をピペットで2mLのMCTに移し、1.5mLの予温(37°C)アキュターゼ消化液を含みます。アキュターゼ消化液には以下の成分が含まれています:アキュターゼ、10 μM Rocki Y-27632、および100 μg/mL DNase I。
3. 組織と消化液を含むチューブを37°Cのハイブリッドダイゼーションオーブンのサンプルローターに移します。1時間潜伏させてください。
   注意:チューブ内の内容物は消化が良好かどうか確認してから進むことがあります。消化の成功:挽いた組織はアキュターゼ溶液中によく分散し、培養後はわずかに見える部分のみです。消化失敗:アキュターゼ溶液で培養後も大きな組織片が残っています。組織は消化を成功させるためにできるだけ細かく刻まれる必要があります。
4. 1時間後に2 mL MCTの全内容物を5 mL遠心分離機チューブに移し、2 mLの洗浄バッファー(CaとMgなしのPBS1個、牛血清アルブミン1%)を加えます。
5. 4°Cの遠心分離機で、スイングバケットローターでサスペンションを600 x g で5分間回転させます。
6. 上清液を優しい真空で吸引し、1mLの洗浄バッファーに1mLの洗浄バッファーに再懸浮させ、フィルターチップ付きのピペットで再懸浮させます。
7. ピペットの先端を使って、ペレットを上下にピペットで粉砕し、塊が小さくなるまで続けます。懸流液を23 1/2ゲージの針に4 ストロークで1 mLの注射器に通し、その後26 1/2ゲージの針を1 mLの注射器に4〜6回刺します。
   注意:均一な単一セル懸液を得て細胞の凝集を防ぐためには、小ゲージの針を通す必要があります。この工程はせん断応力や細胞死を引き起こすことがありますが、著者らは針と注射器の打撃回数を最適化し、過剰な細胞死を起こさずに単一の懸濁液を提供しています。このステップを省略すると、細胞が大量に塊化し、単細胞RNAシーケンスやフローサイトメトリーなどの後続解析に混乱が生じます。
8. 30ミクロンの前分離フィルターを5mLチューブの上に置き、表面を湿らせるために1mLのウォッシュバッファーを加えます。26 1/2ゲージの針に接続された注射器を使って、1mLの細胞溶液をストレーナーに移します。
9. 細胞を含むチューブに1mLの追加洗浄バッファーを加え、注射器でこの溶液を取り出してフィルターに通します。セルは600 x g で4°Cのスイングバケットローターを用いて5分間遠心分離します。
10. 上澄液を吸引し、ペレットを100μLの洗浄バッファーに再懸浮させ、100μLの赤血球(RBC)溶解バッファー100mlを加えます。懸濁液を室温で正確に3分間孵育し、その後4mLのウォッシュバッファーを加えてペレットを再懸浮させます。
    注:尿道上皮細胞懸濁から血球を除去するために、赤血球溶解が推奨されます。このステップは上皮細胞の生存率にわずかな影響を与えるかもしれませんが、プロトコルでは0.5倍希釈された赤血球溶解バッファーと3分間のインキュベーションを用いて細胞損失を最小限に抑え、生存率を維持しました。
11. スイングバケットローターを使い、600 x g で4°Cで5分間遠心分離して細胞を収穫します。
12. 上清液を吸引し、ペレットサイズに応じて50〜200μLのウォッシュバッファーに再懸浮させます。
    注:4〜5個のマウス尿道上皮サンプルから得られた組織のペレットサイズは小さいものの、目で確認できます。遠心分離機セルでは、スイングバケットローターを用いて、ペレットがチューブの側面に塗り付くのではなく、底部に集まることが不可欠です。研究者たちはマウス尿道上皮あたり28,000〜34,000個の生細胞の収量を記録しています。
13. 細胞5μLのアリコートを0.5 mL MCTに移し、トリパンブルー5 μLを加えます。混合して血液細胞計を装填し、収量と細胞の生存率をチェックします。

4. 尿道上皮単細胞分離株のフローサイトメトリー解析

1. 5 mL遠心分離機管内に合計100,000個の細胞を抽出し、尿道上皮または間質区画から単細胞の蛍光免疫染色を行い、フローサイトメトリーを行います。チューブ内の容量を4mLに1倍PBSで補ってください。
   注:フローサイトメトリーで信頼性の高い結果を得るためには、1サンプルあたり最低50,000個の細胞が推奨されます。
2. スイングバケットローターを使ってセル懸浮液を500 x g で4°Cで5分間回転させます。
3. 上清液を捨て、ペレットを1xPBSの50μLに再懸濁します。
4. 細胞懸濁液に2倍ゴースト染料Violet 450(1μLのゴースト染料1倍)を50μL加え、1倍のGhost染料溶液を100μL得ます。
   注:ゴーストダイV450はアミン反応性の生存性染料であり、フローサイトメトリーの応用において生存可能な細胞と非生存細胞を識別するために使用できます。
5. 細胞懸濁液100μLあたり、5μLのFc受容体遮断液(抗マウスCD16/32)を加え、室温で5分間培養します。
   注:この工程は免疫グロブリンとFc受容体の結合を阻害するために必要です。
6. 細胞懸濁液を氷の上でさらに25分間孵育させます。
7. 細胞の懸濁液を5mLに希釈し、細胞染色バッファー(1x PBS、0.02%(w/v)アジドナトリウム、1%(w/v)BSA、 補足表3参照)を使用します。スイングバケットローターを使って500 x g で4°Cの温度で5分間回転させます。上清液を廃棄し、細胞ペレットを100μLの染色バッファーに再懸浮させます。
   注意:アジドナトリウムは非常に有毒です。皮膚や目、服との接触は避けてください。取り扱い時には適切な個人用防護具(PPE)を着用してください。
8. 細胞懸濁液100μL中に、1:20の希釈で5μLの共役一次抗体(抗CD326/EPCAM(上皮細胞を標識)、抗F4/80(マウスマクロファージを標識)、抗CD45(汎免疫マーカー)を加えます。細胞懸濁液を氷の上で30分間孵育させます。
9. 細胞の懸存液を5mLに希釈し、スイングバケットローターを使って4°Cで5分間スピンダウンします。 上清液を吸引し、細胞ペレットを500μLの細胞染色バッファーに再懸浮させます。
10. セルの懸流液を35ミクロンのナイロンメッシュストレーナーでフィルターキャップの仕分け管に通して移します。さらなる分析が行われるまで、チューブを氷の上に置いてください。
11. 細胞計の初期セットアップと性能チェックを行います。
12. 染色されていないサンプルと完全に染色されたサンプルを使って電圧を調整します。ビーズコントロールで補償を行い、取得に進みます。
    注:複数の蛍光分子を用いた実験は補償が必要です。必要な補償策を準備しましょう。実験で使用される各蛍光団に対して、単一染色対照群(すなわち補正ビーズ)が必要です。補正はフローサイトメーターのソフトウェア設定に応じて自動的に実施されます。FMO(蛍光マイナス1)コントロールは、特定の蛍光色素の正性細胞群と負性細胞群を区別するために推奨されます。FMO(FMO)は、制御対象の蛍光体を除くすべての蛍光体をサンプルに含めて準備します。
13. FMO(蛍光マイナス1)制御でゲートを調整し、1サンプルあたり50,000イベントを取得できます。

5. 尿道上皮オルガノイドの培養

注意:マウスの尿道上皮オルガノイドについては、プロトコル3節「消化から単細胞懸濁への移行」ステップ3.1から3.11に従ってください。単一セル懸濁液を得るために。

1. 尿道上皮細胞のペレットを50–100μLのオルガノイド拡張培地に再懸浮させます(詳細 は補足表4に記載)。ヘモサイトメーターで細胞の生存率と細胞数を測定します。
2. 細胞懸濁液(1部)とカルトレックス(4部)を1:4の割合で混合し、最終濃度5000細胞を25μLに置きます。12ウェルプレートの各ウェルに25μL細胞懸濁液(5000セル/液滴)の液滴を3滴加えます。
   注意:Cultrexは必ずカットオフチップで優しくピペットで使い、泡が出ないようにしてください。
3. プレートを37°C(5%_CO2)のインキュベーターに移して15分間、滴を固めます。
4. 滴の上に800μLのオルガノイド膨張媒体をウェルの側面から優しく重ねて、プレートをインキュベーターに戻します。
   注意:メディアの交換は2日ごとに必要です。使用済み培地を800μLの新鮮オルガノイド膨張培地に置き換えます。
5. 0日目から6日目までの毎日、逆立顕微鏡を4倍から20倍の倍率で撮影します。

6. 尿道オルガノイド組織学および免疫染色

注意:キシレンは非常に可燃性の溶媒です。化学物質を処理する際には適切なPPEを着用してください。使用済みのキシレンを有機溶媒廃棄物として回収します。承認された有害化学廃棄物プログラムを通じて処分してください。ホルマリンは有毒で、皮膚、目、呼吸器の刺激を引き起こします。皮膚への接触や吸入は避けてください。化学物質を処理する際には適切なPPEを着用してください。機関の有害化学廃棄物処理システムを通じて処分してください。パラフィンブロックに尿道オルガノイドを埋め込むプロトコルは、子宮内膜オルガノイド埋め込みプロトコルから修正・最適化^{されました。}

1. オルガノイド培養6日目には、使用済みの培地を廃棄し、室温で1倍HBSSでオルガノイドを洗浄します。中性緩衝ホルマリン1.5mL(10%)をウェルに15分間加えます。
2. 固定剤を捨て、1.5mLのヘマトキシリンをウェルに10分間加えます。ステインは捨てて、1xHBSSで2回洗います。
3. 各井戸に1xHBSSで作った2%のUltraPure低融点アガロースを1mL加え、3滴を含む各ウェルに加え、室温で15分間固化させます。
4. 細いヘラの平らな端でアガロースを井戸から優しく取り出し、カルトレックスの滴が一緒に落ちるようにします。
5. アガロースディスクをティッシュカセットに移し、70%エタノールで室温で30分間、絶えず攪拌しながら脱水します。
6. さらに、異なる濃度と期間の脱水:90%エタノール30分、100%エタノール30分、100%エタノール60分、100%エタノール90分。
7. 余分なエタノールを除去し、キシレンで45分間室温で常に攪拌しながら洗い流します。キシレンの除去工程を60分間繰り返します。
8. 余分なキシレンを除去し、浸透性パラフィンワックス(65°C)に一晩移します。
9. 金属埋め込み型の底に薄く埋め込みワックスを塗り、その上にアガロースディスクを置きます。スライドウォーマーから型を取り出し、カセット底のスラットに埋め込みワックスを素早く重ねます。室温で固化させます。
10. オルガノイドパラフィンブロックをミクロトームで切断し、5μmの切片を得る。正に帯電したスライドにセクションを配置します。
11. ヘマトキシリン・イオシン染色
    1. 60°Cでスライドを焼き、キシレンで脱脂し、エタノール洗浄(キシレン1分、100%エタノール1分、95%エタノール1分、75%エタノール1分)で再水和させます。
    2. スライドを水道水で洗い、ギルのヘマトキシリンNo.2で3分間培養します。水道水の流れの下にスライドを置いて青色を出します。
    3. 95%エタノールに1分間スライドさせ、その後0.25%エオシン溶液を1分間浸します。水道水でスライドを洗い、水が透明になるまで洗います。
    4. スライドを脱水(95%エタノール1分、100%エタノール1分)し、キシレンで透明化(1分)した後、速硬化メディウムでマウントします。
12. パラフィン切片の免疫染色
    1. 5μmのパラフィン断片をハイブリダイゼーションオーブンで60°Cで1〜2時間焼きます。
    2. 脱ワックスはスライドステインジャーでキシレンに6分間浸してスライドします。
    3. 蒸留水で100%、95%、75%エタノールをそれぞれ6分間再水和します。その後、スライドを蒸留水で5分間洗います。
    4. 0.01Mのクエン酸(蒸留水)抗原回収液を入れた四角いパイレックス皿にスライドを加え、ラップで包みます。抗原回収は高出力で20分間電子レンジで加熱します。
    5. 冷めてぬるま湯に20分浸し、PBSでスライドを5分間すすぎます。組織切片の周囲に疎水性バリアを描き、室温で1時間間、穏やかに揺らしながら100μL/断片の馬用ブロッキングバッファーを加えます(馬用ブロッキングバッファーの準備については 補足表5 を参照)。
    6. 一次抗体溶液を適切な希釈(1:100–1:200)で添加して馬ブロッキングバッファーに一次抗体溶液を準備します。各セクションに100μLの一次抗体溶液を加えます。スライドは4°Cで一晩ゆっくりと抱卵し、優しく揺らします。
       注:オルガノイドは、Keratin 5/KRT5(基底上皮マーカー)、P63(基底上皮マーカー)、KRT4(中間/上基底上皮マーカー)、およびKRT13(中間/上基底上皮マーカー)に対する抗体で免疫染色されました。
    7. 一晩の孵化後、洗濯はPBSで4×5分、室温で優しく揺らしながらスライドします。
       注意:以降のすべての手順は、室温の光に遮られた箱内で行うべきです。
    8. ホースブロッキングバッファーに二次抗体溶液を準備し、1:500の希釈で蛍光標識付き二次抗体を加えます。スライドは室温で1時間ゆっくり抱え、優しく揺らします。
    9. PBSで4回5分、室温で優しく揺らしながらスライドします。
       注意:任意のステップ:オート蛍光消光キットを使用して自動蛍光信号を消し去ってください。
    10. 300 nM DAPI溶液で5分間、優しく揺らしながらキュベートします。PBSで室温で2回5分、優しく揺らしながら洗います。
    11. フェード防止マウンティング液(90%グリセロール、0.2% N-プロピルガレート、1x PBS)でマウントします。広視野蛍光顕微鏡での画像断片。
        注意:各蛍光分子のカメラ露出設定は、ピクセル飽和を避けつつ信号対雑音比を最大化するよう調整する必要があります。同じ露出設定を使い、染色されたオルガノイドを撮影する際も同じです。

7. 分離尿道上皮シートの全量免疫染色

注:全額免疫染色については、プロトコル第2節「尿道上皮組織の分離」ステップ2.1から2.12に従ってください。尿道上皮シートを入手するために。

1. 上皮組織を移送ピペットまたは200μLピペットチップを用いて、10%中性バッファーホルマリン500μLを含む24ウェル組織培養皿のウェルに慎重に移します。プレートの蓋をパラフィンで密封し、4°Cでロッカーの上で20分間孵化します。
   注意:上皮組織の喪失を避けるため、すべての工程は同じ井戸内で行ってください。
2. 井戸からホルマリンを慎重に吸引してください。1xPBSを500μLで洗浄し、室温のロッカーで5分間培養します。同じ洗浄工程をもう一度繰り返します。
3. 井戸に1xPBS+1%トリトンX-100を含む500μLの透過化溶液を加えます。プレートの蓋をパラフィルムで密封し、4°Cで2時間ゆっくり揺らしながら培養します。
4. 井戸から透過化溶液を慎重に吸引してください。
5. ブロッキングを行うために、500μLの馬用ブロッキングバッファーに1%を追加で1%のトリトンX-100を含んで組織を培養します(ホースブロッキングバッファーのレシピは 補足表5に記載されています)。皿の蓋をパラフィルムで密封し、4°Cで一晩ゆっくり揺らしながら孵化させます。
6. 一次抗体溶液を適切な希釈(1:100–1:200)で添加し、1%トリトンX-100を追加した馬用ブロッキングバッファーに一次抗体溶液を準備します。遮断液を吸引し、500μLの一次抗体溶液(抗CDH1(上皮細胞マーカー)および抗F4/80(マウスマクロファージマーカー)を加えます。蓋をパラフィルムで密封し、4°Cで48〜72時間、優しく揺らしながら孵化させます。
7. 一次抗体溶液を慎重に吸引し、室温で30分間ずつPBS1回で3回洗い、優しく揺らします。
8. 適切な希釈(1:500)で二次抗体を加え、追加の1%トリトンX-100を加えて馬用ブロッキングバッファーに二次抗体溶液を準備します。
9. ウェルに二次抗体溶液500μLを加え、プレートをアルミホイルで覆い、室温のロッカーの上で4〜6時間培養します。
10. 二次抗体溶液を慎重に吸引し、室温でPBS1回、各30分ずつ3回洗います。
    注:DAPI染色は、希釈したDAPIストック溶液(最終濃度300 nM)で室温で10分間培養することで実施可能です。ロッカーの上で室温のPBS1回(5分2回)でティッシュを洗います。
11. 上皮組織を慎重にガラススライドまたはイメージングダイヤに移し、フェード防止マウンティング液(90%グリセロール、0.2%n-プロピルガレート1x PBS)を加えます。
12. 蛍光顕微鏡でのイメージ組織。
    注:試料の厚さを考慮し、著者らは光学切断可能な蛍光顕微鏡でのイメージングを推奨しています。本研究では、著者らはアポトーム光学断面を持つ広視野蛍光顕微鏡を用いてピントの合わない光を除去し、zスタックを獲得しました。上皮細胞関連マクロファージの樹状突起を可視化するために画像Zスタックを取得しました。

結果

成虫メスの尿道の解剖と採取

本研究の前半では、メスのマウス尿道の解離に関する詳細なプロトコルを提供しています。腹側膣壁に付着し、恥骨結合の下に位置していることから、ここで提供された方法は全長女性尿道のきれいな解離を可能にします(図1)。

尿道上皮組織の単離および単細胞分離株のフローサイトメトリー解析

トリプシンの消化により、尿道の上皮内膜が周囲の間質から容易に分離されます。分離後、間質組織よりも透明度の高い上皮シートが観察されます(図2)。分離された上皮層は酵素分解時に単細胞懸濁液を生み出しました。尿道上皮から分離された単一細胞は、ヘモサイトメーターによるトリパンブルー排除(図2L)および生存性染料を用いた流動サイトメトリーによる一貫して高い生存率(>80%)を示します(図3、補足ファイル1)。

著者らは尿道上皮の単一細胞懸濁による上皮細胞濃縮を評価するためにフローサイトメトリーを実施しました。細胞の生存可能性を調べるために、細胞懸濁液はアミン反応性ゴースト染料V450という生死マーカーで染色されました。著者らは、生死マーカーで細胞生存率が>80%と一貫して観察されました。ライブ/デッドマーカーにより、流量解析時にデブリやデッドセルのゲートを排除することが可能になりました。彼らは、上皮細胞マーカー(CD326/EPCAM)、マクロファージマーカー(F4/80)、免疫細胞マーカー(CD45)でサンプルを染色し、この方法で分離された細胞の組成を記録しました。フローサイトメトリーの結果、著者らはメスのマウス尿道上皮から濃縮された上皮細胞群を単離したことが示されました。独立した実験の両方で、グループは生細胞にゲーティングした後、EPCAM陽性上皮細胞の80〜90%を達成しました。著者らはまた、上皮製剤中のCD45+免疫細胞の~1.30%を観察しました。上皮内膜に関連するマクロファージは、上皮区画からの生細胞の約1.18%を占めていました。上皮シートからの単細胞懸濁液のフローサイトメトリー解析では、間質汚染は最小限(5–6%)であり、これは主に血管内皮に起因するとされる前の研究で示されています⁵。 補足ファイル1 は、上皮および間質区画からの単細胞調製物のフローサイトメトリー結果を示しています。上皮区画から分離された上皮細胞の80〜90%の濃縮と比較して、間質区画では尿道腔から周囲の間質に伸びる短管および腺上皮からなる上皮細胞の40〜50%も含まれていました(図3、補足ファイル1)。

尿道上皮オルガノイドの培養、組織学、免疫染色

著者らはまた、尿道から単離された単一の上皮細胞が生存可能であり、3次元マトリックス内でオルガノイドを形成できることを示し、培養中6日目までの単一尿道上皮細胞からのオルガノイド成長も観察されました(図4B–G)。彼らはヘマトキシリン・エオシン染色(H&E)を行い、オルガノイドの組織学を観察しました(図4H–J)。著者らは尿道上皮オルガノイドの2つの異なる形態を観察しました。1つは大きく中空、もう1つは小さくて固体です。いずれの場合も、オルガノイドは層別化され、女性尿道の上皮内膜で発現したマーカーが再現され、基底層を示すKRT5およびP63、基底層/中間細胞層を示すKRT4およびKRT13が含まれます(図4K–N、 補足図1)。近位尿道と遠位尿道間のオルガノイド形成能力の違いが調査されました。近位尿道から生成されたオルガノイドは中空オルガノイドの割合が高く、遠位尿道から生じたオルガノイドは固体球状の球体を形成しました(図4O–P)。さらに、尿道の近位部と遠位部から分離された上皮細胞におけるオルガノイド形成効率の違いも観察されました。遠位尿道上皮は、近位尿道上皮よりも高い効率でオルガノイドを形成し、初期種子密度(5000細胞/滴)で達成されました(図4Q–S)。

分離尿道上皮シートの全マウント免疫染色

研究者たちはまた、メスのマウス尿道上皮シートの全額染色の最適化方法も提示しています。ここでは、上皮シートに2つのマーカーで染色しました:マクロファージ用のF4/80と、上皮細胞間接合部を示すE-カデリン/CDH1のマークです(図5)。組織は、Apotome 3光学断片を用いたZeiss Axio Observer 7顕微鏡を用いて画像化されました。上皮シートはCDH1抗体による強い標識を示します。F4/80抗体で標識された尿道上皮の全マウント製剤では、マクロファージが上皮内膜に樹状突起のアーバーを形成していることが示されました。マクロファージは尿道の上皮細胞間で樹状突起を送る様子が観察されました。全体として、ここで述べたプロトコルがメスのマウス尿道の上皮内膜の研究に有用であることが示されました。

図1:女性尿道採取のためのマウス解剖。 (A)ネズミを仰向けにし、腹部に70%のEtOHを噴霧します。(B–C)腹部を皮膚を持ち上げて垂直に切開します。(D) 脂肪と結合組織をトリミングし、(黒い矢印の)恥骨結合でつながる蝶状の恥骨を露出させる。(E) 恥骨結合を切断する。(F)恥骨を除去すると、尿道が膀胱から下へ流れている(黒い点線で囲まれています)。(G)鉗子でそっと膀胱を引き上げます。尿道は細い赤い管としてはっきりと見えます。(ハイ・アイ)膀胱を体腔から引き上げます。膀胱に張力をかけて尿道と腹側膣壁を分離します。尿道と膣壁の間にハサミを通して尿路と生殖器を分けてください。(J–K)尿道の遠位端を皮膚に接着して切り離してください。(左)解離されたメスの下部尿路(FLUT)の画像、膀胱と尿道が示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:尿道上皮の単離および単細胞懸濁液の準備。 (A) 尿道の上皮および間質区画の酵素的消化および機械的分離、そして単細胞消化を描いた概略図。(B) 女性の下部尿路の余分な脂肪を除去すること。(C–F)尿道を膀胱の首部から切り離し、尿道と膀胱を分離します。次に細いハサミで尿道を二つに切ります。(G) 尿道断片を1xHBSS溶液で洗浄し、100ミクロンのフィルターをかけます。(H) 尿道組織断片を1%のトリプシン溶液に移す。冷蔵室のサンプルローテーターでキュベートします。MgCl₂とDNase Iを同じチューブに加えます。サンプルローターのハイブリッドオーブンで37°Cで培養します。(I–J)尿道断片の長さに沿って細かい鉗子で優しく絞って上皮を分離します。(K) 組織を細かいハサミで小さな断片に刻む。挽いた上皮組織をアキュターゼ分解液に移し、サンプルローテーターのハイブリダイゼーションオーブンで37°Cで培養します。(L) 上皮細胞を数え、血液細胞計を用いたトリパンブルーを用いて生存可能性を評価します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:尿道上皮および間質区画からの単細胞懸濁を評価するフローサイトメトリー。 フローサイトメトリーは、マウス尿道(A)上皮および(B)間質区画の単細胞製剤で実施されました。生細胞はゴーストダイV450で染色された死細胞を排除するためにゲートが施されました。生細胞はCD45(汎免疫マーカー)、CD326/EPCAM(汎上皮マーカー)、F4/80(マウスマクロファージマーカー)の発現を評価しました。データは、5〜6匹のマウスプールで上皮および間質サンプルを生成するために実施された2つの独立した実験を代表しています。略語;SSC-A = 側散乱ピーク面積;FITC = フルオレセイン・イソチオシアネート;APC = アロフィコシアニン;PE = フィコエリスリン。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:尿道上皮オルガノイドの組織学および免疫染色。 (A) 尿道上皮オルガノイド生成のワークフローを示す回路図。(B–G)異なる試験官増殖日の単一細胞から生成された尿道上皮オルガノイド(UEO)の代表的な明視野顕微鏡写真。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色された(H)中空および(I)固形尿道上皮オルガノイド(UEO)の代表的な明視野画像。(J) 3つの独立した実験で生成されたオルガノイドタイプの定量化。誤差バーは平均の標準誤差を表します。(K)中空型および(L)固形尿道上皮オルガノイド(UEO)の代表画像で、上皮マーカーKRT13(基底上皮マーカー)、KRT5(基底上皮マーカー)、P63(基底上皮マーカー)で免疫染色されています。単一の蛍光チャンネルを描いた画像は、K'、K''、K'''、L''、L'、L'に示されています。(M)中空および(N)固形尿道上皮オルガノイド(UEO)の代表画像で、上皮マーカーKRT4(基底上皮マーカー)およびKRT5(基底上皮マーカー)で免疫染色されています。単一の蛍光チャンネルを描いた画像はM'、M''、N'、N"に示されています。(O) 近位および遠位尿道の解離図。(P) 近位および遠位尿道から生成されたオルガノイドタイプの定量化を、2つの独立した実験で実施。6日目の尿道上皮オルガノイド(UEO)の代表的な明視野顕微鏡写真。これは(Q)近位尿道および(R)遠位尿道から分離された上皮から生成されたもの。完全な尿道から生成されたオルガノイドのデータは、3〜5匹のマウスを対象に3つの独立した実験を代表しています。(S) 近位尿道および遠位尿道から生成されたオルガノイドのデータは、3〜4匹のマウスを対象に実験ごとに実施された2つの独立した実験の代表です。核はDAPI(青)で標識されています。(スケールバー、100μM)設計図はBioRenderとAdobe Illustratorで作成。BioRenderで作成。ビノイ・ジョセフ、D.(2026年)https://BioRender.com/jvf17v7 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

図5:尿道上皮シートの全額免疫染色。 (A) 最適な切断培地で成虫メスの尿道を10ミクロン凍結した切片で、マウスのマクロファージマーカーF4/80(赤)および上皮性タンパク質E-カデリン/CDH1(緑)の免疫染色が示されています。(A')は(A)の挿入部分のズーム表示を表します。(B) 分離尿道上皮シートの全着着染色手順を示す回路図。単離された雌マウス尿道上皮内膜の全量免疫染色を、マウスマクロファージマーカーF4/80(赤)および上皮タンパク質E-カデリン/CDH1(緑)に対する抗体を用いて実施しました。(C) 統合されたビューの代表画像。(D) 赤いチャネルの直交最大強度投影でマクロファージの組織を示します。(E–F)上皮と関連するマクロファージをズームインして見た。白スケールバー、50μM。グレースケールバー、500μM。データは4〜5匹のマウスプールで行われた2つの独立した実験を代表しています。回路図はBioRenderおよびAdobe Illustratorで作成。BioRenderで作成。ビノイ・ジョセフ、D.(2026年)https://BioRender.com/tjh9opk この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

補足表1:HBSS1回の調製(Ca、Mgなし)。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表2:1xsHBSAおよび1%トリプシン溶液の調製。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表3:セル/フロー染色バッファーの準備。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表4:尿道上皮オルガノイドのオルガノイド拡張培地の調製。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表5:馬用ブロッキングバッファーの準備。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1:尿道上皮および2つの独立した実験の間質区画から単一細胞で実施されたフローサイトメトリー実験の細胞数。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図1:成虫メスの尿道上皮と尿道上皮オルガノイドの比較。 (A) 成虫雌マウス尿道上皮、(B) 中空尿道上皮オルガノイド、(C) 上皮マーカーKRT13(基底上皮マーカー)、KRT5(基底上皮マーカー)、P63(基底上皮マーカー)で免疫染色された固形尿道上皮オルガノイド(UEO)の代表画像。単一の蛍光チャンネルを描いた画像はA'、A''、A'''、B'、B''、B'、C'、C'、C'''に示されています。代表的な画像は、(D) 成虫雌マウスの尿道上皮、(E) 中空の尿道上皮オルガノイド、(F) 上皮マーカーKRT4(基底上皮マーカー)およびKRT5(基底上皮マーカー)で免疫染色された固形尿道上皮オルガノイド(UEO)の画像。単一の蛍光チャンネルを描いた画像はD'、D''、E''、E''、F'、F"で示されています。3つの独立した実験を代表するデータで、各実験に3〜4匹のマウスを対象に実施されました。核はDAPI(青)で標識されています。(スケールバー、100μM)このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

体内の上皮障壁は宿主の防御に極めて重要です。これらは複数の上皮細胞タイプとそれに伴う常駐免疫細胞を持つ専門的な区画です。上皮バリアは発生過程で変化し、しばしば微生物叢や環境曝露に応じて宿主防御遺伝子発現を獲得します。上皮の完全性や遺伝子発現の欠損は宿主防御に影響を与える可能性があります¹⁵。上皮組織を単独で研究することで、トランスクリプトムのシグネチャーを理解し、細胞間接触や上皮の完全性を調査することが不可欠です。現在、メスのマウスから尿道上皮組織を分離するために最適化された詳細な方法は記載されていません。膀胱上皮は機械的分離のみで分離^{可能ですが、}尿道上皮は尿道の間質管内に存在し、上皮組織を分離するために酵素的分離と機械的分離の組み合わせが必要です。

ここでは、著者らはメスのマウスの尿道腔から上皮シートを分離するための最適化された方法を提示します。この方法は、フローサイトメトリー、オルガノイド培養、免疫染色などの下流応用向けに、尿道上皮細胞の高生存率単一細胞懸濁液の生成に利用できます。この手法の単一細胞RNAシーケンスワークフローとの互換性は、同じグループ⁵によって以前に実証されています。改良とさらなる最適化により、ここで提示されたプロトコルは、他の管状器官から上皮組織を抽出し、下流の応用に適応させることができます。

プロトコルの重要なステップは、成体の雌マウス尿道全長を慎重に解剖することで、近位軸と遠位軸に沿った地域差の研究を可能にします。その後、プロトコルでは穏やかな酵素的消化を用いて尿道の上皮内膜を周囲の間質から緩めます。酵素による消化により、鉗子の間の尿道管を優しく絞って上皮組織を解放し、上皮を緩めて機械的に分離できるようにします。研究者たちは、免疫染色や下流単細胞分離のためのシートとして高い生存率(>80%)の尿道上皮を分離できるように、トリプシン消化のタイミングを慎重に最適化しました(図3、補足ファイル1)。尿道上皮の単細胞消化により、尿道上皮分離株の上皮細胞の80〜90%が明らかになりました。以前の研究によると、この調製物に含まれる非上皮細胞は主に上皮関連免疫細胞と血管内皮5^{で構成されています。}現在の単細胞分離法は、低ゲージ針吸引による機械的破壊や穏やかな溶解による赤血球の除去により、フローサイトメトリーや単細胞RNAシーケンスなどの後流応用において高品質な単一細胞懸濁液を生み出します。

結果は、この方法がコンパートメント特異的免疫細胞の濃縮に用いられることを示しています(図3)。近位尿道と遠位尿道から分離された上皮も別々に研究可能です。さらに、著者らは、単離された上皮細胞がこれまで記載されていなかった尿道オルガノイドの生成にも利用できることを示しました(図4)。これらの結果は、女性尿道におけるオルガノイド生成能力の地域的ばらつきも示しています。著者の最近の研究では、メスのマウス尿道5における上皮遺伝子発現と免疫細胞組織の近位-遠位間に違いが^{示されていますが}、本研究では近位尿道上皮細胞は遠位尿道から分離された上皮よりもオルガノイド数が少ないことが示されています(図4)。近位尿道と遠位尿道への空間的区分の制約の一つは、解離時にこれら二つの領域を区別できる解剖学的ランドマークが存在しないことです。本研究では、著者らは尿道の長さを半分に分けて近位区画と遠位区画を得ています。ここで述べた上皮分離法は、近位尿道上皮と遠位尿道上皮の遺伝子発現および細胞組成の違いをさらに特徴付けるために用いられます。

ここで提示された最適化されたプロトコルはアクセス可能で再現可能ですが、いくつかのステップには練習と慎重なキャリブレーションが必要です。特に、ここで示す解離法では、恥骨結合の下から尿道管を慎重に抜き、尿道全体を保持する必要があります。さらに、解離後は背側尿道壁に付着した膣組織を除去する際に注意が必要です。膀胱頸部周辺の脂肪は、単細胞RNAシーケンスなどの下流応用時に脂肪細胞汚染を減らすために慎重に除去する必要があります。さらに、トリプシンの消化は酵素の各バッチごとに慎重に最適化され、消化が安定するように調整されるべきです。組織の過剰消化は細胞の生存能力を損なう可能性があります。著者らはトリプシン消化の時間を慎重に最適化しており、4°Cおよび37°Cでのインキュベーションステップは15〜30分の時間窓とされています。 使用する酵素のバッチによってさらに最適化が可能です。また、効率的な単細胞消化のために組織を小さく刻むことも重要です。著者らは、アキュターゼを単細胞消化のために用いており、これにより穏やかな解離が得られる。細胞の生存能力が低下した場合、アキュターゼの培養時間を短縮することができます。さらに、著者らは細胞生存率を高めるためにアキュターゼ消化混合物にロック阻害剤を含んでいます。DNase消化は、死んだ細胞や死にかけている細胞から放出された細胞外DNAを消化することで細胞凝集を減らすために推奨されます。著者らはまた、フローサイトメトリーや単細胞RNAシーケンスなどの後流結果を妨げる赤血球汚染を減らすために赤血球溶解バッファーの使用を推奨しています。

ここで示す上皮分離法の制約の一つは、メスのマウス尿道に最適化されていることです。オスのマウス尿道は解剖学的により複雑で、上皮構造が近位尿道から遠位尿道へと変化します。さらに、この方法は尿道腔内壁の上皮細胞のみを分離できます。尿道分泌腺は短い上皮管を介して尿道腔に接続されており、これらは間質組織に埋め込まれているため単独で分離できません。代わりに、これらの上皮構造は尿道上皮内膜を分離した後に残る間質区画で増殖します(図3)。

これらの限界にもかかわらず、この方法は尿道上皮構造に関する重要な知見をもたらし、原位上皮関連マクロファージの可視化を通じて上皮関連免疫細胞のさらなる研究を可能にします。この方法はすでに尿道上皮および関連する^{免疫細胞の}細胞異質性を特定するための単細胞RNAシーケンシングワークフローと互換性があることが示されています5。さらに、近位および遠位尿道から上皮を分離する能力により、尿道の空間的差異の理解が可能となります。重要なのは、上皮細胞消化法が生存可能な単一細胞を生成し、宿主と病原体の相互作用や尿道の上皮生物学の研究に役立つ尿道上皮オルガノイドを生成できることです。全体として、これらの手法は尿道上皮生物学のより深い研究を可能にするツールキットを補完します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#5 ファインフォースプヤスク
10% 中性緩衝ホルマリン	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12ウェルプレート	Corning	3513
30ミクロンプレセパレーションフィルター	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		図のパネルを作成するために
Adobe Photoshop	Adobe		図のパネルを作成するために
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
抗生物質/抗真菌薬	Sigma Aldrich	A5955
抗CD326（EpCAM）	Invitrogen	17-5791-82	フローサイトメトリー用、1:20希釈
抗CD45	Tonbo	35-0451-U100	フローサイトメトリー用、1:20希釈
抗CDH1（ウサギ）	Cell Signalling Technology	3195S	1:200希釈
抗F4/80	Tonbo	50-4801-U100	フローサイトメトリー用、1:20希釈
抗F4/80（ラット）	Invitrogen	14-4801-82	1:200希釈
抗ケラチン13（ウサギ）	Abcam	ab92551	1:200希釈
抗ケラチン4（マウス）	Abcam	ab9004	1:200希釈
抗ケラチン5（チキン）	Biolegend	905904	1:800希釈
抗ケラチン5（ウサギ）	Cell Signaling Technology	71536	1:200希釈
抗p63（マウス）	Biocare medical	CM163A	1:200希釈
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27サプリメント	Invitrogen	12587010
ウシ血清アルブミン（BSA）、フラクションV	Genetix	PG-2330
CD-1マウス	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI溶液	Sigma Aldrich	D5942
D-グルコース	Qualigens	Q15405
ジメチル硫酸（DMSO）	Himedia	MB058
二水素酸化ナトリウム（Na2HPO4）	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
ドニキー抗チキンIgG（H+L）（AF488）	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500希釈
ドニキー抗マウスIgG（H+L）（AF488）	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500希釈
ドニキー抗マウスIgG（H+L）（AF594）	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500希釈
ドニキー抗ウサギIgG（H+L）（AF594）	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500希釈
ドニキー抗ウサギIgG（H+L）（AF647）	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500希釈
ドニキー抗ラットIgG（H+L）（AF647）	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500希釈
ドニキー抗ラットIgG（H+L）（AF594）	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500希釈
EGF	PeproTech	AF-315-09
エオシン	Himedia	GRM938
エタノール	Supelco	1.00983
Eukittマウンティングメディア	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
フィルターキャップ仕分けチューブ	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
無水グリセロール	Merck	DA1P692899
ヘマトキシリン	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
ホース血清	Gibco	26050088
Kaluza分析	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	フローサイトメトリーデータの分析
塩化マグネシウム（MgCl2）	Qualigens	Q15535
マウスTruStain FcX（抗マウスCD16/32）	Biolegend	101320
N-アセチルシステイン	Sigma Aldrich	A9165
ニコチンアミド	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-プロピルガレート	Sigma Aldrich	P3130
パラフィンワックス	Qualigens	Q19215
塩化カリウム（KCl）	Qualigens	Q13305
二水素酸カリウム（KH2PO4）	Qualigens	19465
プリモシン	Invivogen	ant-pm-05
RBC溶解バッファー（10X）	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
レチノイン酸	Sigma Aldrich	R2625
Rocki（Y-27632）	Cell Signalling Technology	13624S
R-spondin 1