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方法論記事

歯髄幹細胞由来エクソソームの細胞通路における単離と特徴付け

242 回視聴

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DOI:

10.3791/70977

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2026年4月10日

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1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital

この記事について

サマリー

このプロトコルは、歯髄幹細胞(DPSC)由来のエクソソームを通路間で分離・特徴付けするための標準化されたワークフローを示し、再生応用におけるエクソソームの品質および機能活性の再現性評価を可能にします。

要約

歯髄幹細胞(DPSC)は、間葉幹細胞のアクセスしやすく臨床的に重要な供給源であり、その由来エクソソームは組織工学や再生医療における細胞無添加の有望な生体活性小胞として注目されています。しかし、DPSC由来エクソソームの単離および機能検証のための再現可能かつ標準化された方法は、特に細胞拡張時に導入される変異性に関して限界が残っています。ここでは、DPSC調整培地からのエクソソームの分離および精製のための包括的で標準化されたキットベースのワークフローを説明し、通常の実験室作業と互換性があります。この方法は、一般的に利用されている技術を用いて形態学的、分子的、機能的特徴付けに適した完全な小胞の一貫した回収を可能にします。エクソソームの同一性は形態、サイズ分布、マーカー発現に基づいて評価され、生物学的活性は定義されたin vitro抗炎症アッセイを用いて評価されます。通路関連効果を調べるために、異なるDPSC通路由来のエクソソームをこの機能的読み取りを用いて比較し、細胞増殖時の一貫性を評価する実用的な枠組みを提供します。分離、精製、特性評価、機能検証を単一のワークフローに統合することで、このプロトコルはバイオマテリアル研究および再生応用向けの機能検証済みDPSC由来エクソソームを生成する再現性と拡張性のアプローチを提供します。

概要

間葉系幹細胞由来のエクソソームは細胞間コミュニケーションの重要な媒介者として機能し、組織工学や再生医療の分野で大きな治療可能性を示しています。エクソソームは直径30〜150 nmの小胞で、生体活性分子を伝達し、増殖、分化、免疫応答など受容細胞のさまざまな機能を調節することができます1,2。さまざまな間葉質幹細胞(MSC)供給源の中で、歯髄幹細胞(DPSC)は入手しやすいこと、強靭な増殖能力、低腫瘍リスク、そして倫理的懸念が最小であることから特に注目されています。DPSC由来のエクソソーム(DPSC-Exos)は、タンパク質、mRNA、マイクロRNAなど多様な機能的貨物を含み、親細胞の多くの生物学的特性を保持しています。過去の研究では、DPSC-エクソスが血管新生、神経修復、骨再生、抗炎症反応を促進することが示されています。組織工学の役割を超えて、エクソソームは腫瘍発生やがん治療において重要な調節因子としてますます認識されており、腫瘍微小環境の再構築、薬剤耐性、免疫回避に寄与しています。DPSC由来を含むMSC由来のエクソソームは、腫瘍ホーミング能力と免疫調節特性を有しており、標的抗がん薬送達や細胞フリー免疫治療薬としての次世代有望な媒体として位置づけられています。細胞ベースの治療に伴ういくつかの制限を回避することで、DPSC-エクソは再生応用における有望な非細胞生物活性成分として浮上しました(7,8,9,10,11,12)。

これらの利点にもかかわらず、DPSC-Exo研究を再現可能な実験的または臨床的利用に転換することは依然として困難です。主な制約は、エクソソームの分離および精製に関する統一かつ標準化されたプロトコルが存在しないことです。現在使用されているアプローチには、超遠心分離13、超ろ過、沈殿法、サイズ排除クロマトグラフィー、免疫親和性キャプチャ14,15があります。これらの方法の中で、ポリマーベースの沈殿は高スループット、幅広い試料体積への適合性、操作の簡便さなど実用的な利点を持ち、大量のサンプル数やスケールアップ要件を伴う研究に適しています 16,17,18。タンパク質収量や粒子対タンパク質比率に関する異なる分離方法の比較解析は文献で広く記録されています。しかし、DPSCの通過番号が派生エクソソームの特徴や生物学的活性に与える影響は十分に解明されておらず、DPSC-エクソ生産の標準化および品質管理において重要なギャップとなっています。

これらの技術的制約に対処するため、本研究はDPSC条件付け培地からエクソソームを分離・精製するための標準化されたキットベースのプロトコルを提示します。物理的および分子的特徴付けに加え、プロトコルには機能的アッセイを組み込んで、異なるDPSC通路由来のエクソソームの抗炎症活性を評価することにより、外分泌体品質と機能の一貫性を比較評価することが可能です。ワークフローは、標準的な細胞培養および分子生物学設備を備えた実験室での簡単な導入を想定しています。これは市販キットに依存して実験間のばらつきを減らすことができ、さまざまな実験ニーズに合わせて容易にスケール可能です。ドナー間の変動を最小限に抑えるため、DPSCは個々の歯から分離され、複数のドナーからプールされるのではなく、独立して増殖されます。このプロトコルは、創傷治癒、骨組織工学、免疫調節研究など、バッチごとの一貫性が不可欠な後継用途のために機能的に検証されたDPSC由来エクソソームを生成する研究者に特に有用です。全体として、組織工学や再生医療研究に利用されるDPSC由来エクソソームの製造に向けた実用的かつ標準化された枠組みを提供します。

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プロトコル

この調査はヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、制度倫理委員会によって承認されました。人間の歯髄組織は、寧波口腔医学病院で処分された第三大臼歯や矯正前臼歯から採取され、機関の倫理ガイドラインに従って採取されました(プロトコル番号:NBKQYY2025LS-04;承認日:2025年5月30日)。人間の皮膚組織は、寧波大学付属人民病院泌尿器科で通常の割礼手術中に採取された廃棄された包皮サンプルから採取され、機関の倫理ガイドラインに従い(プロトコル番号2024104、承認日:2024年10月30日)に従ったものである。サンプル採取前に、すべてのドナーまたはその法定後見人から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。

1. 歯髄幹細胞由来のエクソソームの単離

  1. DPSCの分離、培養、同定
    1. サンプル採取と輸送
      1. 矯正抜歯後、18歳から25歳のドナーから、または12歳から16歳のドナーから完全な人間の第三大臼歯を採取します。
      2. 抜いた歯を、100 U/mLペニシリン-Gと100 μg/mLのストレプトマイシンを補足した、事前に冷却されたリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)に入れます。
      3. サンプルを4°Cで実験室に輸送し、抽出後6時間以内に処理します。
    2. 歯髄曝露と組織解離
      1. 70%エタノールに30秒浸す;3%のP/Sを含む1×PBSで3回洗います(1回30秒)。歯面から残留する歯肉組織や歯周組織を、滅菌ハサミやメスで慎重に除去してください。
      2. 歯を滅菌ガーゼで包み、滅菌ハンマーでクラウンを慎重に割り、歯髄室を露出させます。
      3. 乳髄組織を優しく象牙質から切り離し、滅菌手術用ブレードで小さな破片(<1 mm3)に刻みます。
      4. 組織断片を1.5 mLの遠心分離管に移し、2.5 mg/mLのディスパーゼIIおよび2.5 mg/mLのコラーゲナーゼタイプIの消化液を含みます。
      5. 混合液を37°Cの培養盤で30〜45分間、優しく攪拌しながら培養します。
        注: 酵素による消化の時間は、歯髄組織の均質化の体積と程度に基づいて決定されました。
    3. 消化終結と一次細胞培養
      1. 酵素的消化を止めるために、デュルベッコ改良イーグル培地(DMEM)を10%胎児用牛血清(FBS)を補足して同量添加します。
      2. 細胞懸濁液を200× g で5分間遠心分離し、細胞や組織断片をペレット状にします。
      3. 上清液を廃棄し、ペレットを1mLの全培養培地(α-MEMに20% FBS、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを加えたもの)に再懸浮させます。
      4. 再懸濁した細胞とエクスプラントを60mmの培養皿に種付けし、最終体積5mLに完全な培養培地を加えます。
      5. 細胞は37°Cで、5%のCO₂を含む加湿大気で培養します。
    4. 細胞維持とサブカルチャー
      1. 培地は2〜3日ごとに更新してください。
      2. 細胞を毎日監視してください。
        注:一次DPSCは通常、組織外植体から移動し、7〜14日以内に80〜90%の合流に達します。
      3. サブカルチャーでは、細胞が80〜90%の合流に達した時点で0.05%のトリプシン-エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)を用いて細胞を剥離します。
        注意:トリプシンは刺激物質です。手袋や安全メガネなどの適切な個人用防護具を着用してください。
      4. 全培地(FBS20%)を用いて1:3の比率でパッセージ細胞を投与します。
      5. 2番、4番、6番のパッセージでDPSCを使い、下流のエクソソーム分離および機能的アッセイを行ってください。
    5. フローサイトメトリーによるDPSCの特徴付け
      1. 目的の通過点で0.05%トリプシン-EDTAを用いてDPSCを剥離し、完全な培養培地で中和し、細胞懸濁液を回収します。
      2. 室温で300×gで5分間遠心 分離し、上清液を捨てます。細胞ペレットをPBSに再懸浮させ、細胞数を数えます。細胞密度を約1 ×10 6 cells/mLに調整します。
      3. 各フローサイトメトリーチューブに細胞懸濁液100μLを割り当てます。細胞をCD44、CD90、CD105、CD45、CD19、CD14に対するフルオロクロム結合抗体で、PBSで希釈した1:100のPBSで30分間、暗闇4°Cで30分間インキュベートします。
      4. 各チューブに1mLのPBSを加え、その後300× g で5分間遠心分離して細胞を洗浄します。上清液を慎重に捨て、細胞ペレットを300〜500μLのPBSに再懸濁して分析します。
      5. 各フルオロクロムごとに適切なアイソタイプ対照抗体を適合濃度で含め、背景補正とゲーティングを可能にします。
      6. 選択したフルオロクロームに適したレーザーとフィルターを備えたフローサイトメーターを用いてサンプルを分析します。サンプルごとに少なくとも10,000件のイベントを取得してください。
      7. フローサイトメトリーソフトウェアを用いてデータ解析を行います。まず、前方散乱(FSC)と側散乱(SSC)に基づくゲート活発なセルを設置し、デブリを排除します。次にダブルトを除去するためにシングルレットゲートを適用します。
      8. 蛍光強度と対応するアイソタイプ対照群を比較して、正負の集団を定義することでマーカーの発現を決定します。
  2. DPSCエクソの分離と精製
    1. 調製培地の調製
      1. 10cmの培養皿でDPSCを70〜80%の合流点まで培養します。
      2. 使用済み培地を取り出し、細胞単分子層を予熱したPBSで優しく2回洗います。
      3. 10mLの完全培地に加え、10%エクソソーム欠乏FBSを補足します。
      4. さらに37°Cで培養を培養し、細胞のコンフルージョンが90〜100%に達するまで(通常24時間を超える)。
    2. 調整培地の収集
      注: 以降の手順はすべて氷の上または4°Cで保管してください。
      1. 調整された培地を遠心分離機のチューブに移します。
      2. 培地を4°C、3,000 g の×で10分間遠心分離し、細胞や大きなゴミを除去します。
      3. ペレットを乱さずに上清液を新しい遠心分離機チューブに慎重に移してください。
      4. 上清液を4°C、10,000 g ×で10分間遠心分離し、より小さな粒子やアポトーシスの物体をペレット化します。
      5. 上清液を0.22μmのシリンジフィルターで浄化した50 mL遠心分離機管に濾過します。
      6. 精製培地をすぐに処理してエクソソーム分離、すなわちアリコートを処理し、-80°Cで保存します。
        注:清算された調整培地は-80°Cで数ヶ月間保存可能です。繰り返される凍結融解のサイクルは避けてください。
    3. 高分子基沈殿によるエクソソーム分離
      1. 冷凍されている場合は、氷で溶かして清算された培地を解凍してください。
      2. 氷上の滅菌チューブで培地をエクソソーム濃度溶液と4:1の体積比で混合します(例:20 mL培地:5 mL溶液)。混合物を1分間ボルテックスして均質化を保ちます。
      3. 混合物は4°Cで16〜18時間そのまま放置し、エクソソームの沈殿を待ちます。
        注意:孵化時間は収量を増やすために適適切に延長可能ですが、24時間を超えてはいけません。
      4. 混合物を4°C、10,000 × g で75〜80分間遠心分離し、エクソソームをペレット状にします。ペレットを乱さずに慎重に吸引し、上澄液を捨てます。
      5. 再びチューブを4°C、10,000 g で2分間遠心分離×。ピペットで残留した上澄液を除去します。
      6. エクソソームペレットを1倍PBSで再懸浮させます(20 mLの調整培地に200 μLのPBSを使用)。
      7. 再懸濁液を新しい1.5mL遠心分離機チューブに移し、遠心分離機を4°C、12,000 × g で2分間保存し、上清液を保持し、エクソソーム粒子で濃縮します(必要に応じて繰り返し)。
    4. エクソソームの精製
      1. エクソソーム懸濁液を収集管内に設置したエクソソーム精製フィルターカラムに適用します。
      2. 4°C、3,000 × g で10分間遠心分離します。
      3. 収集管の底から流れる液体を集めます。この液体には精製されたエクソソームが含まれています。
    5. 精製エクソソームの貯蔵
      1. 精製されたエクソソーム懸濁液を、下流実験に適した使い捨て量に分割します。
      2. アリコートは-80°Cで保存します。
        注意:アリクォートは、エクソソームの完全性や生物活性を損なう繰り返しの凍結・融解サイクルを避けるために非常に重要です。
    6. DPSCs-Exoの特性評価と同定
      1. 透過電子顕微鏡(TEM)による形態学的解析を、ステップ1.2.6.2–1.2.6.6で行います。
      2. ピペットを使い、準備済みのエクソソーム懸濁液サンプル10μLを抽出し、あらかじめ準備されたパラフィルムに落とします。フィルム面を下向きにしたフォームバ/カーボンコーティングされた銅グリッドを液滴に置き、10〜15分間自然吸着させます。
      3. フィルターペーパーの細長い部分で余分な水分を吸い取り、短時間自然乾燥させます。
      4. ピペットを使い、2%リン酸溶液10μLを抽出し、パラフィルムに落とします。吸着工程が完了したグリッドを逆さにしてフィルム面が染色液の方を向くようにし、3〜5分間放置します。
      5. フィルターペーパーのストリップを使って余分な液体を吸い取り、白熱灯の下でグリッドを乾かします。
      6. 透過電子顕微鏡で画像を観察し、撮影します。
      7. ナノ粒子追跡解析(NTA)によるサイズ分布および濃度分析を、ステップ1.2.6.8–1.2.6.12で説明しています。
      8. サンプルチャンバーを超純水で3回すすいでください。
      9. メーカーの指示に従って標準的な100nmのポリスチレンビーズを使用して機器を校正してください。キャリブレーションが成功した後、測定を進めてください。
      10. サンプルチャンバーを1×PBSですすぎます。
      11. エクソソームサンプルを1×PBS(1:500希釈)で希釈し、サンプルチャンバーに注入します。計測ソフトを使って粒子の動きをリアルタイムで監視できます。
      12. データを収集し、対応する分析レポートを作成します。
      13. ウェスタンブロット解析で、1.2.6.14–1.2.6.24で説明されたタンパク質マーカーを特定します。
      14. エクソソーム特異的タンパク質溶解バッファーを用いた溶解エクソソームサンプルと、ビシンコニン酸(BCA)アッセイによるタンパク質濃度の定量。
      15. 溶解ジェルと積み重ね用ジェルを準備してください。各レーンに等量のタンパク質を積み込み、各ゲルに5μLのタンパク質マーカーを加えます。
      16. 80 Vの定電圧で電気泳動を行い、染料前面が分離ゲルに到達するまで続け、その後120 Vに増強して染料前面がゲルの底部に達するまで続けます。
      17. ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜を適切なサイズに切り、メタノールに5分間浸して活性化させます。
      18. 25 mMのトリス塩基、192 mMのグリシン、20%(v/v)メタノール(pH=8.3)からなるトランスファーバッファーを準備します。転送バッファ内のすべての移動成分を平衡化してください。
      19. 転移サンドイッチをカソードからアノードへ次の順番で組み立てます:スポンジ – フィルターペーパー – ゲル – PVDF膜 – フィルターペーパー – スポンジ。気泡を取り除き、300 mAの定流でタンパク質輸送を行います。
      20. 移植後、PVDF膜をTrisバッファー入0.1%Tween20(TBST)入り生理食塩水で短く洗い流し、室温で1時間優しく振って5%無脂肪ミルクでブロックします。
      21. 膜を1次抗体(例:抗CD63および抗TSG101)で培養し、5%無脂肪ミルクで4°Cで一晩、優しく振って培養します。膜をTBSTで3回、それぞれ5分間洗います。
      22. 適切な二次抗体を室温で30分間インキュベートし、その後TBSTで3回(各5分)洗浄します。
      23. 新しい電気化学発光(ECL)作業液(溶液AとBを1:1の比率で混合)を準備し、膜に塗布し、化学発光イメージングシステムを用いて信号を検出します。

2. ヒト一次皮膚表皮角化細胞の単離および培養

  1. サンプル採取と輸送
    1. 寧波大学付属人民病院の健康な男性ドナーから包皮組織サンプルを取得してください。
    2. 摘出した包皮組織をすぐに4°CのPBSに100 U/mLペニシリン-Gおよび100 μg/mLのストレプトマイシンを補足して置きます。
    3. サンプルを4°Cで実験室に輸送し、6時間以内に処理します。
  2. 無菌調製と組織断片化
    1. 組織を70%エタノールに30秒から3分間浸します。
      注意:初期消毒時は組織の大きさに応じて浸漬時間を調整してください。
    2. 無菌ハサミやメスを使い、洗浄された組織サンプルから皮下脂肪と結合組織を解剖・除去します。
    3. 無菌の外科用刃で小さな断片(破片サイズ<1 mm3)に刻みます。
      注:3〜4個の組織サンプルを粉砕するには通常15分未満で済みます。組織が乾燥しているように見える場合は、ミンチ中に少量のPBSを加えてください。
    4. 挽いた組織スラリーを、2.5 mg/mL コラーゲナーゼタイプIおよび2.5 mg/mL ディスパーゼIIの消化液を含む50 mL遠心分離機チューブに移します。1枚の細かい組織につき10〜20mLの消化液を加えます。
    5. 混合液を37°Cの培養盤で60分間孵育します。80×gで優しく攪拌 するか、20分ごとに手で強くかき混ぜてください。
  3. 二次消化およびDNase処理
    1. 消化混合物に1:5の体積比で0.25%のトリプシン-EDTAを加えます。チューブを37°Cで25分間、優しく攪拌しながら孵化させます。
      注意:トリプシンは刺激物質です。手袋や安全メガネなどの適切な個人用防護具を着用してください。
    2. 混合物にDNase I溶液(10 mg/mL)を加え、総消化体積の10 μL/mLの割合で加えます。37°Cで5分間、優しくかき混ぜて孵化させます。
  4. 消化終結と一次細胞培養
    1. 酵素による消化を止めるために、同じ量のDMEMに加え、10%のFBSを補足します。
    2. 組織断片を解離するために、約20回ピペットで上下に分解して混合物を徹底的に研磨します。細胞懸濁液を100μmのセルストレーナーで濾過し、新しい50mL遠心分離機チューブに浸透させます。
    3. 細胞懸濁液を200× g で5分間遠心分離し、細胞や組織断片をペレット状にします。
    4. 上清液を廃棄し、ペレットを1mLの全培養培地(α-MEMに20% FBS、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを加えたもの)に再懸浮させます。
    5. 再懸濁した細胞とエクスプラントを10cmの培養皿に種付けし、最終体積6mLに完全な培地を加えます。
    6. 細胞は5%のCO2を含む加湿大気で37°Cで培養します。
      注:培養中に最終濃度5μMのY-27632をケラチノサイト培養に補足してください。
  5. 細胞維持とサブカルチャー
    1. 培地は2〜3日ごとに更新してください。
    2. 細胞を毎日監視してください。
      注:一次皮膚表皮角化細胞は通常、組織外植排出から移動し、10〜14日以内に80〜90%の合流率に達します。
    3. サブカルチャーでは、細胞が80〜90%の合流に達した際に0.05%トリプシン-EDTAを用いて細胞を剥離します。
      注意:トリプシンは刺激物質です。手袋や安全メガネなどの適切な個人用防護具を着用してください。

3. 異なる通路からのエクソソームの抗炎症機能の機能的検証

  1. 細胞シーディングと調製
    1. 1.5 × 105 細胞の密度で表皮ケラチノサイトを12ウェルのプレートに播種します。各ウェルに1mLの完全培地を加え、細胞を24時間培養します。
    2. 細胞のコンフルーションが約70%に達したら、培地を慎重に吸引し、細胞単分子層を予温された1×PBSで優しく2回洗います。
  2. 炎症刺激とエクソソーム治療
    1. 膿性細胞モデルを誘導し、炎症誘発性サイトカイン混合物「M5」(IL-1α、IL-17A、IL-22、オンコスタチンM、TNF-αを含み、最終濃度10 ng/mL)で細胞を刺激します。
    2. 処理群では、刺激細胞をDPSC-Exos(ウェルあたり50μg)と共キュベートします。
    3. 陰性対照群(NC)では、エクソソームの代わりに同等量のPBSを追加してください。
      注意:Y-27632が炎症シグナル伝達経路に干渉する可能性を排除するため、すべての刺激および治療はY-27632を含まない培地で行ってください。
  3. サンプル採取およびqRT-PCR解析(パッセージ間の機能比較)
    1. 処理後24時間後に細胞を採取し、RNAを抽出します。
    2. 主要な炎症マーカーであるIL-23Aの発現を解析します。
      1. qRT-PCRを用いて、異なるパッセージ(P2、P4、P6)から派生したエクソソーム処理群間でIL-23A発現への抑制効果を比較し、パセージ依存性エクソソーム機能の変化を評価します。
      2. qRT-PCRは以下のサイクル条件で実施します:95°Cで3分間の初期変性、その後95°Cで10秒間の変性40サイクル、60°Cで30秒のアニーリング/拡張。
      3. 増幅特異性を確認するために、65°Cから95°Cまでの融解曲線解析を行います。
        注:プライマー配列:ヒト-IL-23A(前方:5'-GAAGAGGGATGAAGAGAC-3'、裏面:5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3');ヒト-H36B4(前向き:5'-GCAATGTGCCAGTGTGTGT-3'、裏面:5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

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結果

歯髄幹細胞の同定と特徴付け
本プロトコルで単離された一次歯髄幹細胞(DPSC)は、in vitro増殖中に安定した成長と典型的な間葉形態を示しました。 図1に示すように、2、4、6の通路におけるDPSCは、均質な紡錘形の線維芽細胞集団を示し、形態学的な違いや通路間の自発分化の兆候は見られませんでした。すべてのDPSCの通路は、変動を最小限に抑えるために同一条件下で培養されました。

拡張されたDPSCが後のパスで間葉系幹細胞の特徴を保持することを確認するため、パスセージ6の細胞に対してフローサイトメトリー解析が行われ、in vitro増殖中の幹細胞特性を維持するための代表的な品質管理が行われました。これらの細胞は間葉幹細胞マーカーのCD44、CD90、CD105の発現が高い一方で、造血および内皮系マーカーのCD45、CD19、CD14の発現は欠けていました(

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ディスカッション

本研究で述べた標準化されたプロトコルは、歯髄幹細胞(DPSC)の分離、DPSC由来エクソソーム(DPSC-Exos)の産生、および複数の細胞通路にわたるこれらの小胞の機能的検証のための再現可能な枠組みを提供します。以下の議論では、重要な手続き上の考慮事項、最適化戦略、方法論的限界、そしてこのワークフローが再生医療研究に与えるより広範な関連性を強調しています。

このプロトコルの信頼性は、組織の調達と取り扱いから始まる最も初期段階での厳格な品質管理に依存しています。DPSCは、若年ドナーから得られた健康な歯髄組織から分離され、成人(18〜25歳)の第三大臼歯や思春期(12〜16歳)の矯正前臼歯などが対象となりました。若い個体から採取された歯髄は通常、より高い増殖能力と保存された幹を持つ細胞を産出し、下流のエクソソーム生産に一貫した生物学的基盤を提供します3,20。抗生物質保護下での迅速な輸送と処理は、汚...

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開示事項

著者には競合する金銭的利益を主張する必要はない。

謝辞

このプロジェクトは中国国家自然科学基金(助成金番号82273554)によって資金提供されました。著者らは寧波口腔医学病院の生体材料・組織再生工学研究室の継続的な支援に感謝し、現職および過去のチームメンバーの貴重な議論に感謝します。また、寧波大学付属人民病院の沈麗良博士にも、包皮組織サンプルの提供に寛大な支援と強力な支援をいただき感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% Trypsin-EDTA SolutionGibco25300054消化力を活かして、トリプシンは細胞解離、日常的な細胞培養の継代、および一次組織解離に広く使用されています。
100 mm Cell and Tissue Culture DishBiofilTCD010100表面処理済み/未処理
無菌&非発熱性
DNase/RNaseフリー
100 nm PS beadsThermo Fisher3100Aナノ粒子トラッキング解析（NTA）実験を実施する前に、正確に知られた粒子サイズ（100 nm）を持つ標準物質を使用して機器を校正する必要があります。
15-mL Bulk Conical Centrifuge TubeKIRGENKG2611無菌、RNase/Dnase、発熱性フリー
200-mesh Formvar-carbon-coated copper gridZhongjing Scientific InstrumentsAZH200TEM撮像用のエクソソームサンプルをサポートします。Formvar-carbonコーティングはサンプルの接着性と導電性を高め、200-meshグリッドは均一な粒子分布と安定な撮像のための適切な開口部を提供します。
37 °C IncubatorThermo Scientific5103287737度のCO2インキュベーターは理想的なin vitro環境を提供します。
50-mL Bulk Conical Centrifuge TubeKIRGENKG2811無菌、RNase/Dnase、発熱性フリー
Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5]Abcamab193349Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5] (ab193349)は、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー（イントラ）、フローサイトメトリー、IHC-P、ICC/IFでCD63を検出するマウスモノクローナル抗体です。ヒトに適しています。
Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]Abcamab125011Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] (ab125011)は、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー（イントラ）、フローサイトメトリー、IHC-P、ICC/IFでTSG101を検出するウサギモノクローナル抗体です。ヒト、マウス、ラットに適しています。
Automated cell counterCountstarIC1000高速で正確な細胞数測定のための自動細胞カウンター
BCA Protein Assay KitBeyotimeP001250 - 2000 μg/mlの濃度範囲内で良好な直線関係があります。
Benchtop CentrifugeBIORIDGETD5実験室環境での迅速かつ効率的なサンプル分離用の卓上遠心分離機
Biological safety cabinetThermo Scientific1379生物安全キャビネットは、空気中の病原体をろ過し、微生物学的作業中の交差汚染を防ぐことで、オペレーター、サンプル、環境を生物学的危険から保護する無菌封じ込め装置です。
Cell Culture Plate,12-WellEppendorf0030721110組織培養処理済み、ふた付き、底面フラット
無菌、検出可能な発熱性の存在なし、RNase & DNase、ヒト & 細菌DNA
非細胞毒性
Cell Culture Plate,96-WellNEST 701001 0714B組織培養処理済み、ポリスチレン、非発熱性、無菌
CellsavingNCMC40100無血清、動物タンパク質フリー
細胞凍結培養基
Collagenase, Type I, powderGibco17100017コラーゲナーゼは、コラーゲンに高頻度で見られるPro-X-Gly-Proの配列で、中性アミノ酸（X）とグリシンの間の結合を切断するプロテアーゼです。
Dispase II, powderGibco17105041Dispase II（中性プロテアーゼ）は、非極性アミノ酸残基のN末端ペプチド結合を加水分解するアミノエンドペプチダーゼです。
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco C11995500BT[+]4.5g/L D-グルコース
[+]L-グルタミン
[+]110mg/L ナトリウムピルビン酸
Evo M-MLV Reverse Transcription KitAGAG11707リアルタイムRT-PCR用専用リバース転写試薬です。Evo M-MLVリバース転写酵素を活用し、短時間で効率的にcDNAを合成することができます。
Exosome Concentration SolutionUmibioUR52111細胞上清からエクソソームを抽出
Exosome Depleted Fetal Bovine SerumUmibioUR50202エクソソームフリーの胎児ウシ血清は、無菌に収集された健康な胎児ウシ血清を濾過することにより得られ、胎児ウシ血清内の内因性エクソソームの99%以上が除去されました。処理前の胎児ウシ血清と同様の細胞成長速度と形態を示しました。
Fetal Bovine Serum, qualified, AustraliaGibco10099141ヘモグロビンレベル： ≤30 mg/dL（通常は≤25 mg/dL）
Human-H36B4Sangon BiotechSB002フォワード：5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3'; リバース：5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Human-IL-23ASangon BiotechSB002フォワード：5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; リバース：5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
Inverted Biological MicroscopeLeicaDMI1培養フラスコやペトリ皿などの容器の壁に付着している生きた細胞や組織を直接観察します。
Minimum Essential MediumGibco C12571500BT [+]L-グルタミン
[+]リボヌクレオシド
[+]デオキシリボヌクレオシド
NcmSpin Rapid RNA Extraction KitNCMM5106このキットは最大3,000,000個の細胞および最大10mgの組織から総RNAを迅速に抽出できます。
Penicillin-StreptomycinNCMC100C5ペニシリン10,000単位/mlと

参考文献

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