酵素結合免疫吸着アッセイを用いたヒト涙膜における性ホルモン検出

サマリー

本プロトコルは、微細毛細血管管を通じて採取されたヒト涙液中の17β-エストラジオールおよびテストステロンを検出・定量するための最適化された酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)法を記述しています。このアプローチにより、涙ホルモンレベルの低侵襲測定が可能になります。

要約

涙層は複雑で多層的な液体で、眼表面の健康、視覚の鮮明さ、病原体や環境ストレスからの保護に不可欠です。主に脂質、水溶液、可溶性タンパク質、粘液から構成され、目の潤滑と保護だけでなく、ドライアイ病(DED)などの眼表面疾患の診断にも貴重な役割を果たします。アンドロゲンやエストロゲンを含む性ホルモンは涙液の組成に影響を与えることが知られていますが、涙液中のこれらのホルモンの測定はサンプル量の少なさや技術的な課題により制限されています。このプロトコルは、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを段階的に適応させ、微細毛細血管チューブで採取した基底裂孔中の17β-エストラジオールおよびテストステロンを検出・定量する方法を説明しています。ワークフローには、サンプル採取、希釈、アッセイ準備戦略を最適化し、低体積の涙液サンプルの分析を可能にします。このプロトコルは、適応されたELISA手法を用いて涙液中のホルモン検出の実現可能性と再現性を示しています。代表的な結果は、プールされたパイロットサンプルから導き出され、生物学的な違いではなくアッセイの性能を示すことを目的としています。このアプローチは、眼表面研究におけるホルモン測定のマトリックスとしての涙液の今後の研究を支援する可能性があります。

概要

涙膜は^眼表面の保護、栄養補給、潤滑に重要な役割を果たします。厚さは約2〜5.5μm、体積は3〜10μLで、健康^な眼2,3では1分あたり1〜2μLの回転率を持ちます。涙腺は涙液の水性成分を分泌し、水、電解質、タンパク質、抗菌因子を豊富に含みます。一方、マイボーム腺は涙液膜の蒸発を遅らせる脂質を産生し、結膜の杯状細胞は眼表面の潤滑を支えるムシンを放出します⁴。涙の生成は主に2つの方法で起こります。1)基礎分泌(安定した涙膜を健康な眼表面に維持)、2)刺激、感情、明るい光などの刺激によって引き起こされる反射分泌です。生化学組成は両者で異なり、最終的に解析のための涙液採取方法に影響を与える可能性があります^5,6。基底裂孔は一般的に、涙膜の安定性や角膜の健康を支えるタンパク質や脂質の濃度が高いのに対し、反射性裂孔は水体積が多く、刺激物を洗い流し眼表面を保護するために希釈されている傾向があります ^7,8,9。

裂痕は炎症を調節し、病原体から防御し、無血管角膜に栄養を供給する役割を果たす^{ため、バイオマーカー研究の}焦点となっています。涙液検査は、^{特に疾患部位}付近で起こる生理的変化をモニタリングするための、血液サンプリングに比べて低侵襲かつ比較的費用対効果の高い代替手段を提供します。このデータを正確に取得するためには、適切な収集^{が不可欠です。}ガラス製微細血管チューブは、刺激を最小限に抑え、涙の希釈を抑えて採取できるため、基底裂孔の採取に広く^{使用されています。}この方法は、チューブを球根結膜や眼瞼縁に接触させないように慎重に位置を整え、裂痕の組成を変化させる反射裂裂のリスクを最小限に抑えます。この方法を用いることで、研究者は眼表面の生理的状態を反映した希釈されていない基底裂孔を得ることができます。これにより、性ホルモンなどの敏感な分析対象物質を定量する信頼性の高い媒体としてサンプルが維持^{されます。}しかし、得られる体積が限られているため、下流の生化学アッセイには分析上の課題が生じます。微小毛細血管管を用いた基底涙採取は通常、サンプルあたり数マイクロリットルしか得られず、標準アッセイとの適合性が制限されます。

人間の眼表面は性ホルモンの標的組織としてますます認識されています^13,14。これを裏付ける証拠としては、涙腺およびマイボーム体のアクシナー細胞、ならびに角膜、結膜、結膜の上皮細胞におけるアンドロゲン受容体(AR)、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)のmRNA転写産物の検出が含まれます¹⁵。さらに、これらの組織ではステロイドゲン酵素をコードするmRNAが確認されており、ステロイド前駆体を局所的に生物学的に活性性ホルモンに変換する能力を示唆しています¹⁶。これは眼表面でのインシチュホルモン合成の可能性を示し、これらのホルモンが涙液膜に検出可能なレベルで分泌されているかどうかという重要な疑問を提起します。

現在の証拠では、性ホルモンが眼表面恒常性維持に不可欠であることが示唆されていますが、正確な分子メカニズムはまだ調査中です(^13,14)。テストステロンなどのアンドロゲンは脂質分泌を刺激し炎症を抑制するようです。したがって、アンドロゲン欠乏症は蒸発性^{ドライアイ}の原因として広く認識^{されています。}対照的に、エストロゲンの役割はより微妙で文脈依存的です13,14,18。涙液の組成や量の調節に関与する一方で、閉経期、妊娠、経口避妊薬使用などのエストロゲン変動は、羊水分泌の低下、涙膜の安定性低下、眼表面炎症としばしば関連しています^19,20。その結果、これらのホルモンバランスを経験する人々は、ドライアイ症(DED)13,14,20のリスクが高い集団に属します。

これらの証拠にもかかわらず、DED患者のホルモン状態のモニタリングは依然として課題となっています。具体的には、全身性血清ホルモンレベル^が眼内の局所ホルモンレベルを正確に反映しているかどうかはまだ確立されていません。この区別は重要で、眼表面組織は性ホルモン受容体およびステロイドゲン酵素の発現を有し、局所的な性ステロイドの合成と代謝を支えることが示^{されているためです}。このクライン内能力は、涙液膜中の局所ホルモン濃度が循環中の血清レベルと有意に異なる可能性を示唆しています¹³。したがって、涙液中のホルモン濃度を直接測定することで、眼表面への局所的なホルモン影響をよりよく理解する必要があります。しかし、分析可能な涙液サンプルの量が少ないため、技術的には困難です。液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)などの高度な分析技術が血液や涙液中のホルモンを高感度で定量するために用いられていますが、この方法は専門的な機器や技術的専門知識を必要とし、すべての研究者が容易にアクセスできるとは限りません(^21,22)。

酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、タンパク質、抗体、ホルモンの検出と定量のために広く確立された技術です。性ステロイドのような小分子の分析においては、このプロトコルは競合結合形式を採用しています。この方法では、涙液サンプル中に存在する標識されていないホルモンが、限られた数の抗体結合部位を酵素標識ホルモン類似体と競合します。この競争により、信号強度(光学密度で測定)は試料中のホルモン濃度に反比例します。実質的に、信号が低いほど標的ホルモン^23,24の濃度が高いことを示します。

ELISAはターゲットを絞った定量化においていくつかの実用的な利点を提供します。コスト効率が良く技術的にもアクセスしやすく、専門的な計測機器を必要とせずに標準的な実験室環境で実装可能です。さらに、ELISAは最小限の試料準備で96ウェルプレート形式での高スループットスクリーニングを可能にし、時間効率と高い再現性を実現^{しています。}しかし、市販のELISAキットは一般的に血清や血漿などの高容量生物サンプルに最適化されており、低容量の涙液サンプルでの性能は明確に定義されていません。この制約に対処するため、プロトコルは試料希釈と取り扱い戦略を最適化し、アッセイの感度範囲内でホルモン検出を可能にします。

本研究では、市販のELISAキットを応用し、ガラスの微細血管チューブで採取した低容量ヒト涙液サンプル中の17β-エストラジオールおよびテストステロンの検出と定量を行う可視化されたプロトコルを提示します。このプロトコルは、限られた涙体量から再現可能なホルモン測定を可能にするため、サンプル採取、取り扱い、アッセイ準備における実用的な修正を強調しています。この研究は、既存のELISA手法をリート流体分析に適用するための実行可能なワークフローの確立に焦点を当てています。このアプローチは、今後眼表面の局所ホルモンレベルを調査する研究の基礎となる可能性があります。

プロトコル

本研究はインディアナ大学機関審査委員会(IRB#1908362633)により承認され、サンプル採取前に全参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。

1. 涙膜コレクション

1. 調理
   1. 収集する涙液量を決定しますが、ELISA結果の統計的信頼性には2回の重複が必要です。
   2. 涙膜保存用に1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブを準備します。
   3. 裂傷を採取するために適切な微細血管チューブを選択してください。まずは3.33μLまたは5μLから始め、眼表面の裂け目が少ない場合はより小さいサイズに変えることをおすすめします。
   4. マイクロ毛細管キットに付属するゴム製の搾乳バルブを準備し、涙液をマイクロ遠心分離機管に移しやすくします。
2. 涙のコレクション
   1. 参加者にまっすぐ前かやや上を見るよう指示します。
   2. 外眼角近くの裂痕半月板の微細毛細血管管を優しく置き、基底裂傷を集めます。
   3. 反射による裂傷をできるだけ防ぐため、球茎結膜や眼瞼の縁との接触を最小限に抑えてください。
   4. チューブに涙を詰めていっぱいになるまで。
   5. 複数回の採集セッションが必要な場合は、24時間以内かつ日中のほぼ同じ時間にセッションをスケジュールし、ホルモンレベルの変動を最小限に抑えましょう。
3. 涙の貯蔵
   1. ゴム製のスクイーズバルブの上部の穴を塞ぎ、マイクロ毛細管をバルブ内に挿入し、開口端をマイクロ遠心分離機チューブ内に差し込み、裂け目が微細毛細管から流れ出るようにします。微細毛細血管管からできるだけ多くの涙液サンプルを取り出すために、さらに球を絞る必要があるかもしれません。
   2. 蒸発を防ぐためにマイクロ遠心機のチューブキャップを閉じてください。
   3. 2,000 × g の温度でベンチトップのマイクロ遠心分離機を使ってチューブを3〜5秒回転させ、サンプルをチューブの底に置いてから保管します。
   4. 分析前に分析物の安定性を保つために-80°Cで保存してください。

2. テストステロンアッセイ

1. テストステロン基準を作成し、プロトコルを守ってください
   1. キットのプロトコルに従い、テストステロン基準、管理、サンプルを準備するための試薬や機器が用意されていることを確認してください。
   2. 脱イオン水または蒸留水でテストステロン標準を再構成し、100 ng/mLのストック溶液を得ます。完全に再構成し、最低15分間放置してください。
   3. 実験当日にテストステロン標準を準備してください。
   4. 標準用に6本のマイクロ遠心分離管を準備し、10 ng/mL管には900 μLの校正器を希釈し、残りの管には400 μLを希釈します。
   5. 100μLのストック溶液を最初のチューブ(10 ng/mL)にピペットで注ぎ込み、十分に混ぜてから次の移送のためにピペットの先端を交換します。
   6. 最初のチューブ(10 ng/mL)の200 μLを次のチューブ(3.33 ng/mL)にピペットで移し、十分に混ぜてからピペットの先端を交換し、最後のチューブ(0.041 ng/mL)までこのステップを繰り返します。
   7. 注:すべてのステップを完了した後、7つの標準濃度が存在します。校正用希釈剤はゼロ標準(0 ng/mL)として使われます。準備された標準は2回の再現に十分すぎるほどです。
2. テストステロンコントロールの準備:低濃度、中濃度、高濃度
   1. 各バイアルは、コントロールキットの分析証明書(COA)に記載された脱イオン水または蒸留水の体積で再構成します
   2. アッセイで使用する前に、各コントロールをキャリブレーターの希釈剤で2倍に薄めておきます
3. サンプルを準備してください
   1. 涙のサンプルを-80°Cから取り出し、氷にかけて解凍します。
   2. サンプルが完全に解凍されたら、ティアサンプルを短時間遠心分離し、すべてのサンプルが室温の管底に3〜5秒浸かるようにします。
   3. 20μLのサンプルと80μLの校正器希釈剤を混ぜて、1回の複製あたり100μLの総体積を得ます。
   4. 信頼性のために2回の複製を計画し、バックグラウンドコントロールのために非特異的結合(NSB)ウェルを計画します。
   5. 注:各サンプルは重複井戸で分析されます。したがって、アッセイを行うには参加者1人あたり40μLの涙液サンプルが必要で、160μLの校正用希釈剤と混合して合計200μLとなります。
4. アッセイ手順
   1. すべての試薬、作業基準、ティアサンプル、管理装置を準備してください。
   2. マイクロプレートフレームから余分なウェルを取り出し、4°Cの乾燥剤パックに復元します。
   3. NSBウェル用に指定されたウェルを除く各ウェルに50μLの一次抗体溶液(青色)を加えます。プレートをアルミホイルで覆います。
   4. プレートは室温で、水平軌道マイクロプレートシェーカー(0.12インチ軌道)で1時間、500±50rpmまたは最も近い設定で培養します。
   5. 合計8回の洗浄に十分な洗浄バッファーを準備し、400 μL/ウェル/洗浄(洗う前に4回、3時間の孵化後に4回洗います)。
   6. 各井戸の内容物を吸引し、ウォッシュバッファーで4回洗います。
   7. NSBウェルに100μLの校正器希釈剤を加え、標準ウェルはゼロにします。
   8. 指定された井戸に標準、対照、準備されたティアサンプル100 μLを追加してください。
   9. 各ウェルに50μLのテストステロン結合体を加え、ピペットで十分に混合します。
   10. 室温で3時間、水平軌道マイクロプレートシェーカー(軌道0.12インチ)を500±50rpmまたは最も近い設定で培養します。
   11. 各井戸を吸引し、ウォッシュバッファーを使って4回洗います。
   12. 使用直前に、色剤Aと色剤Bを1:1の比率で混ぜて基質溶液を準備してください。1井戸あたり200μLを割り当てます。基質追加前に残留洗浄バッファーを完全に吸引すること。
   13. 準備後15分以内に各ウェルに200μLの基質溶液を加えます。作業台の上で室温で30分間孵化します。光から守るためにアルミホイルで覆いましょう。
   14. 各井戸に基質溶液と同じ順序で50μLの停止溶液を加えます。各ウェルをよく混ぜると、色が青から黄色に変わります。
   15. ストップ溶液を加えてから30分以内にマイクロプレートリーダーを使って450 nmおよび560 nmの光学密度を測定してください。
   16. 注:メーカーの説明書では、基準波長は540 nmまたは570 nmと推奨されています。このプロトコルでは、マイクロプレートリーダーの最も近い波長として560 nmの波長が使用され、背景信号補正や光学的不完全さの軽減に用いられていました。
5. 計算方法
   1. 450 nmで測定された光密度から560 nm(基準波長)で測定された光密度を差し引きます。
   2. 標準、試料、対照の各読み取り値から平均NSB光密度を差し引き、重複測定の平均を計算します。
   3. 4パラメータロジスティック(4PL)モデルを用いてデータをフィッティングして標準曲線を生成します。
   4. 標準曲線からサンプル値を補間してテストステロン濃度を算出します。
   5. サンプルの希釈率を1:5を考慮して希釈係数5を適用して計算濃度を調整します。
   6. 重複間の変動係数(CV)を計算して測定を検証し、20%を超えないようにしてください。
      1. 注:%CV = (標準差/平均) × 100

3. エストラジオールアッセイ

1. エストラジオール標準、管理、サンプルの作成
   1. キットのプロトコルに従い、標準、管理、サンプルの準備に必要な試薬や機器が用意されていることを確認してください。
   2. すべての試薬や材料は使用前に室温に到達させてください。
   3. 実験当日に新しい試薬を準備してください。
   4. 標準と管理はすぐに使える状態です。汚染を最小限に抑え、取り扱い中の温度変化を抑えるために、現在のアッセイに必要な量だけをアリコットで取り入れます。
   5. 6種類の標準(No. 0–5)を準備し、標準0は0 pg/mLを表し、キットに付属する1つの対照サンプルを含めてください。
   6. 凍結サンプルは氷にして-80°Cから解凍します。
   7. ティアサンプルを回転させて、すべてのサンプルがチューブの底にあることを確認します。
2. アッセイ手順
   1. マイクロプレートから余分なウェルを取り出し、4°Cの乾燥剤パックに復元します。
   2. 20μLの標準物質、制御菌、サンプルを井戸に加えます。
   3. 注意:各標準およびサンプルは2回の複製でアッセイされるべきです。
   4. 均一な分布を確保するために、ピペットでウェルに投入する前に、すべての標準物質、コントロール製品、サンプルを十分に混合してください。
   5. 試験ウェルに17ベータエストラジオール-HRP共役酵素160 μLを加えます。
   6. 基質用の空洞を空けてください。
   7. インキュベーターに入れる前に、アルミホイルでウェルを覆ってください。井戸内の溶液はアルミホイルに蒸発することがあります。
   8. 37°Cで2時間培養します。
   9. 孵化期間中は洗浄液10倍からウォッシュバッファーを準備します。
   10. インキュベーションが完了したら、アルミホイルを取り外し、井戸から液体を吸引します。
   11. 各井戸をウォッシュバッファーで3回洗います。洗濯ごとに>5秒浸けてください。
   12. すべてのウェルに100μLのTMB基板溶液を加えます。
   13. 皿全体をアルミホイルで覆い、室温で正確に30分間培養します。
   14. 前に追加されたTMB基板溶液と同じ順序かつ速度で、すべての井戸に100μLのストップ溶液を加えます。
   15. マイクロプレートを優しく振ると、試薬が青から黄色に変わります。
   16. ストップ溶液を加えてから30分以内に450nmの吸収を測定してください。
3. 計算方法
   1. すべての標準、試料、制御の読み取り値からブランク井戸の吸収を差し引いて、背景信号や光学的不完全さを補正します。
   2. 重複した測定値の平均を計算してください。
   3. 4パラメータロジスティック(4PL)を用いて最適適合標準曲線を生成します。
   4. 標準曲線からサンプル値を補間してエストラジオール濃度を決定します。
   5. 重複間の変動係数(CV)を計算して測定を検証し、20%を超えないようにしてください。
      1. 注:%CV = (標準差/平均) × 100。

4. RとRStudioを用いたデータ解析

1. RとRStudioをインストールし、データ解析を行う前に 材料表 に記載された必要なパッケージをインストールしてください。
2. 標準、制御、試料の光学密度測定値を解析ソフトウェアにインポートします。
3. アッセイで指定された波長補正を適用してデータを前処理します。次に、空白値またはNSB値を差し引き、重複測定値の平均を計算します。
4. 独立変数を集中、応答変数を光学密度をとする4パラメータロジスティック回帰モデルを用いて標準曲線をフィッティングします。
5. drcパッケージのdrm()関数を用いてRで曲線フィッティングを行い、4PL回帰ではfct=LL.4()と指定し、入力は集中度と光密度データです。
6. 試料濃度を解釈する前に曲線フィットの品質(例:R² > 0.99または許容される適合度)を確認しましょう。
7. 適合した標準曲線に基づくED()関数を用いて逆予測し、適合モデルに基づく試料の光学密度値に対応する有効線量を指定します。
8. 適切な希釈係数(例:1:5の場合は×5)を適用して計算濃度を調整します。
9. 適切な単位(例:ng/mLやpg/mL)で最終ホルモン濃度を報告し、標準曲線との整合性を確保し、処理済みデータをエクスポートしてさらなる分析や可視化を行います。

結果

パイロット涙斑研究

合計20名(45歳から63歳)の女性がこの研究に含まれました。DEDの分類は症状と少なくとも1つの臨床症状に基づいていました。具体的には、すべてのDED参加者が眼表面疾患指数(OSDI)スコア>12であり、少なくとも片目が蛍光涙分解時間(TBUT)が<5秒、角膜蛍光染色スコア(CFSS)が>3(NEIスケール²⁵)でした。非DEDと分類された参加者は、OSDIスコア<12、両眼のTTOTが> 5、両眼でCFSSが≤3でした。除外基準には、現在のコンタクトレンズ着用者、30日以内の眼科薬使用、眼感染症、結膜瘢痕、妊娠または自己申告による授乳が含まれていました。各参加者の両目からガラス製の微細血管チューブを使って基礎涙液サンプルを採取し、参加者レベルでプールして総サンプル量を増やしました。1回の採取セッションでは、参加者一人あたり約5〜20μLの涙液が得られ、個々の涙液の産生量に応じて提供されました。ナトリウムフルオレ...

ディスカッション

涙液の収集と解析により、眼表面の健康状態の科学的評価や潜在的なバイオマーカーの特定が容易に行われます^10,22。本プロトコルは、一般的に用いられているELISA手法を成功裏に適応させ、性ホルモンのティアスクリーンサンプルを解析した例を説明しています。この方法は、裂痕分析の主な限界である比較的少ない裂傷体積に対処するために開発しました。これらの微量体積制約に対応するようにワークフローを最適化することで、正確なホルモン定量に必要な感度を損なうことなく信頼性の高い検出を実現します。

このプロトコルでは、検出のために1アリコートあたり最低20μLが必要であり、信頼性のために推奨される重複サンプルは参加者1人あたり少なくとも40μLが必要です。これは複数回の採集セッションが必要で、通常は1回のセッションで

材料

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この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
17 ベータエストラジオルELISAキット	Abcam	ab108667
アルミニウム箔	Reynolds Wrap	10900000154	光から試薬を保護するためにキッチン用に利用可能なアルミニウム箔
マイクロキャピラリーチューブ3.33 µL	Drummond	1-000-0033	液体移送用のスクイーズバルブ付き
マイクロキャピラリーチューブ5 µL	Drummond	1-000-0050	液体移送用のスクイーズバルブ付き
マイクロ遠心機	Benchmark Scientific	C1012
マイクロ遠心管1.5 mL	Fisher	05-408-129
マイクロプレートリーダー	Promega	GM3000
回転マイクロプレートシェイカー	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
Rコンピューター言語	Posit Software, PBC (旧RStudio Inc.)	Rバージョン4.5.1	https://cran.r-project.org/ を通じてRstudioの前にR言語をダウンロード
RStudioソフトウェア	Posit Software, PBC (旧RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1ビルド524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
Rパッケージ "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (旧RStudio Inc.)		Rstudioでパッケージをインストール
テストステロンコントロールキット	R&D Parameter	QC165	ELISAキット（KGE010）とは別に販売
テストステロンELISAキット	R&D Parameter	KGE010

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