リンパおよび血液血管の同時サンプリングによる肝輸送経路評価のための包括的なラットモデル

サマリー

この実験プロトコルは、肝リンパ管カニューレラットモデルを記述し、肝リンパおよび血管排出の直接的かつ定量的な評価を可能にします。このモデルは肝リンパと全身血を同時にサンプリングし、肝輸送、代謝、免疫シグナル伝達を調査し、薬物薬理動態学や肝臓特異的生物学の研究を支援します。

要約

肝臓は栄養素、異種生物、循環する免疫メディエーターを処理する中心的な代謝および免疫学的ハブです。物質は腸から門脈を経て血液を受け取り、肝動脈を経由する全身循環から血液を受け取る正弦波毛細血管を通じて肝細胞やその他の肝細胞に到達します。正弦波毛細血管からの血漿ろ過液はDisseの空間に流れ込み、そこで代謝変換を起こしたり、免疫監視に参加したり、リンパ管に流れ込んで肝リンパを形成したりします。肝リンパや血液のサンプリングは、肝輸送、代謝過程、免疫活動の詳細な解析を可能にします。肝リンパ管、頸動脈、頸静脈の3つの異なるカニュレーション部位を通じて肝リンパ流出と全身血液を同時に採取できる外科用ラットモデルが記述されています。肝リンパおよび動脈カニュレーションは連続的なサンプリングを可能にし、頸静脈カニューレは連続的な水分補給や液体サポート、または静脈血の採取に使用でき、動脈血と静脈血の比較を可能にします。カニュレーションに成功すると、麻酔ラットでは肝リンパ流量が約0.1 mL/hとなり、動脈血と静脈血を同時に採取しながら最大8時間の連続リンパサンプリングが可能になります。このセットアップにより、全身動脈血と肝リンパ流出の直接比較が可能となり、肝臓の輸送とクリアランス、さらに代謝および免疫シグナル伝達の包括的な検査が可能になります。モデルをさらに拡張するために、手術終了時に肝動脈および門脈の終端サンプリングを行い、肝の流入・流出・リンパ排出を直接比較することが可能です。最終的に、これらの技術は薬物薬剤動態学、栄養素流動と代謝、肝臓特異的応答など、さまざまな病態生理条件下での肝プロセスを評価するための多様なプラットフォームを提供します。

概要

肝臓は栄養処理、異種生物解毒、免疫監視を担う中心的な代謝および免疫学的器官です。肝臓は体内で最大のリンパ産生器官です。大型哺乳類の研究では、リン^パ流量の25%〜50%を占めると示唆されています^1,2。齧歯類では、カニュレーション研究により胸椎リンパ流の約10%〜20%が肝臓から来ていることが^{示されています。}肝リンパは、肝実質内の正弦毛細血管の有孔内皮に濾過された血漿から発生します。この濾過は肝細胞と正弦波内皮細胞の間の間質区画であるDisseの空間に集まります。その後、ろ過液はモールの空間を通り、門脈リンパ毛細血管に入り、そこが集積血管へと収束し、肝門と乳巣へと流れ込み^ます。

肝リンパ系は解剖学的に門脈、サブカプセル、上腫塊ネットワークに分かれています ^6,7。最近の体積イメージング研究では、肝リンパが主に門脈路に限定された非常に分岐した血管内皮成長因子C(VEGF-C)依存ネットワークを形成していることが示されています。このネットワークは主にリンパ毛細血管で構成されており、門脈へ逆行して流れます。一方、肝表面および中心静脈領域に分布する被膜下リンパおよび上腫状リンパは、追加の排液経路となります。ヒトの死後画像診断により、肝静脈に沿って密集したリンパ管ネットワークが明らかになり、門脈周囲リンパ管と肝静脈リンパが共同で肝リンパ流出を調節していることが示^{されています。}

肝リンパは、代謝および免疫の過程を反映する血漿由来の超濾過液です ^9,10。生化学的解析により、肝リンパにはアルブミン、リポタンパク質、サイトカイン、肝実質活性から得られる代謝物^{が含まれており、}これは他の組織で報告されているリンパ液の一般的なプロテオームプロファイルと一致しています¹⁰。初期の研究では、肝リンパには異なるリポタンパク質クラスが含まれており、高密度リポタンパク質(HDL)が優性の割合を占めていることが示されました。^これは肝臓がHDL合成とリモデリングにおいて中心的役割を果たしていることと一致しています。特に、肝リンパは腸間膜リンパに比べてHDLおよびコレステロールエステルが豊富であることが示されており、脂質輸送およびコレステ^{ロール輸送逆}転に明確に寄与していることが示されています。さらに、肝リンパは免疫学的な導管として機能し、免疫媒介物質、抗原提示細胞、そして肝微小環境と全身免疫を結びつける細胞外小胞を運び^ます。

肝リンパの形成や排液の変化は肝疾患の主要な特徴です。肝硬変および門脈高血圧症では、正弦波圧の上昇によりリンパ産生が数倍に増加し、排尿能力を超えるとリンパ管拡張症、線維化、腹水を引き起こします。慢性肝損傷はまた、VEGF-C/VEGFR-3依存性リンパ管形成を促進し、過剰または異常なリンパ管再形成が肝炎、浮腫、脂質蓄積に寄与します ^9,12。さらに、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)および肝細胞がんでは、肝リンパ密度の増加が疾患進行および転移と相関することが示されています^13,14。

肝リンパが中心的な生理学的・臨床的役割を果たしているにもかかわらず、純粋な肝リンパの分離に技術的な課題があるため、実験研究では研究が十分に行われていません。胸部および腸系膜リンパ収集モデルはより広く記述されていますが、これらは肝輸送機構の間接的な洞察に過ぎません。この分野の制約は、ラット肝リンパ管のカニュレーションモデルを開発し、肝リンパ4を直接採取できるようにすることで対処^{されました。}このアプローチを用いると、静脈投与による治療用タンパク質のリンパからの取り込みの大部分が肝臓と腸間膜で行われることが示されました。これらの発見は、肝リンパが血液系とリンパ系間の高分子交換の重要な経路であることを強調し、生物薬の薬理動態や分布に重要な示唆を与え^{ています。}

残されたギャップを埋めるために、本研究では肝リンパ管、頸動脈、頸静脈のカニュレーション により 肝リンパと全身血液を同時に採取できる包括的なラットモデルを記述しています。このアプローチにより、肝間質および全身区画間の溶質輸送および交換をリアルタイムで評価でき、肝輸送、代謝、免疫シグナル伝達、生理学的および病理学的条件下での薬物処理を調査するための堅牢な実験的プラットフォームを提供します。また、肝動脈および門脈の終端サンプリングも任意で含み、肝の流入、流出、リンパ管排出の直接比較を可能にします。

図1。リンパおよび血液同時採取のための多重カニュレーションモデルの概説。 頸動脈、頸静脈、肝動脈、肝リンパ管、門脈からの同時採取を示す包括的なカニュレーションモデル。(A) 頸動脈を断続的に採血するためにカニューレ(カニューレ)を挿入します。(B) 外頸静脈をカニューレして連続的な生理食塩水注入を行い、水分補給とサンプリング中の体液損失を補います。(C) 肝リンパ管に平行に走る総肝動脈がカニューレされ、末期血液採取が行われます。(D) 肝リンパ管をカニューレして連続的なリンパ採取を行う。(E) 末期血液採取のために門脈を針刺し で アクセスします。(A)、(B)、(D)で示された手順は、末端サンプリングの前に行われ、その後(C)肝動脈サンプリング、さらに(E)門脈サンプリングが行われます。略称:EJV(外頸静脈);CA、頸動脈;SVC、上腔静脈;下腔静脈(下腔静脈);Ao、大動脈;CHA(総肝動脈);HL、肝リンパ管;腸間膜リンパ管(ML);SMA(腸系膜上動脈);PV、門脈。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコル

動物を対象としたすべての実験手順は、モナシュ薬学研究所動物倫理委員会(倫理ID #46283)によって審査・承認され、オーストラリア・ニュージーランド動物研究・教育管理評議会(ANZCCART)ガイドラインおよびオーストラリア科学目的動物ケア・使用規範(National Health and Medical Research Council, National Health and Medical Research Council)に厳格に従って実施されました。 オーストラリア)¹⁵.

動物モデル:オスまたはメスのアウトブレンドアルビノ、 Rattus norvegicus、 またはSprague–Dawley(SD)ラット(体重250〜350g)を使用。動物は認可された実験動物供給業者(モナシュ動物研究プラットフォーム)から取得され、個別に換気されたケージで、温度(22 ± 2°C)と12時間の明暗サイクルのもとで飼育され、実験前に自由に食物と水を利用できます。動物は手術の少なくとも1週間前から順応させ、ストレス関連の生理的変動を最小限に抑えました。

肝リンパ管、頸動脈、頸静脈カニュレーションモデルを記述し、肝リンパと全身血液の同時採取を可能にします。肝動脈および門脈の終端サンプリングは、肝流入とリンパ流出の比較解析のために麻酔下で任意で実施されることもあります。使用される試薬や機器は材料表に記載されています。

1. 手術前日の準備

1. 特定の実験プロトコルに応じて、ラットを一晩断食してください。常に水に自由にアクセスできるようにしてください。
2. リンパ採取時に静脈輸液用の無菌生理食塩水を準備してください。採取時間(通常3〜5時間)と、リンパや血液の収集による体液損失、さらに尿量などの生理的損失を補うための推奨輸注速度1.5〜3.0 mL/hに基づき必要な量を決定します。
3. 肝リンパ管、頸動脈、頸静脈カニュレーション用のポリエチレンカニューレを3本準備します。
   1. 肝リンパ管
      1. 外径0.8mm(外径)、内径0.5mm(内径)を30〜35cmにカットします。長さが張りなく集められるようにしてください。
      2. 挿入先端を約45°の角度で無菌の外科用刃で面取りし、挿入を容易にします。
   2. 頸動脈
      1. 0.8mmの外径、0.5mmの内径カニューレを20〜30cmにカットします。内端から約2〜2.5cmの位置にマーキングして挿入深さを示します。
   3. 頸静脈
      1. 0.8mmの外径、0.5mm内径または0.96mm外径、0.58mm内径カニューレを50cm以上にカットします。挿入深さは内端から1〜1.5cmの位置にマークしてください。長さが点滴ポンプに張力なく届くようにしてください。
4. 無菌水中に0.1%EDTAまたは無菌生理食塩水に20 IU/mLのヘパリンを含む抗凝固液を準備します。
5. 抗凝固液を1mLの注射器に注ぎ、0.8mmのO.D.カニューレには25Gの針、または0.96mmのO.D.カニューレには23Gの針をつなぎます。
6. 各カニューレは内部容積の約3倍で洗浄し、気泡が残らないようにします。
7. カニューレに抗凝固剤を詰め、針と注射器で一晩塞いでいます。抗凝固剤で事前に浸けることで血栓形成が最小限に抑えられます。
8. 血液とリンパの採取チューブを用意してください。サンプル採取後に抗凝固液を加え、最終濃度は1 mg/mL EDTAまたは10 IU/mLヘパリンとなります。

2. 手術直前の準備

1. すべてのカニューレに抗凝固剤で洗浄し、通気を確認します。気泡が存在しないか確認してください。
2. 誘導チャンバーで酸素1L/分の5%イソフルランを用いてラットに麻酔を誘導します。
3. 呼吸を監視し、呼吸数が約1.5回/秒(約90回/分)に落ち着いているか確認し、十分な麻酔深度を示してください。
   注意:イソフルランは揮発性麻酔薬であり、労働への曝露を最小限に抑えるために、適切に換気された麻酔システムやフルーム内で使用してください。
4. ラットを加熱した手術用パッド(37°C)に移し、鼻錐 から 0.4〜0.6 L/minで酸素に1–3%のイソフルランを投与して麻酔を維持します。
5. 角膜反射や足のつまみ反射がないことで十分な麻酔深度を確認します。手術およびリンパ採取期間中は麻酔を維持してください。
   注意:手術中の痛みを防ぎ、動きによるカニューレの脱落を防ぐためには、継続麻酔が不可欠です。
6. 右腹部の象限(肋骨の約2cm下)を含む手術部位を剃ります。
7. 手術部位は0.5%クロルヘキシジンで消毒し、その後70%エタノールで消毒します。

3. 頸動脈のカニュレーション

注意:頸動脈カニュレーションは、頸静脈カニュレーションの前後に行うことができます。

1. 背側位置と頸椎切開は同じまま維持してください。
2. 頸動脈を高くするために、首の下に小さなサポート(例:3 mLの注射器)を置きます。
   注意:このステップは任意です。
3. 首の筋肉を分離し、皮膚表面から約1cm下の頸動脈を露出させます。
4. 湾曲した虹彩鉗子を使って動脈を隔離してください。隣接する迷走神経を特定し、優しく切り離して神経の損傷を防ぎましょう。
5. 動脈の下に直線のグレーフェ鉗子を置いて血流を塞ぎ、その下に4-0シルク縫合糸を2本通します。近位(頭蓋)縫合糸はしっかりと結びます。
6. 動脈表面に小さな切開を入れます。
7. レンズの鉗子先端で血管フラップを優しく持ち上げ、カニューレ挿入のために血管腔を安定させます。
8. カニューレをあらかじめ2〜2.5cmの深さに挿入します。軽度の逆流を想定してください;過剰の場合は、再閉塞して清掃してから進めてください。
   注意:血管穿刺やカニュレーションは鋭利な器具を使ったもので、偶発的な怪我を防ぐために慎重に行う必要があります。
9. 抵抗を感じたり皮下腫れを感じたりせずに、少量の血液を優しく抽出し、抗凝固液をカニューレに戻して正しい位置を確認しましょう。
10. カニューレを縫合糸で固定し、外側の端をプラグで封じます。
11. 頸動脈カニュレーション後、麻酔を維持しながら一時的に手技を中断することもあります。
12. 首の傷は無菌縫合で閉じてください。頸動脈の隔離と成功したカニュレーションの概要は 図2に示されています。

図2:頸動脈カニュレーション。 (A) 頸動脈を挟む対になった首の筋肉(オレンジの矢印)。唾液腺(青い矢印)は頭蓋骨に隠れています。(B) 露出した頸動脈は皮膚表面から約1cm下にあります。唾液腺(青い矢印)は頭蓋骨に隠れています。(C) カニューレ挿入前の外科的セットアップ、直線的なグレーフェ鉗子と2本の絹縫合糸で動脈を隔離し、上部端が結ばれた状態で血流を閉塞した様子。(D) 約2cmのカニューレが頸動脈に無事挿入(黄色の矢印)。頸動脈カニューレは緑の矢印で示されています。(E) カニューレに血液を吸い込むことで頸動脈のカニュレーションが成功したことが確認されました。(F) 頸動脈とカニューレの周りに3本の縫合糸(サイズ4-0)を結び、固定用に紫の矢印をつけます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 頸静脈のカニュレーション

1. ネズミを背中横に位置させ、首を伸ばし、頭をわずかに左に向けます。
2. 鎖骨上の頸静脈はその位置と目に見える血流で特定します。鎖骨から気管に向かって1〜1.5cmの斜め切開を入れます。
3. 皮下組織を鈍く剥離して静脈を露出させます。
4. 湾曲した虹彩鉗子を使って静脈を周囲の結合組織から分離します。静脈の下に鉗子を入れて隔離を確認しましょう。
5. 露出した区画の両端に4-0シルク縫合糸を2本置きます。頭蓋(上)縫合糸をしっかりと結び、血流を遮断します。
6. 逆流を防ぐために、直線のグレーフェ・ピンセットを静脈の下に置き、ハンドルを注射器やサポートに置きます。
7. アイリスハサミを使って、アイリスハサミを使って、静脈の上部にわずか(~1 mm)の切開を行います。
8. レンズの鉗子先端で血管フラップを優しく持ち上げ、カニューレ挿入のために血管腔を安定させます。
9. 虹彩鉗子を使ってカニューレの先端を切開部に挿入し、あらかじめ示された深さ(1〜1.5cm)まで進めます。
10. カニューレが安定したら閉塞を解除し、血流を促します。
    注: 静脈逆流を防ぐために、安定した握りを保ちましょう。出血が発生した場合は、直ちに再閉塞し、フィールドを清掃してから進めてください。
11. 抵抗を感じたり皮下腫れを感じたりせずに、少量の血液を優しく抽出し、抗凝固液をカニューレに戻して正しい位置を確認しましょう。
12. カニューレは近位端と遠位端の両方に縫合糸で固定します。
13. 外部のチューブを一時的に塞ぎ、注射器を外してカニューレをプラグで封じます。
14. 切開部を温かい生理食塩水で湿らせたガーゼで覆い、頸動脈のカノレーションが完成するまで守ります。頸静脈の隔離とカニュレーションの代表的な画像は 図3に示されています。

図3:頸静脈カニュレーション。 (A) 頸静脈(黒い点の輪郭)は鎖骨の皮膚のすぐ下に位置します。確立された頸動脈カニューレは頸静脈付近に観察できます(緑色の矢印)。(B) 頸静脈は2本の絹縫合糸で隔離されている。上端は結ばれます。(C) カニューレの約1cmが頸静脈に無事挿入されます(黄色い矢印)。頸静脈カニューレは青い矢印で示されています。頸動脈カニューレは緑色の矢印で示されています。(D) 頸静脈とカニューレの周りに3本の縫合糸(サイズ4-0)を結び、固定のために(紫色の矢印)。頸静脈のカニュレーション成功は、滑らかな生理食塩水注射によって確認されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

5. 肝リンパ管のカニュレーション

1. ラットを背側横たわりの姿勢で外科用顕微鏡で位置付けます。
2. 肋骨の約1.5〜2cm下、中央線から右脇腹にかけて4〜5cmの水平皮膚切開を行います(図4A、B)。
3. 皮膚を引き戻し、外腹斜筋と内腹斜筋に合わせた切開を入れます。
4. 出血を防ぐために、大きな血管に接触した場合は焼灼または結紮してください。
5. 生理食塩水で湿らせた綿棒を使って器官を優しく再配置します。肝臓は横隔膜側、胃は左側、小腸は下側に移動させます。
6. 臓器は生理食塩水に浸したガーゼで引き戻しておきましょう。切開部位と臓器の位置は 図4Cに示されています。
7. 確立された解剖学的ランドマークを用いて肝リンパ管(直径~0.6 mm)を特定します。導管は肝動脈に平行かつやや尾側を通り、右腎の内側、下大静脈に隣接しています。
8. 肝リンパ管の外観を観察してください。通常は半透明で細く見えます。
9. 肝リンパ管は、キロミクロン含有量のため通常は不透明または白色に見える腸系膜リンパ管と区別してください。したがって、腸間膜リンパ管は頭蓋内に位置する肝リンパ管の特定を助ける解剖学的なランドマークとして機能します。
10. リンパ管と下静脈の上に覆う結合組織を、直線のグレーフェ鉗子で除去します。
11. 右腎臓の下の脂肪床に直線のグレーフェ鉗子を挿入して大静脈の下に通路を作ります。肝リンパ管と平行に、先端が大静脈の反対側から出てくるまで前進します。
12. 準備済みカニューレの外端を直線的なグレーフェ鉗子で掴み、大静脈の下にできたトンネルを通して引っ張り、先端が反対側から出てくるまで続けます。
13. Halsted-Mosquito製血鉗子を使い、25Gの針の先端を約90°に曲げます。曲げた針で右側(操作者に最も近い)の肝リンパ管を刺します。
    注意:リンパ管穿刺時に鋭い針を扱う際は、偶発的な怪我を防ぐために注意してください。
14. カニューレに空気泡のない抗凝固液で満たしてください。面取り端をダクト内に約2mm挿入します。
15. カニューレの外端のリンパ流(~ 100 μL/h)を観察してください。流れが見られない場合は、カニューレを調整または再挿入してください。
16. リンパ流が確認されたら、カニューレを塞ぎ、挿入部位を固定するために少量の獣医用接着剤を滴布します。乾いたら、チューブ内のリンパ流を確認します。
17. ガーゼを外し、臓器を元の位置に戻します。
18. 抗凝固液を含む採取チューブをカニューレ出口の下に置きます。リンパがチューブ内に滴るように流れているか確認してください。
19. 腹壁を縫合し、内腹斜筋、外腹斜筋、皮膚層を順に縫合します。肝リンパ管の同定と成功したカニュレーションは 図5に示されています。
    注意:肝リンパ管カノレーションが成功した後は、麻酔と水分補給が維持されている間、リンパ採取を開始する前に一時的に手技を一時停止することがあります。

図4:肝リンパ管への露出。 (A) 切開の解剖学的ランドマーク:右肋骨の1.5〜2cm下を示す。(B) 皮膚と腹筋を切開し、内臓を露出させる。(C) 臓器の位置が肝リンパ管を露出させる。肝臓は横隔膜の方へ移動し、胃は動物の左側に位置し、小腸は下側に隠れています。肝リンパ管は肝動脈(緑の矢印)と腸系膜動脈(青の矢印)の間に位置しています。L:肝臓;SI:小腸;下腔静脈:下腔静脈;RK:右の腎臓です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:肝リンパ管の特定とカニュレーション。 (A) 臓器の位置変更後、周囲結合組織を除去する前に、リンパおよび動脈構造を観察できます。肝動脈(緑の矢印)は隣接する肝リンパ管(黄色の矢印)に対して頭蓋内側に位置しています。腸間膜リンパ管(紫の矢印)は腸間膜動脈の上(黒い点の輪郭)の上に位置しています。これらの構造は下大静脈に垂直に伸びています。下腔静脈:下腔静脈;RK:右の腎臓です。(B)周囲の結合組織を除去した後、肝リンパ管(黄色の矢印)がはっきりと確認できます。肝リンパ管は肝動脈(緑色の点線)に平行に走り、頭蓋方向には腸間膜リンパ管(紫の矢印)および腸間膜動脈(黒い点線)に対して走っています。(C) カニューレ(白い矢印)はリンパ管に開けられた小さな穴(オレンジの矢印 )を通じて 肝リンパ管(黄色の矢印)に挿入されます。腸間膜リンパ管(青い矢印)は視覚的に確認できます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. 術後期間

1. 肝リンパカニューレーションが成功した直後、頸静脈カニューレを通じて1.0〜2.0 mL/hで無菌生理食塩水を注入して再水分補給を開始します。
2. リンパ採取中は点滴を継続してください。または、胃カニューレや十二指腸カニューレ を用 いて補水を行い、必要に応じて静脈カニューレを静脈採血に使うことも可能です。
3. 採集期間中、動物を温めた手術用パッド(37°C)上で麻酔下に置いてください。
4. 鼻錐 を通じて イソフルラン麻酔を維持しながら、呼吸パターンや反射反応を観察し、呼吸数と麻酔深度を観察します。
5. 静脈カニューレ を経 由した持続的な生理食塩水(1.0–2.0 mL/h)による水和維持が行われました。
6. 生理的障害を最小限に抑えるため、最終採取前の総血液量は、機関動物倫理ガイドラインに従い推定循環血量の<10%に制限されました。
7. 肝リンパを抗凝固剤を含むチューブに継続的に集めます。採集チューブは毎時間または必要に応じて交換してください。
8. 指定された時間に動脈血サンプルを採取してください:
   1. 外部チューブを一時的に塞ぎ、空の注射器を取り付けます。
   2. チューブが満たされるまで血液を抜きましょう。
   3. サンプル採取のために新しい注射器に交換し、各指定の採集時に約100〜200μLの動脈血を採取します。
   4. 採集後は抗凝固液でカニューレを洗い流してください。
   5. カニューレをプラグで塞ぎます。
9. サンプル採取が完了した後は、肝動脈および門脈の終端サンプリングを行うか、頸動脈または頸静脈カニューレ から ナトリウムペントバルビトン(>100 mg/kg)を用いて人道的にラットを殺すかのいずれかです。

7. 肝動脈および門脈の終端サンプリング

1. リンパおよび血液採取が完了したら、深部麻酔を維持し、呼吸が安定していることを確認してから末期血管採取に進みます。
2. 腹部の切開部を慎重に再開けて上腹部を露出させます。
3. 肝臓を横隔膜、左側の胃、小腸の下側に優しく引き込み、生理食塩水で湿らせたガーゼで肝リンパ管をカヌレーションします。
4. 肝リンパ管に平行かつ尾側を走る肝動脈を特定します。
   注:動脈は門脈よりも小さく淡く見え、より脈動性の流れを示します。
5. 0.61mmの外径、0.28mm内径のポリビニルカニューレを準備し、抗凝固液であらかじめ充填し、気泡のないものを用意します。
6. 湾曲した虹彩鉗子を使い、肝動脈の短い区間を切り離し、その下に4-0シルク縫合糸を置きます。
7. 動脈を優しく持ち上げ、最初の先端に2本目の縫合糸を挿入します。遠位縫合糸は逆流を抑えるために結び、近位縫合糸は後で閉鎖できるように結ばずにおきます。
8. 細かい先端のマイクロハサミを使い、縫合糸の間の動脈壁に約0.5mmの小さな横切開を開けます。
9. デュモン鉗子の先端で血管フラップを優しく持ち上げ、カニューレ挿入のために血管内腔を安定させます。
10. ポリビニールカニューレの面取り端を開口部に挿入し、約2〜3mm進めます。
11. 血管とカニューレの両方に近位縫合糸を結んでカニューレを固定します。
12. カニューレへの脈動性血流を観察するか、少量の鮮やかな赤色動脈血を優しく吸引して正しい位置を確認します。
13. 抗凝固剤を含むあらかじめラベル入りのチューブに0.5〜1mLの血液を採取します。
14. 採取後、カニューレを抜き、両方の縫合糸を締めて止血を達成します。肝動脈の曝露とカニュレーション手術は 図6に示されています。
15. 肝動脈に内側かつ垂直に走る門脈を特定します。門脈は肝動脈に比べて直径が大きく、色も濃いです。
16. 抗凝固液であらかじめフラッシュされた1mLの注射器に23Gまたは25Gの針を当てます。
17. 血管の崩壊や裂け目を防ぐために、針のベベルアップを浅い角度(約20°〜30°)で門脈内に挿入します。
18. 必要な血液量を優しく吸引してください。
19. 門脈穿刺は末期であるため、動物が深麻酔下にある間に、検体採取直後に頸動脈または頸静脈カニューレ から >100 mg/kgのペントバルビトンナトリウムを投与し、動物を人道的に殺害します。門脈の位置と終端採取方法は 図7に示されています。
    注意:ペントバルビトンナトリウムは規制薬物であり、機関の規則と適切な安全手順に従って取り扱い・投与されるべきです。
20. オーストラリア動物管理・使用基準(NHMRC)¹⁵ およびANZCCARTガイドラインに従い、死体処理前に呼吸停止および心拍活動による死亡を確認しること。

図6:肝動脈の特定およびカニュレーション。 (A) 肝動脈の露出(緑の矢印)。肝動脈は腸間膜リンパ管(黒い点の輪郭)に隣接し、下腔静脈に垂直に位置しています。下腔静脈:下腔静脈;L:肝臓。(B) 湾曲鉗子を用いた肝動脈の分離。(C) 0.61mm×0.28mmのポリビニールカニューレ(オレンジ色の矢印)を肝動脈(緑色の矢印)に成功裏に挿入し、末端動脈血液採取のために4-0シルク縫合糸で固定すること。腸間膜リンパ管(黒い点の輪郭)が視覚的に確認できます。PV:門脈。(D) カニューレが固定された後、血液をカニューレに取り込んでカニューレの開通性を確認します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:門脈の同定および終端サンプリング。 (A) 門脈(25G針で示される)は肝動脈(白い点線)と胆管(黒い点線)の間に位置します。門脈は肝動脈よりも大きく暗く見え、末期血液採取のために深麻酔下でアクセスされます。PV:門脈;下腔静脈:下腔静脈;L:肝臓;SI:小腸;RK:右の腎臓です。(B) 25G針を門脈(黒い点線の輪郭)に挿入し、末期静脈血液採取に成功した。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

プロトコルセクションで説明されている外科的アプローチにより、肝リンパ管が右腎臓の内側に位置し、セリアック病および肝動脈と平行に走っていることを明確に特定^{できます。}代表的な解剖学とカニュレーションは 図5に示されています。カニュレーションの成功は、乳白色のキロミクロン汚染のない透明からやや濁ったリンパ液が即座に現れることで確認されており、腸系膜リンパとの混合が最小限であることを示唆しています。この観察は肝リンパ3の報告された特徴と^{一致しています。}肝リンパの識別は、肝動脈および下大静脈に対する解剖学的な位置、そして典型的な不透明または乳白色の腸系膜リンパとは対照的に特徴的なクリアな外観に基づいていました。

肝リンパ流は採集期間中安定し、平均流量は約0.1 mL/h ^3,4,11であるべきです。肝リンパ流は通常、麻酔条件下でカニュレーション後約2〜3時間が最も安定しますが、最適な実験条件下ではより長い採集期間(最大~~8時間)も可能です。過去の研究^で報告された代表的なリンパ流量値は表1にまとめられています。肝リンパ流量は、麻酔ラットにおける腸間膜および胸椎リンパ管流量の報告よりも一般的に低いです。

リンパ部位(意識状態)	平均リンパ流量(mL/h)
胸部リンパ(意識あり)	1.74 ± 0.33
胸部リンパ(麻酔下)	0.65 ± 0.10
腸間膜リンパ(麻酔下)	0.45 ± 0.11
肝リンパ(麻酔下)	0.12 ± 0.02

表1:意識あるラットおよび麻酔下のラットにおける胸腔、腸系膜、肝リンパ管カニューレーションによる平均リンパ流量(mL/h)。 データはn=3〜5匹のラット±平均SEMとして提示されています。Yadavら(2018^)の表3より改編。

高分子のリンパ輸送を示す代表的な結果は 図8に示されています。これらの例は、約60 kDaのペギル化インターフェロンα2a(IFN-PEG40)、約31 kDaのペギル化インターフェロンα2b(IFN-PEG12)、モノクローナル抗体トラスツズマブを含む治療用高分子の静脈内投与後のリンパ回復を評価するモデルの利用に用いられること^{を示しています。これは}肝臓が高分子治療薬における漏出およびリンパアクセスの主要な部位であることを示唆しています。

図8:胸部、腸系膜、肝リンパにまたがる静脈内投与の高分子治療薬のリンパ回復。 胸部、腸間膜、肝リンパで、異なる分子サイズのPEG化インターフェロン(IFN-PEG12およびIFN-PEG40)およびモノクローナル抗体(トラスツズマブ)を静脈内投与した後に回収された総用量の割合。データは8時間±線量回復の平均SEMを示しています。 Yadavら(2018^)より改編。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

また、肝リンパ³の詳細なリポタンパク質プロファイリングも可能にしています。リンパ脂質組成の代表的な解析は 図9に示されています。胸部および腸系膜リンパと比べて、肝リンパは総脂質含有量が著しく低いものの、タンパク質濃度は他のリンパ源と同等です。肝リンパのリポタンパク質解析は、肝臓が脂質輸送およびコレステロール逆輸送に果たす独自の役割を浮き彫りにしています。代表的な脂質組成データは 表2にまとめられています。肝リンパのHDLはコレステリルエステルに富み、腸系膜リンパのHDLは主にトリグリセリドが豊富で、胸部リンパのHDLは比較的高いリン脂質含有量を持っています。これらの組成の違いは、脂質代謝と輸送における各リンパ源の明確な役割を示しています。

	%wt/wt
分数	リン脂質	遊離コレステロール	コレステリルエステル	トリグリセリド
腸間膜リンパ
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21±4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
肝リンパ
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
胸椎リンパ
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11±3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11±1	11 ± 0
プラズマ
D-HDL	29±2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18±3	4 ± 1

表2:腸系膜、肝臓、胸部リンパおよび血漿から分離された密度(D-HDL)および軽質(L-HDL)高密度リポタンパク質分画の脂質組成。 値は、リン脂質、遊離コレステロール、コレステリルエステル、トリグリセリドの重量比パーセンテージ(% wt/wt)を総脂質割合に対して示します。データはSEM±平均として提示されています。Graciaら(2020^)の表1から適応しています。

図9:腸間膜、肝臓、胸部リンパのタンパク質および脂質組成。 腸系膜、肝臓、胸椎リンパにおけるタンパク質および総脂質の比例的含有量。脂質含有量には、リン脂質(PL)、トリグリセリド(TG)、コレステリルエステル(CE)、遊離コレステロール(FC)が含まれ、これらは脂質重量と脂質の総重量に対する割合として表されます。データはSEM±平均として提示されます。 Graciaら(2020^)より改編。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

肝リンパ管カノレーションは、経験豊富な顕微外科医でも技術的に難しい手術です。リンパ管の完全性を維持し、安定したリンパ流を達成する可能性を高めるために、いくつかの重要なステップがあります。肝リンパ管の特定と分離(プロトコルステップ5.7-5.10)では、最初のステップは腸系膜リンパ管と肝リンパ管近くの大静脈に覆う結合組織と脂肪を除去することです。肝リンパ管は、より厚く不透明な腸系膜リンパ管と比べて透き通しやすく、直接触れると簡単に破裂しやすいです。腸間膜リンパ管は有用な解剖学的ランドマークとして機能し、その上方組織を除去すると肝リンパ管が上方に位置していることが明らかになります。肝リンパ管はしばしば曲がりや曲がりを示すため、操作者は直線的なセグメントに沿ってカニュレーションポイントを選び、閉塞や断裂のリスクを最小限に抑えるために、カニューレを導管の自然な経路に平行に配置する必要があります(ステップ5.11-5.14)。

カニュレーション自体が成功の最も重要な決定要因です。管を穴開けた後(ステップ5.13)、鉗子の先端を開口部に差し込み、器具の上に1つの血管壁だけが重なるようにすることで、内腔内アクセスを目視で確認できます。対向する2つの壁の出現は貫通穴を示しています。内腔内アクセスが確認されると、カニューレは同じ角度で管に沿って滑らかに前進できます。周囲の血管を損傷しないよう注意が必要です。出血はリンパ収集カニューレに血液を流入させ、サンプルを汚染し血栓形成のリスクを大幅に高める可能性があります。リンパ流を確立した後(ステップ5.15)、カニューレの収集端にキャップをし、獣医用接着剤を慎重に塗布して腔内に入るのを防ぎます。また、空気が閉じ込められていると逆圧が上がり、リンパの流れを妨げる可能性があるため、カニューレの気泡もチェックする必要があります。肝リンパは低圧で生成されるため、カニューレの集積端は常に手術部位のレベルより下に位置し、重力による排液を容易にします。

肝リンパ管カニュレーションの成功は、リンパ流の即時開始によって示されます。確立されると、肝リンパは通常約0.1 mL/hで流れ、数時間にわたり安定した出産が保たれます。流量は動物の解剖学、生理学、実験条件によって異なる場合があります。例えば、このプロトコルではイソフルラン麻酔下でリンパを採取しました。イソフルラン麻酔はリンパ機能に関連する生理学的パラメータに影響を与える可能性があり、麻酔を伴う実験的条件を考慮するとリンパ^形成率を解釈する際には考慮すべきです。肝リンパ管カニュレーションには腹腔切開術と腹部リンパ管の繊細な顕微外科的操作が必要であり、意識のあるラットからのリンパ採取はこのモデルでは実現不可能である。麻酔下と意識状態下、または異なる麻酔療法を用いたリンパ輸送を比較した過去の研究では、麻酔が絶対リンパ流量にわずかに影響を与えることはあるものの、全体的なリンパ^{輸送パターンを}大きく変えることはないことが示されています4。したがって、このモデルで得られるリンパ流量値は麻酔下の実験条件の文脈で解釈されるべきです。

採取中の血流の徐々の減少や停止は、血液汚染やフィブリン沈着によるカニューレ内の血栓形成が原因であることが多いです。血流は、細かい鉗子でカニューレを局所化し、優しくつまんで機械的に血栓を断片化したり、カニューレの集結端から優しく吸引して詰まりを取り除くことで回復することもあります。詰まりが外部に限定されている場合、カニューレは血栓の近位部で切断され、滅菌シリコーンコネクターで新しいチューブに再接続されます。血栓がカニュレーション部位で形成された場合、通常は再カニュレーションが必要です。そのような場合、接着剤の除去は管や隣接する血管の破裂を防ぐために十分に注意して行うことがあります。カニュラへのわずかな血液漏れでも低圧肝リンパ系内の凝固を著しく促進するため、再開を試みる前に止血を達成する必要があります。

生理的要因もリンパ流や通液率に影響を与えます。ラットの肝リンパ流は、基底条件下でも腸系膜や胸管の流れよりも本質的に遅い^17,18。さらに、全身麻酔は意識があり自由に動くラットと比べて他のリンパ回路のリンパ流量を減少させることがある¹⁹。肝リンパ管のカニュレーションは麻酔と開腹手術を必要とするため、これらの要因が比較的低い流量と長時間の採集時に見られる血栓傾向の増加に寄与していると考えられます。採集中に頸静脈や消化管カニューレを通じて水分補給を維持することで、リンパ流を安定させ、血栓形成を減らすことができます。このモデルでは、肝リンパ流は安定して2〜3時間維持されますが、その後は血流が悪化し血栓が起こりやすくなります。しかし、最適な実験条件下では、リンパ採取をより長期間維持することができ、最大8~時間^{まで報告されています}。

肝動脈および門脈サンプリング(図6および図7)の導入により、肝流入、リンパ流出、全身循環の直接比較が可能となり、モデルの適用範囲が拡大します。この終端サンプリングステップにより、単一動物内の肝微小血管輸送および間質クリアランスの同時評価が可能になります。このような比較は、特に間質拡散に依存する大型高分子や求脂性化合物において、肝血管区画とリンパ室間の溶質分布に関する貴重な洞察を提供します。

これらの課題にもかかわらず、肝リンパカニュレーションモデルは依然として価値があり有益な技術です。肝臓は全身のリンパ流のかなりの割合を占めており、肝リンパには肝間質液から由来するタンパク質やその他の成分が含まれています。肝臓から直接排出されるリンパをサンプリングすることで、このモデルは肝臓から出る分子や細胞が胸管内の腸間膜および全身リンパによって希釈される前に解析することを可能にします。肝リンパの生化学的解析は、肝間質代謝および脂質輸送過程に関する洞察を提供します^12,20。これは、肝代謝と肝外交換の影響を統合するポータルや全身血液から得られる情報を補完します。重要なのは、肝リンパ、頸動脈、頸静脈カニュレーションを組み合わせたこの構成により、肝流出と血管流入の間の溶質勾配を動的に評価し、肝輸送とクリアランスのより包括的な状況を把握できることです。

このモデルを用いた過去の研究では、肝リンパサンプリングが高分子治療薬のリンパ回復の評価や肝リンパと全身循環間の溶質輸送の比較を可能にすることが示されています。肝リンパカノレーション、同時採取の血管サンプリング、生化学的プロファイリングは、肝微小血管および間質の動態を研究するための堅牢な実験的基盤を提供します。このモデルは肝輸送、代謝、脂質処理、免疫シグナル伝達の同時評価を可能にし、MASLDや肝炎症などの病態生理的条件下での変化を調査するために適応可能です。

結論として、肝リンパ、肝動脈、門脈静脈アクセスを統合したこの洗練された外科モデルは、肝輸送経路の検査に包括的かつ再現性の高いアプローチを提供します。血管流入、間質性流出、リンパ排膿の直接比較が可能となり、肝臓特異的な輸送、代謝、薬物動態のメカニズムに関する研究を支持します。さらに、肝リンパのサンプルを取ることは、肝臓からの免疫細胞および抗原輸送を研究するユニークな機会を提供し、肝臓免疫監視、炎症、耐性メカニズムに関する貴重な洞察を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗凝剤溶液（EDTA 0.1%）	Invitrogen	AM9261	経管および採取サンプルにおける血栓形成を防ぐ
抗凝剤溶液（ヘパリン 20 IU/mL）	Pfizer	00409-2723-01	経管および採取サンプルにおける血栓形成を防ぐ
クロルヘキシジン（0.5%）	McFarlane Medical	12120-OR	手術部位の消毒に使用
コレクションチューブ（マイクロ遠心分離機）	Greiner Bio-One	616201	リンパおよび血液の採取に使用
綿ガーゼ	Winc Australia	18874125	臓器操作および湿度維持に使用
綿棒	Pacific Laboratory	1005199	手術中の臓器位置変更に使用
湾曲した虹彩鉗子	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	血管分離および組織操作に使用
デュモン鉗子	Fine Science Tools	11251-35	肝動脈の血管腔の開通および安定化、経管挿入に使用
エタノール（70%）	Ajax	AJA214-2.5PL	手術部位の消毒に使用
ハルステイト・モスキートヘモスタット鉗子	Fine Science Tools	13009-12	肝リンパ管穿刺のための25G針の曲げに使用
加熱手術パッド（37℃）	Ratek	IC-WT1	手術中の体温維持
誘導チャンバー	Darvall	1859	初期麻酔導入に使用
注入ポンプ	Adelab Scientific	NE-300	経管による塩化ナトリウムの制御注入
虹彩鉗子	Stark Medical	E-AC985-11	皮膚および筋肉切開に使用
イソフルラン	Provet Pty Ltd	ISOF07	麻酔導入および維持に使用する吸入麻酔薬
ケルマン・マクファーソンレンズ鉗子	ProSciTech	TY-1301	頚静脈および頚動脈の血管腔の開通および安定化、経管挿入に使用
針（23G × 1インチ）	Livingstone	DN23GX1.0LV	門脈穿刺および採血に使用
針（25G × 1インチ）	Livingstone	DN25GX1.0LV	経管フラッシングおよび肝リンパ管穿刺に使用
鼻コーン麻酔システム	Darvall	7885	手術中の麻酔維持
フローメーター付き酸素供給	BOC	400NE	イソフルラン麻酔のキャリアガス
ポリエチレン経管（外径0.8mm、内径0.5mm）	Microtube Extrusions	PE8050	頚動脈、頚静脈、肝リンパ管の経管挿入に使用
ポリビニル経管（外径0.61mm、内径0.28mm）	Microtube Extrusions	PIV6128	肝動脈の経管挿入に使用
シルク縫合糸（4-0）	SMI AG	SM8015	血管および経管の固定に使用
ナトリウムペントバルビタール	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	安楽死に使用（>100 mg/kg）
生理食塩水（0.9% NaCl）	FreeFlex	K690531	再水和およびフラッシングに使用
ストレートグレーフェ鉗子	Fine Science Tools	11150-10	繊細な血管分離に使用
手術用顕微鏡	Zeiss	Stemi 2000-CS	肝リンパ管の経管挿入時の可視化に使用
手術用滅菌ブレード（メス用）	Livingstone	SBLDCL15	準備中の経管チップの斜め切断に使用
注射器（1mL）	Terumo	19032-TE	経管フラッシングに使用
注射器（3mL）	Terumo	19048-TE	採血に使用
注射器（30mL）	Terumo	19034-TE	塩化ナトリウム注入に使用
バナス鉗子	Fine Science Tools	91500-09	血管切開に使用
獣医用組織接着剤	3M	1469SB	肝リンパ管経管の固定に使用