単回かつ反復的な回転閉鎖性脳震盪性脳損傷のマウスモデル

サマリー

回転性脳損傷の再現可能なマウスモデルを記述し、明確な構造的脳損傷がない場合に、単一または反復的な衝撃後に神経血管、炎症、行動の変化などの微妙な機能的・生物学的基盤を調査する多様な方法を提供します。

要約

脳震盪性損傷(CBI)は、臨床的な脳震盪の病態生理学的基盤であり、よく見られるものの十分に理解されていない状態であり、一部の患者に長期的な神経障害の可能性があります。特に反復的なCBI、すなわち接触スポーツでは、持続的な認知障害や進行性神経変性(例:慢性外傷性脳症、CTE)と関連しています。この知識のギャップを埋めるために、CBIの主要な生体力学的および病理的特徴を再現する閉頭回転性脳損傷のマウスモデルが確立されました。立体誘導型電磁衝撃装置が使用され、無傷の頭蓋骨に標準化された打撃を与えました。頭蓋骨および隣接する脳組織への局所的な負担を減らすため、インパクターチップには特注のシリコンキャップが装着されました。この構成は、動物間変動を抑えつつ頭蓋骨骨折や顕微鏡的組織損傷を防ぎつつ、頭の回転を確実に誘発しました。生理的な神経活動および血管活動を維持し、深麻酔による神経調節効果の可能性を避けるため、意識のあるマウスに軽度鎮静下でα2作動薬メデトミジンを用いた脳損傷を誘発しました。誘発された衝撃により、頭部の位置によるわずかな変動があっただけで、回転する頭部の動きは再現可能でした。脳の構造的完全性は、 in vivo のT2加重磁気共鳴画像法を用いて評価され、 生体外 組織学的解析で確認されました。組織の破壊、打撲、微小出血の証拠は見られませんでしたが、微小血管界面の軽度で広範囲にわたる破壊が認められました。この回転性閉鎖頭損傷の新しいモデルは、明確な構造病理が存在しない中で発生する微かな神経血管、炎症、血脳関門の変化を縦断的に調査するための堅牢な実験的プラットフォームを提供します。その応用により、臨床脳震盪の病態生理や反復損傷による神経変性影響の可能性に関するメカニズム的洞察が得られ、緊急に必要な臨床バイオマーカーの開発が促進されます。

概要

外傷性脳損傷(TBI)は、すべての年齢層で長期障害の重要な原因であり、思春期および若年成人が^{特に影響を受け}ています。TBIの大多数は軽度(mTBI)に分類され、臨床レベルでは一般的に脳震盪と呼ばれます。脳震盪は定義上、従来の神経画像法で検出可能な明らかな構造的脳損傷とは関連していませんが、増加する証拠は、基礎となる損傷メカニズム、ここでは脳震盪性脳損傷(CBI)と呼ばれるものが、明確で臨床的に重要な病態生理学的実体であることを示唆しています。

特に、コンタクトスポーツや軍事現場で頻繁に見られる近接時間で発生する反復的なCBIは、持続的な認知機能低下、神経精神症状、慢性外傷性脳症(CTE^)の発症と関連しています^1,2,3。初期の損傷の軽度と長期的な神経学的後遺症の可能性との間に見られるこの明らかな乖離は、臨床診断および機構研究の双方にとって大きな課題となっています。

新たな証拠は、神経血管および神経膠細胞の界面における微妙かつ持続的な変化が関連する疾患メカニズムをもたらすことを示しています。これらの変化には、血液脳関門(BBB)の完全性、微小血管構造、グリア活性化、神経細胞の興奮性、内因性修復過程が含まれ、特に反復的なCBI 5,6,7,8後に観察される長期的な機能的・行動的欠損と細胞レベルの病態生理を結びつける可能性があります。.これらの変化は、CBI後の遅発機能的および行動的欠損の潜在的な要因として認識されつつあります。しかし、その拡散的かつ多面的な性質は機構論的理解を複雑にし、これまでのところ標的治療介入の開発を妨げてきました。

病態生理学的カスケードの重要な側面を再検証する前臨床モデルは、これらのメカニズムを解明し新たな治療法を特定するための重要なツールです。実験的なTBIモデルは幅広く存在しますが、ほとんどは中等度から重度の損傷を模倣するか、局所^{構造損傷に}依存する設計^でした。対照的に、CBI⁵の特徴的な損傷メカニズムに関する動物モデルは驚くほど不足しています。主に「軽度」と分類される脳外傷は、硬直した頭部への局所的な衝撃や、開頭切開後の直接的な皮質衝突によって誘発されており、これは人間の脳震盪を定義する拡散的で加減速による損傷メカニズムと根本的に矛盾^{しています。}このようなアプローチは損傷パラメータの正確な制御を可能にしますが、実際の脳震盪の動態を再現する能力が限られているため、翻訳上の関連性は低下しています。

これらの制限を克服するために、再現可能かつ拡散性の閉鎖性脳損傷を誘発するいくつかの方法が存在する。12,13,14。これらの概念を基に、技術的な複雑さを最小限に抑えることを目的として、他の実験的外傷モデルでよく用いられる市販の電磁衝撃体(すなわち制御皮質衝突、CCI)を用いたマウスの制御回転損傷モデルが開発されました。自由に動く頭部に再現可能な衝撃を与えることで、このアプローチは構造的な完全性を保つと同時に、単回かつ反復的なCBI後の神経血管、神経膠質、機能的変化を縦断的に調査し、人間の脳震盪の生体力学的特徴に近似する条件で研究を可能にします。

縦断的行動評価、 in vivo 画像診断、 体外 組織学と組み合わせることで、このモデルは単一または反復的な影響後の神経血管、神経神経、グリアム、行動の変化を探るための多様でアクセスしやすいプラットフォームを提供します。そのため、CBIの微妙な二次疾患メカニズムの研究、トランスレーショナル代理指標の特定、臨床的に関連性の高い実験環境での治療介入の可能性評価に適しています。

プロトコル

すべての動物処置はドイツ動物福祉法に準拠し、機関および政府当局(LANUV ノルトライン・ヴェストファーレン;AZ 81-02.04.2020.A058)。実験はARRIVEガイドラインに従って実施されました。図 1に示された回路図のワークフローが詳細に示されています。このプロトコルは、構造的、行動的、神経血管の検証結果の定義されたパネルによって証明されており、確実に脳震盪性損傷を誘発します(図2)。本研究で使用されるすべての資料は 、材料表に詳細記載されています。

1. 一般的な考慮事項

注:マウスは標準化された環境(12時間の明暗サイクル)で社会的に飼育され、自由に食べ物と水を得られました。マウスは手術の少なくとも7日前から実験施設に慣れさせました。このパイロット研究では合計40頭のマウスが使用され、各実験群に10頭ずつ割り当てられました(対照群はSham、単一CBI群、高頻度の反復CBI、低周波群は反復CBI)。マウスの頭をマウスの前方に固定位置(例:10cm)に置き、目線に高速カメラシステムを設置します。試行ごとに一貫性を保つために、カメラの位置と向きを一定に保ちましょう。この研究ではGoPro Hero6が240フレーム毎秒(fps)、解像度1080pxで使用されました。前述の運動学解析にはオープンソースのモーション解析ソフトウェアKinovea(バージョン2025.2.0)が使用されています。

2. 鎮痛および麻酔誘発

1. 設置準備をし、立体視フレームと電磁衝突体のアタッチメントも含めて。
2. トラウマ誘発の2日前に水を飲みながら投与し、(最後の)手術後3日間継続します。
3. 亜酸化窒素/酸素混合液(_O2 30%、N₂O 70%)を用いて麻酔を誘導し、誘導チャンバーで4〜4.5%のイソフルランを投与します。
4. つまみ反射を使って手術耐性を評価する。離脱反応が見られない場合は進めてください。
5. 誘導チャンバーからマウスを取り出し、立体定位フレーム内のヒートパッドの上に置きます。ファイバーオプティック直腸プローブを用いて、コア温度を37±1.0°Cに保ちます。眼用軟膏を塗布して乾燥から目を守りましょう。
6. 立体定位装置に接続された鼻のコーンから2.0〜2.5%のイソフルランを投与して麻酔を維持します。

3. 頭蓋骨の準備

1. 特定の耳バーを使って、マウスを立体視準フレーム内に固定します。
2. 頭皮を剃り、手術部位をアルコール系の消毒液で徹底的に消毒してください。
3. ブピバカイン(0.1 mg/kg)を皮下注射して局所麻酔をかけます。
4. 皮膚切開前につま先のつまみ反射を再評価してください。離脱反応がない場合のみ、安定した麻酔深度を確保するために進行してください。
5. 約7mmの中央皮膚切開を行い、頭蓋骨を露出させます。
6. ブレグマとラムダの間の右頭頂骨の頭蓋骨を慎重に露出させてください。
7. 立体視準フレームは頭蓋骨に対して垂直に向き、垂直軸は頭部表面に対して90°の角度で位置付けられるようにしてください。
8. 立体定位ホルダーにマーカーピンを取り付け、ブレグマの中央に合わせます。
9. すべての立体定位座標をゼロにし、マーカーピンをあらかじめ定められた前後(AP)および中外側(ML)座標(モデルではAP 0.5、ML -2.5)に移動させます。防水フェルトペンでターゲットポイントをマークしてください。

4. 鎮痛の調整

1. ネズミを耳のバーから解放してください。
2. メデトミジンを皮下注射(0.5 mg/kg)し、イソフルランを徐々に<0.5%に減らします。
3. 呼吸と体温を継続的に監視しながら、麻酔は0.5%のイソフルラン<に保ち続けてください。
4. これらの条件下で10分間平衡状態を保ち、神経ネットワークの活動を維持しつつ安定した麻酔状態に到達させます。呼吸数、反射反応の欠如、安定した体温(37 ± 1.0 °C)を標準化された指標として用い、動物間で麻酔深度を比較できるようにしました。

5. 衝撃誘導

注:実験前に、市販のポリエチレン(PE)フォームパイプ絶縁材(閉セル非架橋ポリマーフォーム)で動物モデル用のヘッドホルダーを製作してください。これは回転運動を許容しつつ、下方向の加速を制限します。さらに、シルプランの5mm球形インパクターチップ(比率1:1、剛性830 kPa)を特注で製作してください。

1. 直腸温度プローブを外し、イソフルラン投与を中止し、マウスをヘッドホルダーに伏せて置きます。
2. 市販のインパクターチップにカスタムメイドのシリコンキャップを取り付けます。
3. 電磁インパクターを立体定位ホルダーに取り付け、装置が頭蓋骨表面に対して10°の角度で配置されていることを確認してください。
4. インパクターの先端を頭蓋骨のあらかじめ定めた目標部位の上に合わせます。
5. インパクターの先端を伸ばした姿勢で下げ、頭蓋骨の表面に軽く接触させます。
6. インパクターの先端を引っ込め、望む凹み深さ(これらの実験では3mm)に頭蓋骨表面に向かって前進させます。対照動物の場合は、下げる動作を省略し、先端を同じだけ上げます。
7. ビデオ撮影を始めろ。制御スイッチを介して電磁ボルトを5 mm/sの速度で作動させ、パルス持続時間0.1 msで単一の回転衝撃を与えます。
8. 衝突完了後すぐにインパクターを格納してください。
9. メデトミジン麻酔はアチパマゾール(0.5 mg/kg、S.C.)を用いてアンタゴニシズムされます。

6. 衝撃後の評価と創傷閉鎖

1. マウスを仰向けにします。
2. 動物がうつ伏せの状態に戻るまでの時間を記録し、復元反射を評価します。
3. 亜酸化窒素/酸素混合液(_O2 30%、N₂O 70%)で4%イソフルランで再麻酔を誘導します。
4. 誘導チャンバーからマウスを取り出し、ステレオタクティカルフレームのそばのヒートパッドに置きます。ファイバーオプティック直腸プローブを用いて、コア温度を37±1.0°Cに保ちます。
5. 耳バーを使ってマウスを立体定位フレームに固定します。
6. 皮膚切開部は自己吸収性フィラメントを用いた中断縫合(例:Polyglactin 910, 6-0)で閉じます。
7. マウスを温めボックスに移し、意識が完全に回復するまでモニタリングしてください。
8. 動物を元のケージに戻してください。

7. 繰り返し衝撃パラダイム

1. 実験デザインに従ってマウスを偽、単一、または繰り返しのCBIグループに割り当てます。
2. 再傷害グループの場合は、定められた間隔(例:48時間ごと)でCBIセッションをスケジュールしてください。
3. その後のCBIの前には、3.1節に記載されている通り、トラマドールを飲料水中で術前鎮痛剤投与します。
4. セクション3–6で示された手順に従い、繰り返し麻酔、立体定位マーキング、衝撃を行った。包括、ブピバカイン(0.1 mg/kg、S.C.)による局所麻酔(0.1 mg/kg、S.C.)、メデトミジン投与(0.5 mg/kg、S.C.)、イソフルラン<0.5%維持、Bregmaに対してAP 0.5およびML −2.5の立体定位、電磁衝撃体を用いた回転衝撃衝撃(イントメント深さ3 mm、 速度5 mm/s、パルス持続時間0.1 ms、頭蓋骨表面に対して10°の角度)。
5. 回転運動を可能にするポリエチレンフォームヘッドホルダーへの伏せ置き、同一の衝撃パラメータ(角度、深さ、速度、持続時間)、および標準化された処置前後の条件を確保し、アティパマゾールによるメデトミジン拮抗(0.5 mg/kg、S.C)、麻酔の再誘導(O₂ 4%イソフルラン30%/N₂O 70%)、37 ± 1.0°Cでの温度制御を繰り返しセッションで行い、動物および時間点間での再現性を維持します。
6. 繰り返しのセッションで一貫した位置、衝撃パラメータ、回復条件を確保し、動物や時間点間での再現性を維持します。
7. 繰り返しの衝撃後、動物の累積的な行動障害を継続的に監視してください。

8. 運動学的解析

1. 分析のために動画を標準フォーマット(例:MP4)にエクスポートし、Kinoveaソフトウェアに読み込みます。
2. 衝突前後のフレームを含む該当時間ウィンドウ(例:衝撃から-0.025秒から0.3秒)に移動します。ソフトウェア設定で適切なフレームレート(例:240fps)を設定してください。スケーリング基準(例:眼間距離)を定義します。
3. Kinoveaのトラッキングツールを使って三点追跡セットアップを確立します(例:右目、左目、鼻; 図3A)。各ポイントごとにトラッキングを開始し、特に急動や閉塞時には手動でトラッキングエラーを修正してください。
4. 追跡した座標をCSVやExcelファイルとしてエクスポートできます。
   注:さらなる運動学的解析はカスタムMATLABスクリプトを用いて実施されました。Kinoveaからエクスポートされた時間解決追跡データはインポートおよび事前処理され、無効なエントリーを削除し、時間のスケーリングを一貫性に保ちました。頭部平行移動は、右目、左目、鼻の3つの追跡されたランドマークの重心として定義され、そこから数値微分を用いて線形変位、速度、加速度を導出しました。頭部の回転は眼と鼻の軸の向きから推定され、角変位は衝突前の基準線に対して計算され、角速度はその一次微分として得られました。ノイズ増幅を減らすため、微分前にすべての位置信号と角度信号をサヴィツキー・ゴレイフィルタで平滑化しました。主要なアウトカムパラメータは最大角度変位であり、速度および加速度プロファイルは試験間の頭部運動動態の相対的な指標として解析されました。

結果

一般的な考慮事項:

このプロトコルの適用は、構造的、行動的、神経血管の検証結果の定義されたセットによって示されるように、脳震盪性損傷を再現性に誘発します( 図2参照)。損傷後も構造的な強度は保たれました。顕著な巨視的な組織破壊や出血は検出されず、このプロトコルが脳損傷を誘発する脳損傷であり、打撲性ではなく脳損傷であることを示している。組織学的評価により、重大な細胞喪失やキャビテーションの証拠なしに組織構造が完全なものであることが確認されました。さらに、構造画像診断や組織学的解析では、適用された衝撃パラメータで動物間で打撲や微小出血を一貫して検出できませんでした。

衝撃誘導

ヘッド運動学解析(図3B)では、一貫したヘッド...

ディスカッション

加減速損傷に基づく閉頭型CBIの新しいマウスモデルが特徴づけられ、軽度ながら広範囲に及ぶBBBの障害と臨床的脳震盪を思わせる独特の神経精神表現型を特徴としています。構造的な完全性を保ちつつ、CBIの特徴を制御された一貫性のある方法で再現することで、このモデルはCBIのメカニズムとその神経精神医学的・認知的後遺症のメカニズムを研究するための有用かつよく特徴づけられた実験的枠組みを提供します。

プロトコル内の重要なステップは、ヘッドの実効的な機械的荷重を決定するものです。特に、正確な立体定位と衝突体に対する頭部位置の再現性が、動物間で一貫した回転損傷ベクトルを確保するために必要です。位置、角度、設定などのインパクターパラメータの標準化や、実験運転前の定期的な校正が変動を最小限に抑えるために不可欠です。衝撃部位や回転角のわずかな偏差が損傷の重症度に不均衡に影響を与えるため、厳格なオペレーターの一貫性とセットアップパラメータの記録が実験的再現性の鍵となります。技術の方法論的厳密さを高め、トラブルシューティングを容易にするた...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
薬物
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	メデトミジン拮抗剤（α2-アドレナリン受容体拮抗剤）、皮下（0.5 mg/kg）
Bepanthen Ophthalmic Ointment	Bayer	11809917	麻酔中の眼保護、局所
ブピバカイン	Sigma-Aldrich	B1160000	局所麻酔、皮下（0.1 mg/kg）
イソフルラン	CP pharma	1214CN	麻酔、吸入（誘導および維持）
メデトミジン	Vetoquinol	VM 06043/4003	鎮静/麻酔補助剤（α2-アドレナリン受容体作動薬）、皮下（0.5 mg/kg）
トラマドール塩酸塩（100 mg/mL）	Grünenthal	6867645	飲料水で投与される鎮痛剤、マウス用最終濃度1 mg/mL、術前2日～術後3日
機器
ポリエチレンネッククッション	カスタム		仰向け位置固定用サポート
Sterotaxic Impactor Silupran Cover	カスタム		機械的負荷分散、頭蓋骨の局所損傷防止、インパクターチップに取り付け、830 kPa
Streotaxic Impactor	Leica Biosystems	39463923/IM10131	制御された衝撃の電磁衝撃装置
ツール
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(version 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	NA