生理周期が血小板富むフィブリンの成長因子に与える影響:横断的観察研究

サマリー

本研究は、生理周期の段階が血小板富むフィブリン(PRF)からの成長因子の放出に与える影響を評価します。

要約

血小板リッチフィブリン(PRF)は、歯科手術の再生手術で広く使用されています。しかし、その生物学的成分の変動は標準化の重要な制約となっています。本研究は、月経周期の段階がPRFからの成長因子放出にどのように影響するかを評価する厳密に管理された実験ワークフローを実施することを目的としました。静脈血サンプルは、3つのあらかじめ定められた月経期(月経:1〜5日目;卵胞期:6〜14日目、黄体期:15〜28日目)にて採取され、すべての採血は概日リズムの変動を最小限に抑えるため、固定された時間帯(午前11時〜11時30分)内で行われました。各段階ごとに、全血球計数、ホルモン分析(エストロゲン、プロゲステロン、卵胞刺激ホルモン[FSH]、黄体形成ホルモン[LH])、およびPRF準備のために別々のチューブが割り当てられました。PRFは標準化された条件下(708 × g で12分間、固定角度ローター、40°、半径88 mm、抗凝固剤なし)下で即時遠心分離によって生成されました。血栓は巨視的に確認され(均一で弾力性のある構造)、赤血球層から慎重に分離され、個別に重さが測定されました。成長因子放出の標準化のため、各血栓はRPMI-1640培地で重量比(1 g PRF:1 mL培地)でインキュベートされ、その後37°Cで軌道攪拌(100 rpm)で制御培養されました。分析前に上清液を-80°Cで採取・保存しました。成長因子(IGF-1、PDGF、FGF-2、VEGF、TGF-β1)は、均一なアッセイ条件下で酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて定量化しました。この標準化されたプロトコル内で、FGF-2のレベルは月経期および黄体期に比べて濾胞期で有意に高かった。この段階ではFGF-2とエストロゲンレベルの間に中程度の正の相関が観察されましたが、他の成長因子では統計的に有意な差は認められませんでした。これらの発見は、生理周期期がPRF由来の成長因子プロファイルの変動に寄与している可能性を示しています。このプロトコルは、PRF研究における事前解析および分析の変動を最小化するための再現可能な枠組みを提供します。相相関連の違いの臨床的影響は、より大きなコホートと治療アウトカムを組み込んだ研究でのさらなる調査を推奨します。

概要

歴史的に、血小板濃縮物の使用はフィブリン接着剤の開発から始まり、さまざまな製剤や製剤プロトコルへと発展してきました。血小板リッチフィブリン(PRF)は、2001年にChoukrounらによって初めて導入された、第二世代の血小板濃縮物で、歯科1で広く使われ^{ています。}この自己生物材料は抗凝固剤を含まず遠心分離によって得られ、血小板、白血球、循環免疫成分で富んだフィブリンマトリックスを形成します².フィブリンネットワークは、組織修復と再生に不可欠な成長因子の徐々の放出を可能にする足場として機能します³。

血小板は活性化時にサイトカインや成長因子を放出し、創傷治癒と止血に中心的な役割を果たします^。PRFでは、この過程により血管内皮成長因子(VEGF)、線維芽細胞成長因子2(FGF-2)、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子(IGF)、変換成長因子β1(TGF-β1^)など主要なメディエーターが持続的に放出されます。PRFの臨床的使用が広く行われているにもかかわらず、再生効果に関する結果は研究間で一貫していません。変動の主な原因の一つは、PRF製剤の異質性であり、これは技術的要因と生物学的要因の両方に影響されます。

方法論的観点からは、遠心分離プロトコル(相対的な遠心力、持続時間、ローターの種類)、チューブの材料、採取後の取り扱いの違いはPRFの構造や細胞分布を大きく変える可能性があります⁷。さらに、血栓処理の標準化不足、正規化戦略の不一致、ELISA以前の培養条件の違いなどの分析的変動性は、報告された成長因子レベル⁸に大きな不一致をもたらすことがあります。これらの不整合は研究間の比較可能性を制限し、PRF研究の翻訳的信頼性を低下させます。

生物学的多様性は解釈をさらに複雑にしています。年齢、性別、血小板数、血小板分布幅(PDW)、平均血小板容積(MPV)など、いくつかの患者関連要因がPRF組成に影響を与えることが知られています⁹。さらに、ホルモン、遺伝、環境の影響が血小板の挙動やサイトカ^インの放出を調節する可能性があります。性ホルモンが血小板生物学に影響を与えるという直接的および間接的な証拠^{があります。}特にエストロゲンは、生理的作動薬に対する血小板の応答性を高め、受容体介在経路を通じてトロンビン誘発の凝集を促進することが示されています¹²。エストロゲンのレベルは月経周期を通じて変動するため、血小板機能およびそれに伴う生物学的排出量もそれに応じて変動することがあります¹³。しかし、文献は一貫性がなく、一部の研究では血小板活性化の強化が報告され、他は中性または抑制効果を示すと報告されています¹⁴。

このような技術的および生物学的な変動性を踏まえ、PRF由来の成長因子を評価する際に事前分析および分析バイアスを最小限に抑える方法論的に制御されたワークフローの明確な必要性があります。単一時点サンプリング、非標準化の血栓処理、非正規化成長因子定量に依存する多くの過去の研究とは異なり、本研究では段階特異的かつ時間制御された血液採取プロトコル、固定遠心分離パラメータ、そしてインキュベーションおよびELISA解析前のPRF血栓の重量ベースの正規化を用いています⁸.このアプローチは再現性を高め、生理学的状態を超えた成長因子放出の比較をより信頼性の高いものにすることを目的としています。

PRF研究の代替アプローチとしては、先進的な処方法(advanced prf⁷ やinjectible-PRF¹⁵)、水平遠心分離システム⁷、または体外分析を行わない直接膜移植などがあります。これらの方法は細胞の収量や臨床応用を高める可能性がありますが、成長因子の定量にさらなる変動をもたらしたり、特定の生物学的効果を単離する能力を制限することが多いです。これに対し、現在のワークフローは分析的標準化と制御された比較を優先しており、ホルモン変動などの生理的修飾因子の調査に特に適しています。

提案されたプロトコルは、標準化された条件下で成長因子放出を定量化することを目的とした制御された実験またはトランスレーショナル研究に最も適しています。臨床アウトカムのみに焦点を当てた環境、簡略化されたチェアサイド準備、または即時のPRF申請が処理なしで必要な研究では適用が難しい場合があります。研究者は、PRF関連測定の変動性を減らし再現性を向上させることが主な目的である場合、このワークフローの採用を検討すべきです。

したがって、本研究の目的は、標準化され再現性のある方法論的枠組みを用いて、異なる月経周期段階におけるホルモンレベルとPRFからの成長因子放出との相関を評価することでした。

プロトコル

この研究はトルコ・アダナのチュクロワ大学歯学部歯学部で実施され、21名の女性ボランティアが参加しました。すべての参加者には研究の目的、設計、手順について詳細に説明され、含める前に書面によるインフォームドコンセントが取得されました。この研究プロトコルは、チュクロヴァ大学医学部倫理委員会によって審査・承認されました(承認番号:125/56、2022年9月16日付)。すべての手続きは、人間被験者を含む研究においてヘルシンキ宣言の原則に従って実施されました。

人体血液に関するすべての手順、バイオセーフティの注意や生物有害廃棄物および化学廃棄物の取り扱い・処分は、疾病対策センター(CDC)および国立衛生研究所(^NIH)16が定める確立されたバイオセーフティガイドラインに従って実施されました。職員は適切な個人用防護具(PPE)、すなわち手袋、白衣、防護用眼鏡を使用しました。すべてのサンプル取り扱いは、汚染や曝露を防ぐため指定された実験室エリアで行われました。生物廃棄物(血液残留物、PRF残留物、消耗品)は、チュクロヴァ大学医療廃棄物管理プロトコルおよび国家生物医療廃棄物規制に従って処分されました。鋭利な物体は刺さりにくい容器に入れられ、液体廃棄物は処分前に化学的に消毒され、固体バイオハザード廃棄物は許可処理前にオートクレーブ処理されました。

参加者選考

以下の基準を満たす個人が研究に含まれました:全身疾患のなし、規則的な月経周期が27〜30日、年齢が18〜25歳であること

以下の基準を満たす個人は研究から除外されました:全身性疾患の有無、不規則な月経周期、薬物やホルモン調剤の使用、内分泌または出血性疾患の有無、月経中の過剰出血の既往

血液採取とグループ配分

各参加者の生理周期の最初の日々は、スケジューリングプロトコルの作成に用いられました。広く受け入れられている生理学的分類に基づき、周期は3つの段階に分けられました:1日目から5日目は月経期(子宮内膜の脱出を伴う)、6日目から14日目は卵胞期(エストロゲンレベルと卵胞の発達が特徴)、15日目から28日目は黄体期(排卵後のプロゲステロン分泌増加が特徴)^12,13.各参加者から血液サンプルは、対応する段階で採取されました。1周期で、被験者ごとに合計9本の血液チューブが採取されました:全血球計数用3本(各相1本)、性ホルモン分析用3本(エストロゲン、プロゲステロン、黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、3本はPRF製剤およびELISAベースの成長因子解析用でした。すべての血液サンプルは、生物学的変動を最小限に抑えるため、毎日午前11時から11時30分の間に採取されました。無外傷性サンプリングを確保するため、無菌の真空採血システムと21Gバタフライ針を用いて肘前静脈から静脈血液サンプルを採取しました。血液は標準的なPRF製剤プロトコルに従い、抗凝固剤なしの無菌10 mLガラスチューブ(PRFチューブ)に直接採取されました。事前分析のばらつきを最小限に抑えるため、すべてのサンプルは同じ訓練を受けた看護師が標準化された条件下で採取しました。

採取直後、チューブは攪拌せずに優しく扱い、60〜90秒以内に遠心分離機に移し、早期凝固を防ぎ、繊維素の一貫した重合を確保しました。チューブはバランスを維持し、遠心分離中の振動による変動を避けるためにローター内で対称に配置されていました。処置のいかなる段階でも添加剤や抗凝固剤は一切使用されませんでした。

その結果、3つの研究グループが設立されました:グループ1:月経期のサンプル、グループ2:濾胞期のサンプル、グループ3:黄体期のサンプル

PRF準備の手順:

血液サンプルは、固定角度ローター(40°、半径88mm)を備えたベンチトップ遠心分離機を用いて、抗凝固剤なしで即座に遠心分離しました。遠心分離は標準化された条件下で、室温(22°C–24°C)で708×gで12分間行われました。相対遠心力(RCF)値は、標準式(RCF = 1.118 × 10^⁻5 × r × g²)を用いて計算され、ローター半径(88 mm)を考慮し、Choukrounらが記述した確立されたPRFプロトコル¹⁷およびその後の標準化研究^1,3,18に準拠しています.遠心分離後、下位赤血球層、上位血小板不足の血漿層、中間PRF血栓の3つの異なる層が特定されました。PRFの血栓は無菌ピンセットで優しく除去され、赤血球界面の破壊を防ぎました。残留赤血球成分は滅菌ハサミで慎重にトリミングされました。

PRF血栓は、滑らかで均質な表面、弾性な円筒形構造、密で確固たる一貫性を事前に定められた基準^19,20に基づき、巨視的に評価されました。これらの基準を満たさない血栓は廃棄され、必要に応じて新たな血液サンプルが採取されました。すべてのサンプルは標準化された条件下で処理され、採集後30分以内に-80°Cで凍結され、プロテオ分解を最小限に抑えました。サンプルはバッチ分析前に最大4週間の管理された均一な期間で保存され、アッセイ間変動を減らし成長因子測定の比較可能性を確保しました。

成長因子ELISA解析のステップ:

PRFの血餅は無菌手術用ハサミを用いて赤血球分画から慎重に分離され、校正済みの分析天秤で個別に計量されました。RPMI-1640培地を各サンプルに、血塊重量に基づく固定比率(1 g PRF: 1 mL medium)で添加し、成長因子抽出を標準化し、血栓質量の違いに伴う変動を最小限に抑えました。サンプルは37°Cで100 ×g の軌道シェーカーで培養され、PRFマトリックスから培養培地への可溶性成長因子の均一な拡散を促進しました。培養後、上清液は-80°Cで収集され、分析まで保存されました。

インスリン様成長因子1(IGF-1)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子2(FGF-2)、血管内皮成長因子(VEGF)、および形質転換成長因子β1(TGF-β1)などの成長因子濃度は、製造元の指示に従い市販の酵素結合免疫吸収アッセイ(ELISA)キットを用いて定量されました。使用されたキットは以下の通りです:ヒトIGF-1 ELISAキット、ヒトPDGF ELISAキット、ヒトFGF-2 ELISAキット、ヒトVEGF ELISAキット、ヒトTGF-β1 ELISAキット。すべてのサンプルと標準物質を重複分析し、マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸収を測定しました。4パラメータロジスティック(4-PL)回帰を用いて比較量の比較曲線を作成し、分析物濃度を決定しました^。

ELISAのステップ

サンプル希釈は、各ELISAキットの予想濃度範囲とメーカーの指示に従って決定されました。標準曲線範囲内に収まると予想されるサンプルは希釈せずに分析しました。予備測定値や予想される分析物濃度が標準曲線の上限を超える場合、キットに付属していた試料希釈剤で試料を希釈し、再分析しました。最終濃度は測定値に対応する希釈係数を掛けて計算されました。

FineTestキットの指示に従って連続希釈で調製された標準(100μL)と、希釈済みまたは適切に希釈されたサンプルが、事前にコーティングされた96ウェルマイクロプレートの各ウェルに加えられました。プレートは抗原結合のために37°Cで90分間インキュベートされました。すべてのサンプルと標準は重複分析されました。インキュベーション後、液体は洗浄せずに抽出され、各ウェルに100μLのビオチン標識検出抗体作動液が追加されました。プレートは37°Cで60分間培養されました。インキュベーション後、1ウェルごとに350μLの1×ウォッシュバッファーを使って3回の吸引および洗浄を行いました。洗浄バッファーは、各洗浄サイクル中に約1分間ウェル内に置かれ、結合していない成分を十分に除去しました。次に、各ウェルにホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)-ストレプタビジン共役作液100 μLを加え、プレートを37°Cで30分間培養しました。ウェルは1井戸あたり350μLのウォッシュバッファーを用いて5回洗浄され、バックグラウンド信号を最小限に抑えました。その後、各ウェルに90μLのテトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液を加え、プレートを37°Cで暗闇で10〜20分間インキュベートして色現像を行い、反応を目視で監視しました。酵素反応は、キットに付属していたストップ溶液50μLを各ウェルに加えることで終了し、青から黄色への色の変化をもたらしました。

吸収は、停止液を加えてから5分以内にマイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定されました。キットに含まれる既知の濃度を用いて標準曲線を作成し、その曲線は4パラメータロジスティック(4-PL)回帰モデルを用いて当てられました。サンプル濃度はそれに応じて計算され、希釈因子の有無を補正しました。

統計解析

数値変数は正規分布データでは平均±標準偏差として要約され、正規性仮定が満たされない場合は最小–最大値の中央値として要約されました。カテゴリ変数は頻度とパーセンテージで表されました。数値データの正規性はシャピロ–ウィルク検定を用いて評価されました。異なる時点で同じ個人から得られた繰り返し数値測定の比較には、パラメータ的仮定が満たされた場合に分散反復測定解析(ANOVA)が適用されました。それ以外の場合はフリードマン検定が用いられました。正規分布でない数値変数間の相関は、スピアマンのランク相関係数を用いて評価されました。統計解析は統計ソフトウェア(IBM SPSS Statistics バージョン26.0)を用いて行われ、両側 p値< 0.05は統計的に有意とされました。

結果

すべての参加者が3つの月経段階すべてでサンプリングを完了していたため、欠落データは観察されませんでした。全血液検査計数パラメータはすべてのサンプルで生理学的基準範囲内であり、サンプル品質の一貫性とPRF製剤の信頼性を支持しました。

月経期を通じた血液パラメータの評価

月経周期の各段階における血液学的パラメータの比較は表1に示されています。白血球(WBC)数は各月相で統計的に有意な変動(p < 0.05)を示し、月経期と比べて濾胞期および黄体期でより高い値が観察されました。平均血小板容積(MPV)および大血小板比(P-LCR)は、濾胞期で黄体期に比べて有意に低く(p < 0.05)。血小板数は有意な差はなく(p > 0.05)、濾胞期では数値的に高い値が観察されました。

...

ディスカッション

月経周期は、ホルモンの変動によって操られた複雑な生理学的プロセスであり、女性の体内のさまざまなシステムに変化をもたらします。本研究では、生理周期の異なる段階で採取した血液サンプルから得られるPRFの含有量を調査し、このPRF内の成長因子のレベルを解析しました。

月経周期は広く受け入れられている生理学的分類に基づき、3つの段階に分けられました:月経期(子宮内膜の脱落と関連)、卵胞期(エストロゲン値の上昇と卵胞の発達が特徴)、黄体期(排卵後のプロゲステロン分泌増加が特徴)^21,22.本研究では、相の割り当てと血液サンプル採取のタイミングの両方が、月経周期全体にわたるホルモンパターンを評価する従来の研究で報告された標準定義に従って決定されました。この分類の正確性は、定義された段階間で観察されたホルモン変化を評価することで本研究で確認されました。

結果...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
分析的均衡	精度バランス(可読性0.001 g)	サルトリウス	エントリス
採血管	抗凝固剤なしのガラス管(10mL)	BD	真空システム
遠心分離機	ベンチトップ遠心分離機	ヘティヒ	ユニバーサル320R
ELISAキット–FGF	ヒトFGFエリサキット	ファインテスト	EH0541
ELISAキット–IGF-1	ヒトIGF-1 ELISAキット	ファインテスト	ER0030
ELISAキット–PDGF	ヒトPDGF ELISAキット	ファインテスト	ER1240
ELISAキット–TGF-&ベータ;1	ヒトTGF-&β;1 ELISAキット	ファインテスト	EH0287
ELISAキット–VEGF	ヒトVEGFエリサキット	ファインテスト	EH0327
HRP–ストレプタビジン共役	ELISA試薬(キットに付属)	ファインテスト	キットに含まれています
インキュベーター	温度制御インキュベーター(37 & deg;C)	メマート	—
マイクロ遠心分離機チューブ	滅菌チューブ(1.5–2mL)	エッペンドルフ	—
マイクロプレートリーダー	450 nm吸収リーダー	バイオテック	ELx800
針	21Gの滅菌使い捨て針	BD	—
軌道シェーカー	調整式シェーカー(100rpm)	イカ	KS 3000 i制御
個人用保護具	手袋、白衣、防護メガネ	様々な	—
RPMI-1640 ミディアム	細胞培養培地	Gibco(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック)	11875-093
統計解析ソフトウェア	データ分析ソフトウェア(バージョン26.0)	IBM	SPSS統計
停止解	ELISA停止試薬	ファインテスト	キットに含まれています
TMB基板	ELISAの染色基質	ファインテスト	キットに含まれています
ウォッシュバッファー	ELISAウォッシュバッファー(1回回)	ファインテスト	キットに含まれています