このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

研究記事

成長因子放出を調節するためにコバラミンとαトコフェロールを用いた血小板富集フィブリンの強化

116 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/71016

⸱

2026年5月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, Faculty of Dentistry, University of Cukurova, 2Department of Biology, Faculty of Medicine, University of Cukurova

この記事について

サマリー

本プロトコルは、遠心分離前にコバラミンとα-トコフェロールによる濃縮によって血小板富むフィブリンの生物学的に微調整を行い、 in vitro 条件下で成長因子およびサイトカイン放出の制御された調節を可能にするアプローチを説明しています。

要約

血小板リッチフィブリン(PRF)は、その生体適合性と成長因子の持続的な放出により、再生歯科で広く使用される自己乳科バイオマテリアルです。近年の研究では、PRFの再生性能を高めるために生物学的に調節する方向にシフトしていますが、基本的な調製原理は変えていません。本研究は、遠心分離前にコバラミンおよびアルファトコフェロールによる濃縮によるPRFの生物学的微調整プロトコルを提示し、培養因子および炎症促進サイトカイン放出への効果をin vitro 条件下で評価します。健康なボランティアから採取された末梢血液サンプルは、固定された遠心分離プロトコルで処理されました。遠心分離前にコバラミンまたはα-トコフェロールを全血に加え、生体活性修飾PRFマトリックスを得ました。血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子β1(TGF-β1)、血管内皮成長因子(VEGF)、インスリン様成長因子-1(IGF-1)、線維芽細胞成長因子-2(FGF-2)、インターロイキン-1β(IL-1β)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)の放出プロファイルを、酵素結合免疫吸収アッセイを用いて24時間および72時間に定量化しました。コバラミン富集PRFはTGF-β1レベルの群間差異と炎症誘導サイトカイン放出の減少と関連し、より好ましい再生性微小環境へのシフトを示しました。対照的に、FGF-2およびIGF-1の増加は時間依存的で、すべてのグループで検出され、コバラミン特異的効果は認められませんでした。アルファトコフェロール富集PRFはVEGF放出の選択的増加を示し、血管形成の影響の可能性を示唆しました。これらの発見は、標的ビタミン強化がPRFのバイオ活性を制御しつつ、自己栄養素および抗凝固剤を含まない性質を保つことを示しています。このプロトコルは、生物学的に微調整する実用的な枠組みを提供し、将来の翻訳的および臨床応用のための調整可能な再生プラットフォームとしての利用を支援します。

概要

血小板富チフィブリン(PRF)は、その生体適合性、調製の容易さ、成長因子の持続放出能力により、歯周病学、インプラント歯科、口腔外科で広く採用されている第二世代の自己血小板濃縮物です1,2。PRFは抗凝固剤や外因性活性化剤を使わずに全血を遠心分離することで得られ、血小板や白血球を捕捉する三次元フィブリンマトリックスが形成されます。これらの細胞成分は、血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子β1(TGF-β1)、血管内皮成長因子(VEGF)、インスリン様成長因子1(IGF-1)、線維芽細胞成長因子2(FGF-2)などの成長因子の内因性貯蔵庫として機能し、組織再生中の血管新生、細胞移動、増殖、細胞外マトリックスの再構築を共に調節します3,4。

生物学的組成を超えて、PRFの再生性能は、そのフィブリンネットワークの構造や細胞構成要素の生物学的活動に強く影響されます。このため、近年の研究は従来の調製プロトコルを超え、PRFを受動的な足場ではなく、生物学的に調整可能なキャリアシステムとして概念化し始めています5,6。ヒアルロン酸やコラーゲンなどの生体材料の導入などの構造改変戦略は、PRFの物理的および機械的特性を変化させ、フィブリンの組織構造、機械的安定性、成長因子放出動力学の変化をもたらすことが示されています7。これらの発見は、PRFが特定の再生需要に適応できることを支持する証拠の蓄積に貢献しています。

バイオマテリアルベースのアプローチと並行して、ビタミンベースの濃縮はPRFの生物活性を調節するための生物学的に関連性の高い戦略として登場しています。ビタミンは代謝、酸化還元バランス、コラーゲン合成、血管新生、炎症シグナル伝達などの基本的な細胞プロセスを調節することが知られています。特に、アスコルビン酸、コレカルシフェロール、コバラミン、アルファトコフェロールなどのビタミンは、異なる分子経路を通じて細胞の挙動や組織の治癒に影響を与えることが示されています8。過去のin vitro研究では、ビタミン強化PRF製剤が成長因子放出プロファイル、炎症性サイトカイン発現、フィブリンマトリックスの生体力学的特性を調節できることが示されており、ビタミン補給はPRFの自己構造を変えずに生物学的に修飾する効果的な手段であることを示しています9。

コバラミン(ビタミンB12)とα-トコフェロール(ビタミンE)は、組織の恒常性と修復に関わる重要な生物学的プロセスに関与する必須の微量栄養素です。ビタミンB12は核酸合成、細胞代謝、赤血球生成に重要な役割を果たし、その欠乏は口腔粘膜の変異や歯周組織の分解と関連しています10,11。ビタミンEは強力な抗酸化物質として機能し、脂質過酸化を抑制し、酸化ストレスを軽減し、コラーゲンの安定化と炎症反応の調節に寄与します(12,13)。重要なのは、本研究がPRFのさまざまな生物学的および生理学的調節因子の探索を基盤としているものの、遠心分離前にコバラミンおよびアルファトコフェロールによる濃縮に特化した独自のプロトコルを導入している点です。したがって、本研究の目的は、コバラミンおよびアルファトコフェロール濃縮PRFを合成するための再現可能なプロトコルを記述し、このバイオアクティブ微調整アプローチがin vitro条件下で成長因子および炎症性サイトカイン放出に与える影響を評価することです。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

この実験研究はヘルシンキ宣言に示された倫理原則に従って実施され、チュクロヴァ大学臨床研究倫理委員会(承認番号:139/25)から承認を受けました。日付:2023年12月8日)。参加前に、すべての参加者に研究手順が説明され、各参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。ヒト血液サンプルを含むすべての手技は、機関のバイオセーフティ規則を遵守して実施されました。実験過程では、手袋、マスク、実験用コートなどの適切な個人用防護具(PPE)が使用されました。生物材料は無菌技術で取り扱われ、すべての廃棄物は確立されたバイオハザード管理プロトコルに従って処分されました。本研究で使用されるすべての試薬、消耗品、機器は材料表に記載されており、メーカーの詳細や再現性を確保するための関連仕様も含まれています。

1. 参加者選考
参加者は、研究手順の十分な遵守を示した20歳から30歳の全身的に健康な成人から募集されました。全身疾患、血液学的障害、または血小板機能や創傷治癒に影響を与えることが知られている状態の既往歴がある人は対象外とみなされました。追加の除外基準には、妊娠または授乳中、現在の喫煙、最近の感染症、コバラミンまたはアルファトコフェロールに対する既知の過敏症、および過去6か月以内に血小板活動を妨げる可能性のあるビタミンサプリメントや薬物の使用が含まれていました。生物学的変動を減らすため、正常なベースライン血液学的所見を持つボランティアのみを登録し、PRF製剤の適合性を確認するために全参加者を対象に評価を行った。予備的探索的臨床調査として、本研究は研究期間中の適格参加者の有無と実現可能性に基づくサンプルサイズを用い、12名の参加者からサンプルを分析しました。

2. 血液採取とグループ配分
無添加剤の10 mLガラス管を無菌条件下で各参加者から末梢静脈血を採取しました。参加者一人あたり合計5本のチューブが取得されました。1本のチューブは全血球数解析に割り当てられ、1本はベースラインの血清コバラミンおよびα-トコフェロールレベルの測定に用いられました。残りの3本のチューブは、血小板リッチフィブリン(PRF)製剤に割り当てられました。そのうち、1本のチューブが添加剤なしの対照PRF群として機能し、1本のチューブは遠心分離前にコバラミン(1 mL)を投与してコバラミン濃縮PRFを得、1本のチューブは遠心分離前にアルファトコフェロール(0.5 mL)を投与してアルファトコフェロール濃縮PRFを得ました。コバラミンは無菌注射液(1000 μg/mL)として投与され、アルファトコフェロールはアンプル(2 mL)として使用されました。すべてのサンプルは血液採取直後に処理され、早期凝固を避けました。

3. PRF準備
各参加者から無菌で抗凝固剤を含まないガラス管で末梢静脈血液サンプルを採取しました。採取直後、チューブは遠心分離機に入れられ、早期凝固を防ぐために遅延なく処理されました。遠心分離は2700rpm(708 × g)で12分間(室温)で、固定角度ローターシステムを用いて行われました。遠心分離が完了すると、下位赤血球分画、上位血小板不足の血漿層、そして中間層の血小板富フィブリン(PRF)の3つの異なる層が観察されました。PRF血栓は無菌器具を用いて赤血球層から慎重に分離され、さらなる処理のために分離されました。濃縮PRF基の調製のために、標準化された条件下で遠心分離直前に指定された添加物を血液サンプルに導入しました。このアプローチにより、血栓形成時に生体活性化合物を形成中のフィブリンマトリックスに組み込むことが可能となりました(図1)。

figure-protocol-1
図1:PRFサンプル取得方法論的手順を示すフローチャート。遠心分離前に1mLのコバラミン(A)と0.5mLのアルファトコフェロール(B)が血液サンプルに加えられました。その結果得られたPRFサンプルはチューブ内(C)および赤血球層(D)から分離された後に採取されます。最終的なコバラミン強化PRF(E)およびα-トコフェロール強化PRF(F)です。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. PRFサンプルの in vitro 培養
各PRFクロットは滅菌チューブに移され、細胞培養培地は1 mL 1 gあたり1 mL(1:1、v/w)で添加され、すべてのサンプルで一貫した拡散環境を確保しました。チューブは軌道シェーカーに置かれ、37°Cで合計72時間インキュベートされ、PRFマトリックスからの成長因子とサイトカインの徐々の放出を促進しました。上清液は24時間と72時間に採取され、無菌マイクロチューブに移され、−80°Cで保存され、さらなる分析が行われました。細胞培養培地は血清補給なしで使用され、外因性成長因子の干渉を避け、測定されるすべての生体分子がPRFマトリックスのみ由来であることを確実にしました。

5. 成長因子ELISA分析
採取した上清液中の血小板由来成長因子(PDGF)、形質変形因子β1(TGF-β1)、血管内皮成長因子(VEGF)、インスリン様成長因子1(IGF-1)、線維芽細胞成長因子2(FGF-2)、インターロイキン1β(IL-1β)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)の濃度は、製造元の指示に従い酵素結合免疫吸着アッセイキットを用いて定量化しました。450nmでマイクロプレートリーダーを用いて吸収度値を測定し、分析物濃度は標準校正曲線に基づいて算出されました。

6. 統計分析
統計解析はIBM SPSS Statistics for Windows(バージョン20.0)を用いて実施されました。データは平均±標準偏差および該当する中央値(最小–最大値)で表されました。データ分布の正規性はシャピロ–ウィルク検定を用いて評価されました。グループ内比較は、対t検定またはウィルコクソン符号付きランク検定を用いて行われ、グループ間比較は分散の反復測定解析またはフリードマン検定を用いて行われました。 p値は統計的に有意とみなされ<0.05でした。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

対照、コバラミン豊富、アルファトコフェロール濃縮血小板富むフィブリン(PRF)の成功した製剤が全参加者で達成されました。巨眼検査により、フィブリン完全性が保たれ、十分な機械的安定性を持つ構造の良好なPRF血栓の形成が確認され、標準化された取り扱い、培養、その後の生化学的解析が可能となりました(表1)。

変数時間グループグループ間比較グループ(時間)
制御コバラミンアルファ・トコフ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究は、遠心分離前にコバラミンおよびアルファトコフェロールによる標的濃縮によって、血小板富むフィブリン(PRF)を生物学的に微調整できることを示し、成長因子およびサイトカイン放出プロファイルの明確かつ再現性の高い調節をもたらすことを示しています。これらの発見は、PRFが単なる受動的な自己足場ではなく、再生特性を慎重に選択したバイオアクティブ介入によって調整できる生物学的に応答性のあるマトリックスであるという進化する概念を強化しています。

PRFは主に、その三次元フィブリン構造内に埋め込まれた血小板および白血球由来の成長因子の持続的な放出を通じて再生能力を発揮します。このフィブリンネットワークの構造と、閉じ込められた細胞成分の生物学的活動は、成長因子14の放出の大きさと時間的動態を決定する上で重要な役割を果たします。この文脈で、フィブリン重合前のバイオアクティブ濃縮は、PRF15の自己依存性かつ抗凝固剤を含まない性質を維...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルファトコフェロール(ビタミンE)AKSU FARMA、イスタンブール、トルコA11HA03アンプルEVIGEN 2 mL
遠心分離機(40°固定角度ローター)フランス・ニースでのPRFの手続き913023410238デュオ遠心分離機
コバラミン(ビタミンB12)デヴァ・ホールディング、イスタンブール、トルコ B03BA01アンプル DODEX 1000 mcg/mL  
エッペンドルフ管アクシゲンPCR-02-C200個
ガラス血液採取チューブヘマ&チューブ(トルコ・イスタンブール)HNM8080 (10 mL)抗凝固剤はなし
HRPソリューションELISAキットに含まれています
ヒューマンELISAキット - FGF武漢ファインバイオテックEH0541ファインテスト
ヒトELISAキット - IGF-1武漢ファインバイオテックER0030問題ないと、
ヒトELISAキット - PDGF武漢ファインバイオテックER1240問題ないと、
ヒトELISAキット - TGFβ-1武漢ファインバイオテックEH0287ファインテスト
ヒトELISAキット - VEGF武漢ファインバイオテックEH0327ファインテスト
ヒトIL-1&β;ELISAキット武漢ファインバイオテックEH0185ファインテスト
ヒトTNF-&α;ELISAキット武漢ファインバイオテックEH0302ファインテスト
マイクロピペット&ヒントエッペンドルフ31230000631セット
マイクロプレートリーダーバイオクロムEZリード400450 nm
軌道シェーカースチュアート SSM3ミニジャイロロッケ
精密スケールサルトリウスH51-D1ピース
RPMI-1640 細胞培養培地HyClone、シティバ、アメリカ合衆国SH30027.01500 mL
無菌ハサミASAデンタル(トルコ、イスタンブール)0305-11ピース
ストップソリューションELISAキットに含まれています
基板溶液ELISAキットに含まれています
ウォッシュバッファーELISAキットに含まれています

参考文献

  1. Dohan, D. M., Choukroun, J., Diss, A., Dohan, S. L., Dohan, A. J. J., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part I: technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).
  2. Miron, R. J., Zucchelli, G., Pikos, M. A., Salama, M., Lee, S., et al. Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry: a systematic review. Clin Oral Investig. 21 (6), 1913-1927 (2017).
  3. Kobayashi, E., Flückiger, L., Fujioka-Kobayashi, M., Sawada, K., Sculean, A., et al. Comparative release of growth factors from PRP, PRF, and advanced-PRF. Clin Oral Investig. 20 (9), 2353-2360 (2016).
  4. Choukroun, J., Diss, A., Simonpieri, A. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part IV: clinical effects on tissue healing. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e56-e60 (2006).
  5. Miron, R. J., Fujioka-Kobayashi, M., Bishara, M., Zhang, Y., Hernandez, M., Choukroun, J. Platelet-rich fibrin and soft tissue wound healing: a systematic review. Tissue Eng Part B Rev. 23 (1), 83-99 (2017).
  6. Ghanaati, S., Booms, P., Orlowska, A., Kubesch, A., Lorenz, J., et al. Advanced platelet-rich fibrin: a new concept for cell-based tissue engineering by means of inflammatory cells. J Oral Implantol. 40 (6), 679-689 (2014).
  7. Demirbilek, F., Alkaya, B., Ucak Turer, O., Yilmaz, M. B., Haytac, M. C., Ozcan, M. Enhancing platelet-rich fibrin: influence of hyaluronic acid and collagen on growth factor release and biomechanical properties in vitro. J Vis Exp. (222), e68693 (2025).
  8. Fawzy El-Sayed, K. M., Cosgarea, R., Sculean, A., Doerfer, C. Can vitamins improve periodontal wound healing/regeneration?. Periodontol 2000. 94 (1), 539-602 (2024).
  9. Ozcan, M., Topcu, B. E., Alkaya, B., Yilmaz, M. B., Ucak Turer, O., Haytac, M. C. Effects of ascorbic acid and cholecalciferol on growth factor release, cytokines, and biomechanical properties of platelet rich fibrin: in vitro. study. BMC Oral Health. 26 (1), 262 (2026).
  10. Kozlak, S. T., Walsh, S. J., Lalla, R. V. Reduced dietary intake of vitamin B12 and folate in patients with recurrent aphthous stomatitis. J Oral Pathol Med. 39 (5), 420-423 (2010).
  11. Alekhya, K., Muppirala, S. Oral manifestations of vitamin B12 (cobalamin) deficiency: a review. Int Healthc Res J. 3 (1), 9-15 (2019).
  12. Pavithra, R., Ramaprabha, G., Rajasekar, S., Lakshmi Sree, S. Vitamin deficiency and periodontal disease: a tie-in relationship. Sch J Appl Med Sci. 5 (1A), 74-81 (2017).
  13. Singh, N., Chander Narula, S., Kumar Sharma, R., Tewari, S., Kumar Sehgal, P. Vitamin E supplementation, superoxide dismutase status, and outcome of scaling and root planing in patients with chronic periodontitis: a randomized clinical trial. J Periodontol. 85 (2), 242-249 (2014).
  14. Miron, R. J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Optimization of platelet-rich fibrin. Periodontol 2000. 94 (1), 79-91 (2024).
  15. Miron, R. J., Estrin, N. E., Ahmad, P., Farshidfar, N., Fujioka-Kobayashi, M., et al. Thirty years of autologous platelet concentrates: from platelet-rich plasma to platelet-rich fibrin. J Periodontal Res. , (2025).
  16. Caruana, A., Savina, D., Macedo, J. P., Soares, S. C. From platelet-rich plasma to advanced platelet-rich fibrin: biological achievements and clinical advances in modern surgery. Eur J Dent. 13 (2), 280-286 (2019).
  17. Pietruszka, P., Chruścicka, I., Duś-Ilnicka, I., Paradowska-Stolarz, A. PRP and PRF-subgroups and divisions when used in dentistry. J Pers Med. 11 (10), 944 (2021).
  18. Dohan Ehrenfest, D. M., Bielecki, T., Jimbo, R., Barbé, G., Del Corso, M., et al. Do the fibrin architecture and leukocyte content influence the growth factor release of platelet concentrates? An evidence-based answer comparing a pure platelet-rich plasma (P-PRP) gel and a leukocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Curr Pharm Biotechnol. 13 (7), 1145-1152 (2012).
  19. Schär, M. O., Diaz-Romero, J., Kohl, S., Zumstein, M. A., Nesic, D. Platelet-rich concentrates differentially release growth factors and induce cell migration in vitro. Clin Orthop Relat Res. 473 (5), 1635-1643 (2015).
  20. Isobe, K., Watanebe, T., Kawabata, H., Kitamura, Y., Okudera, T., et al. Mechanical and degradation properties of advanced platelet-rich fibrin (A-PRF), concentrated growth factors (CGF), and platelet-poor plasma-derived fibrin (PPTF). Int J Implant Dent. 3 (1), 17 (2017).
  21. El Bagdadi, K., Kubesch, A., Yu, X., Al-Maawi, S., Orlowska, A., et al. Reduction of relative centrifugal forces increases growth factor release within solid platelet-rich-fibrin (PRF)-based matrices: a proof of concept of LSCC (low speed centrifugation concept). Eur J Trauma Emerg Surg. 45 (3), 467-479 (2019).
  22. Yaşar, N. &. #. 1. 9. 9. ;., Ünsal, G., Kocaelli, H. A., Orhan, K., Sağ, F. B. Comparative analysis of local application of titanium-platelet rich fibrin (T-PRF) and leukocyte-platelet rich fibrin (L-PRF) in bone defect healing: a micro-CT and histopathological study in rabbit models. Microsc Res Tech. 88 (7), 2073-2084 (2025).
  23. O'Leary, F., Samman, S. Vitamin B12 in health and disease. Nutrients. 2 (3), 299-316 (2010).
  24. Traber, M. G., Atkinson, J. Vitamin E, antioxidant and nothing more. Free Radic Biol Med. 43 (1), 4-15 (2007).
  25. Ozcan, M., Arçay Polat, G., Alkaya, B., Uçak Türer, O., Yilmaz, M. B., Haytac, M. C. Evaluation of circadian variation in growth factors of platelet-rich fibrin: a pilot study. J Vis Exp. (224), e68902 (2025).
  26. Ozcan, M., Ciritci Kabaklı, S., Alkaya, B., Isler, S. C., Ucak Turer, O., Oksuz, H., et al. The impact of local and systemic penicillin on antimicrobial properties and growth factor release in platelet-rich fibrin: in vitro. study. Clin Oral Investig. 28 (1), 61 (2024).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

PRF濃縮コバラムチン濃縮α-トコフェロールPRF再生歯科サイトカイン放出酵素結合免疫吸着法末梢血処理生物活性PRF
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。