振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

サマリー

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。

要約

虚血性脳卒中後のアストロサイト-ニューロン動態の調査は、脳卒中後の回復メカニズムを理解する上で不可欠です。しかし、現行の手法では、特定の行動課題を実行する動物におけるニューロンとアストロサイト間のリアルタイムの相互作用を捉えきれず、脳卒中病理の急性期を調査する能力が制限されています。本プロトコルは、光血栓性脳卒中モデリングと同時進行の多チャネル電気生理記録および覚醒時のファイバーフォトメトリーを組み合わせた統合手法を提示します。これはカスタム製造のオプトロードを用いた挙動マウスです。プロトコルには、光血栓症による局所虚血誘導と、同時にニューロンスパイクおよびアストロサイト性カルシウムの一過性を記録します。オプトロードは、光血栓症、カルシウム信号記録、オプトジェネティック操作を別々の手術を必要とせずに同時に投与することを可能にします。代表的な結果は、アストロサイト性カルシウム信号とニューロンのスパイピングを同時に記録する成功を裏付けています。アストロサイトのオプトジェネティック操作は、神経細胞の発火パターンに測定可能な変化をもたらします(ピラミッドニューロンの発火頻度が0.45 Hz±減少し、インターニューロンが3.64± 1.37 Hz減少し、光遺伝学前刺激と比較してn=2)。これにより、システムがアストロサイトとニューロンの相互作用を調査できることが確認されます。この統合的アプローチは、行動動物の急性期から慢性期の脳卒中までのリアルタイムかつ多重モダル記録を提供することで、脳卒中研究方法論の重要なギャップを埋めています。

概要

虚血性脳卒中は依然として主要な国際的な健康課題であり、世界的に死亡および長期後天性障害の主要な原因となっています^1,2,3。虚血性脳卒中に関連する高い障害率は、運動麻痺や感覚喪失から認知障害に至るまで、多様な臨床症状と関連^{しています。}修復期における虚血性脳卒中の病理学的および回復メカニズムについて、より深く理解することが緊急に求められています。神経不全を超えて、アストロサイトの壊滅的な機能不全が最近強調されています^7,8。最も豊富なグリア細胞であるアストロサイトは、中枢神経系および三部シナプスの重要な構成要素です。虚血性カスケードのあらゆる段階で、アストロサイトは不可欠な役割を果たし、神経および機能の回復に深い影響を与えます ^9,10,11。健康な脳では、アストロサイトとニューロンは三部シナプスを通じて機能的に結合しており、アストロサイトプロセスはシナプス前末端および後シナプス末端を覆い、シナプス伝達に積極的に関与しています^7,8。アストロサイトは興奮性アミノ酸トランスポーターを介して細胞外グルタミン酸濃度を調節し、Kir4.1チャネルを通じてカリウム恒常性を維持し、カルシウム依存性エキソサイトーシスによるグリオ伝達物質の放出を通じてシナプス強度を調節します^7,8。この文脈では、アストロサイト性細胞内カルシウム過渡期はアストロサイト活性を示し、ニューロンの発火と密接に関連して^います。虚血性脳卒中中には、この精密に調整された関係が急速に断絶されます。エネルギー障害後のイオン勾配の崩壊は大量のグルタミン酸放出と拡散脱分極を引き起こし、興奮毒性ニューロン損傷と反応性星形サイトの増加を引き起こします¹²。梗塞コア内外のアストロサイトは、カルシウム過負荷、グルタミン酸再取り込みの障害、シナプス結合の喪失、グリオ伝達物質¹³の放出不全など、病理学的変化の連鎖反応を経験します。同時に、ニューロンの生存能力や膜電位の完全性を失い、神経細胞のスパイキング活動は著しく抑制されます^14,15。梗塞周囲領域では、生存ニューロンと反応性アストロサイトが動的な相互作用を行い、これは脳卒中後の回復結果を決定する上で極めて重要と考えられています。しかし、覚醒中の行動動物におけるこの相互作用のリアルタイム電気生理学的およびカルシウム相関は依然として十分に特徴づけられていません^13,16。したがって、アストロサイト活動とニューロンシグナルを並べて理解することは、虚血損傷後の神経機能回復の基盤と考えられています。

光血栓症は広く使われている虚血性モデルです。感光性染料と局所光を用いて、特定の標的部位に虚血病変を誘発します¹⁷。現在の脳卒中モデリングおよび記録プロトコルは、脳卒中後のアストロサイト-ニューロン相互作用の研究を、3つの主要な技術的ボトルネック(17,18,19)によって妨げています。モデリングと記録の分離は、ほとんどの現行プロトコルで共通する欠点であり、モデルの確立とリアルタイム信号記録の間に時間差が生じ^ます。しかし、虚血性脳卒中後数分から数時間は、ニューロンとアストロサイトの両方が劇的な変動を経験する重要な期間です^12,22。虚血性事件直後のアストロサイトとニューロンの相互作用を同時にモニタリングしなければ、虚血性脳卒中の効果的な早期介入の調査は大きく妨げられます。現在のプロトコルのさらなる制約は、記録方式の孤立にあります。現在のほとんどの手法は単一の信号タイプに最適化されています。例えば、多チャネル電気生理学は神経細胞の発火や局所電位(LFP)の検出を提供しますが、グリア細胞のシグナル伝達状態には盲目です^15,16。逆に、in vivoを通じた星体細胞動態のモニタリングも可能です。カルシウムイメージングは星体細胞の変動を捉えますが、神経細胞の発火データは欠けています。現在のプロトコルの最後のボトルネックは動物の記録状況のようです。ほとんどのプロトコルでは、動物は麻酔か自由に動く状態です。しかし、運動機能障害は脳卒中後遺症の中でも最も厄介なものの一つと考えられています。特定の行動とアストロサイト-ニューロンイベントとの関連を理解することは不可欠です。したがって、特定の行動テストを行う覚醒マウスでアストロサイトおよびニューロン信号を同時に捉えつつ、光血栓性脳卒中モデルを実施できる統合的な手法が緊急に求められています。既存の手法は、これらの要件の一部にしか対応していません。二光子カルシウムイメージングは、完全な脳内のアストロサイトマイクロドメイン動態を卓越した空間分解能で提供しますが、動物を頭部固定または麻酔状態に置く必要があり、自然な行動評価は不可能であり、同時に多チャネル神経スパイクデータを取得することはできません¹³。独立したファイバーフォトメトリーは、自由に行動する動物のアストロサイト性カルシウムモニタリングを可能にしますが、神経の発火パターンには盲目であり、回路機能¹⁶の電気生理学的読み取りは提供しません。多チャネル細胞外電気生理学は、ニューロン単位および局所電位のスパイク活動を高い時間分解能で解消しますが、アストロサイト¹⁵のシグナル伝達状態に関する情報は提供しません。しかし、これらの手法はいずれも、同じ解剖部位から同時に局所的な光血栓性脳卒中を誘導し、途切れなくマルチモーダル記録を行うことはできません。

既存の技術的制約に対処するため、この統合システムを提案します。このシステムは、単一の慢性的に埋め込まれた装置内でこれら3つの制限すべてに対応し、光血栓症誘導、光ファイバー光度測定によるアストロサイト性カルシウム記録、そして目覚めた自由行動マウスにおける多チャネル神経電気生理学を脳卒中発症時から慢性期まで可能にします。この方法の実現可能性は、アストロサイト特異的カルシウム指示薬とオプトジェネティックウイルスベクターを発現したカスタム製造のオプトロードをマウスの脳に慢性的に移植することで検証されています。この方法を用いることで、アストロサイト性カルシウムの過渡期とニューロンの発火活動が、行動課題および光遺伝的調節下で同時に記録・解析されます。

プロトコル

このプロトコルは広州中医科大学(00379474)動物ケア・利用委員会の承認を受け、国立衛生研究所の実験動物ケア・利用ガイドのガイドラインと規則に従って実施されました。本研究で使用される動物の数を最小限に抑えるために、あらゆる可能な対策が講じられました。

1. ウイルスベクターの送達

注:この節では、アストロサイト特異的AAVベクターを運動皮質(M1FL)に立体的に注入する方法について説明します。目的は、オプトロード移植前にGCaMP6sカルシウム指示症およびオプトvTRAPオプトジェネシス構造体の安定的かつ特異的な発現を達成することです。必要な主な機器:立体型フレーム、デジタルバーニアシステム、ガラスマイクロピペット、マイクロ注入ポンプ。

1. マウスを誘導室に入れます。麻酔誘導を開始時は3%〜4%のイソフルランから始め、イソフルランの濃度は最初の1分間に最大5%まで増やし、マウスが反応しなくなるまで続けます。
   注意:イソフルランは揮発性麻酔薬です。すべての処置は能動換気下で行ってください。長時間の個人的な接触は避けましょう。
2. マウスを麻酔マスクを装着した立体誘導フレームに移し、1〜2%のイソフルランを使って深麻酔面を維持します。
3. 呼吸リズム、触覚反射、足の指のつまみで10分ごとに麻酔の深さを確認してください。フィードバック制御の加熱パッドでマウスの体温を36〜37.5°Cに保ちます。
4. 手術中の角膜損傷を防ぐために眼科軟膏を塗布してください。
5. マウスを耳バーと口バー付きのステレオタキシックフレームに固定します。耳バーを調整して、マウスの頭が左右対称に固定されているようにしてください。頭部を優しく探って固定してください。
6. 脱毛クリームでしっかりと毛を除去し、外科用ハサミで正中切開を行い頭蓋骨を露出させます。生理食塩水と綿棒を使って骨膜を洗浄し、ブレグマとラムダを露出させます。
7. ガラスマイクロピペットをブレグマとラムダに順次触れさせます。デジタルバーニアのZ座標に注目してください。マウスバーを調整して、差が<0.04mmになるようにしてください。
8. ガラスマイクロピペットをブレグマに触れるように下げ、デジタルバーニアをゼロにリセットします。ブレグマの左右に2.3mmずつマイクロピペットを動かします。デジタルバーニアのZ座標に注目してください。耳のバーを調整して、両側の差が<0.04mmになるようにしてください。
9. ブレグマでデジタルバーニアをゼロにリセットし、運動皮質(M1FL;AP: +1.5 mm, ML: +0.74 mm)。0.5mmのドリルビット(丸い先端)を使ったマイクロドリルを使い、指定された場所に直径約0.5mmの小さな穴を開けます。出血や脳組織の損傷を避けるために慎重にドリルを行ってください。掘削過程で発生する熱を補うために氷のような冷たい生理食塩水を落とします。
10. マイクロインフュージョンポンプに接続されたガラスマイクロピペットを標的部位(脳表面から-0.94mm)に下ろします。ローディング前に、AAV9-GfaABC1D-GCaMP6sとAAV9-GfaABC1D-opto-vTRAPを等量で混ぜてウイルスミックスを準備します。ミックスを400 nL(各ベクター200 nL)を50 nL/minのペースで注入します。
    注:ウイルスカクテルには、アストロサイト特異的カルシウム指標薬(AAV-GfaABC1D-GCaMP6s、1.0 × 10¹³ vg/mL)が200 nL、アストロサイト特異的光遺伝学ウイルスベクター(AAV-GfaABC1D-opto-vTrap、1 ×10¹³vg/mL)が200 nL含まれています。GFAPの免疫蛍光染色により、一部の動物でアストロサイト特異的トランスダクションの成功が確認され、GFAP陽性細胞と蛍光リポーターの共局在とGFAP陰性細胞では発現が認められないことが確認されました。
    注意:AAVベクターは組換え生物剤であり、機関のバイオセーフティガイドラインに従い、すべてのウイルスベクターおよび廃棄物を取り扱います。
11. 輸液終了後はピペットを10分間そのままにしておき、ウイルス拡散を促進し逆流を防ぎます。ピペットをゆっくり引き抜き、頭皮(4-0、20mm、3/8円)を縫合し、マウスを温熱パッドの上に置いて完全に回復します。
    注:最適なウイルス発現には3〜4週間の期間が必要です。プロトコルの詳細なタイムラインは図1Aに示されています。

2. 光学検査および機能検証

注:埋め込み前に、特注製作のオプトロードは物理的に検査し、光学的にテストし、光の3つの機能モード(光血栓症、オプトジェネティック刺激、ファイバーフォトメトリー)すべてで光を届けられるか確認する必要があります。必要な主な機器:顕微鏡、光パワーメーター、532nm、488nm、470nm、405nmのレーザー光源。

1. オプトロードの物理的検査:
   1. 製作したオプトロードを顕微鏡で観察し、記録部位の配置を確認します。
   2. 16本のタングステンマイクロワイヤーを均一に束ねて中央光ファイバーを囲んでいることを確認してください。曲がったり交差したりして電気ショートの原因となる配線がないか確認してください。
   3. 光ファイバーの先端がタングステンマイクロワイヤーより短いか確認してください(図1B)。
      注意:光ファイバーの先端は電^極先端から100〜200μmほど後退する必要があります。このオフセットはLeeら²²から採用されており、光錐が記録領域を十分に覆いながら過剰な光電ノイズを防ぐことを保証します。研究者は自身のオフロードで適切なオフセットを実証的に検証することが推奨されています。
2. 光ファイバーをレーザーモデリングソースおよび記録ソースに接続します。光パワーメーターを使って、以下の3つの機能モードのファイバーチップの出力を測定します(図1B):
   1. 光血栓モデリングモード:システムが高強度連続波(CW)光(532 nm)を供給できることを検証します。
      注:この実験ではNA 0.22のファイバーを使用しています。ファイバー先端より100〜200μm下の推定照射スポット直径は約200〜400μmです。ローズベンガルの活性化と血栓形成を確実にするために、先端の電力が>20 mWに達するようにしてください。
   2. オプトジェネティック操作モード:パルスレーザー出力(例:オプトvTrapの488nm)をテストします。
      注意:先端の電力を10 mWに校正してください。これは運動皮質の記録深度0.94mmでのOpto-vTRAP活性化に最適化されています。他の脳領域については、行動的または電気生理学的な検証が推奨されます。
   3. ファイバーフォトメトリー(カルシウム記録)モード:低出力励起光(例:470 nmおよび405 nm)をテストします。
      注意:長期記録中は、カルシウム指示薬(例:GCaMP6s)の光毒性および光漂白を最小限に抑えるため、出力を非常に低レベル(<50 μW)に保つことが必要です。

3. 慢性オプトロードの着床

注:このセクションでは、ウイルス注射部位にオプトロードを慢性的に移植するための外科的手順について説明しています。注入座標の正確な位置は、記録電極と光ファイバーサンプルがGCaMP6の領域および光-vTRAPの発現を確実に行うために不可欠です。必要な主な装備:立体定位フレーム、マイクロドリル、鉗子、頭蓋骨形成術のスクリュー、アガロースジェル、デンタルセメント。

1. 麻酔、立体固定、頭蓋骨の準備、バランス調整は、第1節で説明した手順と同じですが、頭皮の切開時に頭皮の1.5cm×1.5cmを切除しつつ、目の周囲の皮膚は十分に残します。
2. 頭蓋骨は過酸化水素と0.9%生理食塩水で洗浄してください。ブレグマを特定し、デジタルバーニアをゼロにリセットしてください。
3. ドリル(0.8mm、丸い先端)を使って頭蓋骨の表面を軽く粗くし、歯科セメントの接着性を高めます。
4. 運動皮質にマーカー(M1FL;AP: 1.5 mm, ML: 0.74 mm)を中心点として5 mm×5 mmの正方形を描きます(図1C)。
   1. 適切な速度(約10000rpm)でマイクロドリルを使い、四角をなぞります。掘削中は氷のように冷たい生理食塩水をドリル経路に絶えず落とし、高速ドリルによる熱を相殺し、脳組織の損傷を防ぎます。骨弁が緩んだ場合はすぐに停止してください(図1C)。
5. 対側半球と小脳の上に直径0.5mmの小さな穴を3つ開け、その穴に頭蓋形成術のネジを埋め込みます。各スクリューが硬膜に到達するようにしつつ、さらなる挿入や脳組織へのさらなる損傷は避けてください(図1C)。
6. 鉗子を使って先ほど緩んだ骨のフラップを取り除いてください。脳組織の損傷を防ぎ、硬膜を保つために、除去時に追加の下向きの力を加えないようにしてください。
   注意:出血が発生した場合は、止血スポンジを使って迅速に止血できます。
7. 超細かい先端(<0.03 mm × 0.01 mm)の鉗子を使って頭蓋の窓の硬膜を除去します。この過程で鉗子の先端が脳組織に直接挟まないように注意してください。
   注意:骨を除去した後は、脳組織を湿らせておくことが非常に重要です。処置が行われていない場合は、乾燥による腫れや神経障害を防ぐために、無菌の生理食塩水浸し綿球で窓を覆うことが推奨されます。
8. オプトロードを立体型フレームのマイクロマニピュレーターアームに固定し、頭蓋窓の上に移動させます。オプトロードの銀色接地線と基準線を3本の頭蓋形成術ネジにしっかりと絡めます(図1C)。
9. 頭蓋窓表面を滅菌生理食塩水で洗浄し、出血や血栓が電極挿入を妨げないか確認してください。オプトロードを所望の深さ(DV: -0.94 mm)までゆっくりと1 μm/sの速度で下げていきます。
   注意:着床時には露出した皮質組織を滅菌生理食塩水で湿らせてください。
10. 植骨後は頭蓋窓にアガロースの層を塗布し、歯科セメントから皮質組織を保護します。
11. 露出した頭蓋骨を覆うために3〜4層の歯科セメントを塗り、全体がしっかりと固定されるようにします。歯科セメントが硬くなったら、マウスを立体走位フレームから外します(図1C)。
12. 3〜5日間鎮痛剤を投与し、マウスが1〜2週間回復するまで記録とモデル化を行います。

4. 光血栓形成モデリングと同時記録

注:このセクションでは、行動慣化、基線記録、光血栓症による脳卒中誘導、脳卒中後の縦断記録手順について説明します。光血栓症は埋め込みされたオプトロードを通じて投与され、同時に電気生理学とファイバー光度測定の記録が行われます。必要な主な機器:ロータロッド装置、握力計、ファイバーフォトメトリーシステム、多チャンネル神経記録システム、ローズベンガル染料、530nmのレーザー光源。

1. モデリング前にマウスに行動トレーニングを受けさせましょう。
   注:すべての動物は標準化された実験室の条件下で飼育され、検査されました。居住環境:室温20〜25°C、相対湿度50〜60%、12時間の明暗サイクル(07:00に点灯)。研究期間中、動物は自由に食べ物と水にアクセスできました。すべての検査と手術は光期に行われました。光の段階では、神経活動の概日リズム変動やアストロサイトカルシウム動態を最小限に抑えるため、光フェーズ中に行動記録セッションが1日一定の時間に行われました。録音用囲いも20〜25°Cの常温に保たれていました。
   1. ロータロッドテストでは、マウスを回転する棒の上で3回連続で5分間連続走らせ、ロータロッドは5分で4回転から40回転まで加速します。
   2. 握力テストでは、マウスが前足でテストバーを引くことを覚えさせ、結果が10%未満で変動する3回連続の試行を完了させます。
2. ファイバーフォトメトリーのデータ取得パラメータを設定してください。
   1. カルシウム指標を励起するために、二重波長または三波長のファイバーフォトメトリーシステム(例:GCaMP6s)を用います。GCaMP6の場合、信号チャンネルを470nm、制御チャンネルを405nmに設定し、運動アーティファクトや自己蛍光を補正します。
      注意:光漂白や光毒性を避けるために、ファイバー先端の出力が20〜40μWの範囲であることを確認するために、記録レーザーの出力を再度テストすることが非常に重要です。
   2. データ取得のサンプリングレートを60〜100Hzに設定し、これは星形細胞性カルシウム過渡現象を捕捉するのに十分です。
3. マルチチャンネル電気生理学のデータ取得パラメータを設定してください。
   1. 録音システム内のすべての部品(握力テスト用機器やケージを含む)が適切に接地されているか確認し、ノイズを抑えましょう。録音時には共通中央値参照(CMR)を使用してグローバルなアーティファクトを除去します。
      注意:記録システム内の信号スペクトログラムビューを確認し、電力線干渉が存在せず、動きのアーティファクトによるノイズが最小限に抑えられることを確認することが非常に重要です。大きな可動アーティファクトは、インプラント手術中のスクリューや接地線固定の破損を示す可能性があります。
   2. 録音ソフトウェアで広帯域およびLFP信号を選択し、録音セッション中に発生するノイズを監視してください。
4. 基準記録を行いましょう。
   1. 短時間イソフルランで麻酔(60秒以内);アダプターを介してオプトロードを録音ラインに接続します。
   2. ネズミをケージのような環境で記録し、目覚めてから10分間の順応を待ちます。
   3. 握力テストと同時に記録を行う場合、マウスは1分ごとにテストバーを5分間引っ張る必要があります。
   4. マルチチャンネルおよびファイバー光度測定システムの両方で、挙動テストが正確にタイムスタンプを付けてデータの整合性を可能にすること(図1D)。
5. 光血栓形成モデルを確立する。
   1. 1.5%ローズベンガル染料溶液を腹管内(ip.)に10〜20 mg/kgの用量で投与し、造影料が皮質血管を循環するのを5分間待ちます。
      注意:ローズベンガルは光感作染料です。試薬を明るい環境光から守りましょう。取り扱いの際は手袋と目を保護することをおすすめします。
   2. 前述の誘導および維持パラメータに従い、イソフルランでマウスを麻酔します。
   3. マウスが深い麻酔面にいて麻酔マスクで維持されている場合、オプトロードの光学プローブをレーザー源に接続します。
   4. 530 nmのレーザービーム(15 mW)を埋め込み型オプトロードに5〜8分間照射し、局所性虚血を誘発します。
      注意:15 mWで530 nmのレーザーは危険です。すべての研究者はレーザー安全保護眼を保護する必要があります。光血栓症中は、繊維の先端を直接見てはいけません。
6. 脳卒中後の記録を行います。
   1. マウスを加熱パッドの上に置いて回復します。マウスが完全に目覚めたら(通常10分以内)、最初の脳卒中後急性記録を開始します。
   2. 病気の進行状況を綿密に監視するために、毎日繰り返し記録してください。
7. オプトジェネティック操作を行う。
   1. カルシウム信号の記録や虚血誘導のためのレーザービームの放出に加え、オプトロードはオプトジェネティック刺激も提供可能であり、代表的な結果(図4)に示されています。
   2. オプトロードを適切なレーザー波長と出力(この場合は488 nm、10 mW、Opto-vTrapで5分)を持つオプトジェネティックレーザー刺激器に接続し、刺激装置をオンにしてオプトジェネティック操作を行います。

5. マルチモーダルデータ解析パイプライン

注:このセクションでは、マルチチャネル電気生理学データの処理(スパイクソーティング)、アストロサイトカルシウムシグナル(ΔF/F計算)、および2つのデータストリームのクロスモーダルアライメントの解析ワークフローを概説します。必要なソフトウェア:Plexon Offline Sorter(オフラインスパイクソーティングソフトウェア)、NeuroExplorer(神経データ解析ソフトウェア)、RWD OFRS(ファイバーフォトメトリー)解析ソフトウェア。

1. ニューロンスパイクのソート(プレクソンシステム):
   1. 生の.pl2ファイルをオフラインのスパイクソーティングソフトにインポートします。デジタル高バンドパスフィルター(<300 Hz)を適用して高周波スパイク活動を分離します。
   2. 電圧閾値(通常はノイズの-5標準偏差)を設定して、潜在的なスパイクを検出します。
   3. ノイズ波形の手動スクリーニングと無効化後、オフラインスパイクソーティングソフトウェアのスキャン機能を使って主成分解析(PCA)を行い、波形をグループ化し、異なるニューロンクラスターをスキャン^します。
   4. スパイク間(ISI)ヒストグラムを調べてください。各「シングルユニット」のISI違反率が<1%(不応期を反映)であることを確認しましょう。ISI違反率は、オフラインスパイクソーティングソフトウェアの各ユニットの左上隅に表示されています。
   5. ソートされたタイムスタンプをニューラルデータ解析ソフトにエクスポートします。神経データ解析ソフトウェアのレートヒストグラムおよびイベント周辺ヒストグラム対時間関数を用いて、レートヒストグラムおよび刺激前後時間ヒストグラム(PSTH)を生成します。
   6. 各ユニットの平均波形長と平均発火率をニューラルデータ解析ソフトウェアの統計セクションから出力し、さらなる解析を行います。
2. アストロサイト性カルシウム信号処理(ファイバー光度解析ソフトウェア)
   1. 解析ソフトウェアで生の蛍光データ(信号用470nmチャネル、モーションコントロール用410nmチャネル)を開きます。
   2. ファイバーフォトメトリーシステムの 前処理 セクションでは、410 nmを動作補正の制御として実行し、 平滑化係数 を8に設定し、 PLS Fit を基準補正として選択します。
   3. 蛍光の変化(ΔF/F)は式²⁵を用いて計算します。
      
   4. イベントタイムスタンプに基づくアストロサイトのカルシウム信号解析を行い、可視化用のイベント周辺データを抽出(例:ヒートマップや平均トレース)、曲線下面積(AUC)を計算します。
3. 同期アストロサイト-ニューロン相関
   1. 共有された行動イベントのタイムスタンプをタイムゼロとしてニューロンスパイクとアストロサイトカルシウム信号を整列させます。
   2. ペリイベントデータを抽出した後、2つのデータストリームをこの共有時間ゼロに整列させ、アストロサイト-ニューロンの相関を可視化します(図3)。

結果

実験的タイムライン

図1 は実験のタイムラインと主要な外科的節目をまとめています。ウイルス注射から外移植までの3週間の間隔は、適切なGCaMP6s発現を得るために重要であり、脳中誘導前の基線記録期間中にファイバー光度測定の痕跡を調べて堅牢な星状細胞カルシウムシグナルを確認する必要があります。

光血栓モデリングの多次元検証

局所性虚血の誘発は、 in vivo、組織学的、行動的証拠によって裏付けられています。

レーザースペックルイメージングは、照射領域における脳血灌流の低下をリアルタイムで示します。脳卒中後の血流確認のためのレーザースペックル造影画像(LSCI)は、短時間のイソフルラン麻酔(1.5–2%、維持...

ディスカッション

ここで述べた統合プロトコルは、虚血性脳卒中進行中のアストロサイトとニューロンの相互作用研究において大きな進歩を示しています。光血栓誘導とリアルタイムの光電気生理モニタリングおよびオプトジェネティック操作を組み合わせることで、この手法は脳卒中発症とニューロンおよび星形細胞の回路レベルの再編成の観察との間のギャップを効果的に埋めます。Boyceらの最近の研究は、自由行動のマウスにおける脳卒中中の繊維光度測定と電気生理学記録の実現可能性を示し、この文脈におけるマルチモーダルアプローチの価値を確認しました。現在の統合オプトロードシステムは、同じ埋め込み装置内にアストロサイトのオプトジェネティック操作を組み込むことで、記録のみのアプローチでは不可能なアストロサイトとニューロンの相互作用の因果的調査を可能にする²⁶。

図1に示された記録設定は、記録と行動課題を組み合わせるサンプル設定を提供します。なぜなら、前肢は一次運動皮質(M1FL)の前肢領域に埋め込まれており、前肢のグリップ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2% TTC染色溶液	Solarbio	G3005
アゴロース	Biosharp	BS081
体温維持システム/恒温モニター	RWD life Science	69002
頭蓋骨ねじ	Zhongke Huida	23092007
データ取得および分析ソフトウェア(ファイバーフォトメトリー)	RWD life Science	ORFs
データ取得および分析ソフトウェア(多チャンネル電気生理学)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
デジタル実験室用立体視フランジ	RWD life Science	68804
鉗子	FST	11252-00	鉗子の直径0.005mm ´ 0.025mm
レーザーパワーメータ	Sanwa	LP10
レーザースペックル血流イメージングシステム	Pericam AB	Pericam PSI NR
マウス	Risemice	C57BL/6J
小型ハンドヘルド頭蓋骨ドリル	RWD life Science	78001
マウス用ウイルスマイクロインジェクタ	RWD life Science	68025
オプトロード	カスタマイズ	Kedou	16本のタングステン電極と1本の光ファイバーでカスタマイズ
Prism	GraphPad	5.01バージョン
R studio	Posit	バージョン4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	アストロサイト特異的カルシウムインジケータ
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	アストロサイト特異的オプトジェネティックウイルスベクター
ローズベンガル染料	Sigma-Aldrich	198250	血栓誘導用感光性染料/Sigma-Aldrich
トロリー搭載麻酔ワークステーション	RWD life Science	R520	マウス用制御可能な吸入麻酔のための麻酔機