ここでは、減衰BSL-2承認の 結核菌 のバイタル内画像診断プロトコルを提示します。マウス肺への圧力を永久肺窓で使用します。このアプローチにより、同じ肺微小環境内での初期宿主-病原体相互作用、例えば細菌局在、血管動態、マクロファージ取り込みなどの長期的単細胞分解解析が可能です。
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この記事について
サマリー
要約
イントラバイタル顕微鏡検査は、保存状態の全ての組織内で動的な細胞過程を直接可視化することを可能にします。しかし、結核菌(Mtb)への応用は、バイオセーフティレベル3(BSL-3)の封じ込め要件や、高解像度画像撮影のための肺の安定化という技術的課題により制限されています。ここでは、胸部の高解像度画像化マウス肺(WHRIL)と、BSL-2条件下での使用が承認された遺伝子定義された三重補助栄養性Mtb株mc27902を組み合わせたプロトコルを紹介します。また、mc27902のtdトマト発現誘導体mc28471の生成、静脈内感染への調製、およびレポーターマウスにおけるバイタル内イメージングへの応用についても説明しています。このシステムは、感染後最初の3日間に同じ肺微小環境内での迅速な細菌侵入、凝集、肺実質への拡散、マクロファージの取り込みを含む早期感染動態のリアルタイム可視化を可能にします。単一細胞分解能でバチル菌と宿主–病原体相互作用の縦断イメージングを可能にすることで、従来のイメージングや高封じ込めモデルに伴う主要な制約を克服します。このプロトコルは、肺内の減毒されたマイコバクテリアのリアルタイムインバイタルイメージングのための実用的なBSL-2互換プラットフォームを提供し、細菌生理学、宿主認識、免疫介在性クリアランスの機構研究の基盤を築きます。
概要
高解像度の生命体内顕微鏡法は、細胞移動、血管間相互作用、免疫監視を単一細胞分解能1,2,3,4で直接可視化することで、無傷組織内の動的な細胞挙動の研究を変革しました。これらのアプローチはがん研究で広く用いられていますが、呼吸運動、組織の脆弱性、バイオセーフティの制約により肺感染症への応用は制限されています。最近の胸部イメージングプラットフォームの進歩、例えば真空安定化および永久埋め込み型光学窓は、これらの技術的課題の多くに取り組み、長期間にわたる肺微小環境の安定かつ無動作の画像化を提供しています。6,7,8,9,10 .特に恒久的に埋め込み可能な窓は、血管の流れ、免疫細胞の....
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プロトコル
すべての手技は機関のバイオセーフティおよび動物ケアガイドラインに従って実施され、アルバート・アインシュタイン医科大学動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認されました。株mc28471は、bc-2用途が承認された三重補助栄養型Mtb株mc27902のpYUB1169転質株です。生きた細菌を扱うすべての作業は、マイコバクテリアを取り扱う際の標準的な予防措置に従って行われました。
1. BSL-2承認のtdトマト発現型MTB株mc28471の製造
- プラスミド形質転換によるtdトマト発現BSL-2安全なmc28471の生成
- BSL-2承認の三重補助栄養株mc27902を、G13プロモーターから発現したtdトマト遺伝子を含むエピソーマル菌類プラスミドpYUB1169と転換し、蛍光誘導体mc28471を生成します。
- 100 μLのmc27902(600 nm(OD600 nm)で0.7-1.0)を無菌ミドルブルック7H9に接種し、30 mLのインク壺ボトルにOADC濃縮(10% (v/v))、グリセロール(0.2% (v/v))、 D-パントテネート(24 mg/L)、 L
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結果
電気穿孔およびカナマイシン選択後、MC2 8471の単離コロニーは鮮やかな赤色蛍光を示し、安定したtdトマト発現を確認しました。MC28471バチルを増殖させ、単細胞懸濁液として準備し、手術的に埋め込まれたWHRILを持つマウスに静脈内投与しました。肺微小環境における初期のMTB感染動態を可視化するために、バイタル内イメージングが実施されました。本研究では、感染前の肺血管のベースライン画像を取得し(図1A)、その後60分以内、6時間後、そしてMC28471をRag2-/-×MacBlueマウスに注射後3日後に取得しました(図1B-D、図2A-B、図3A-C、補足ビデ.......
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ディスカッション
このプラットフォームは、BSL-2条件下で無事哺乳類肺内の細菌と宿主細胞の相互作用を直接可視化することで、結核研究における真のギャップを埋めます。従来のin vivoイメージング戦略には、ファイバーオプティック微小内視鏡励起20、報告酵素蛍光イメージング21、近赤外蛍光タンパク質発現Mtb22を用いたものがあり、細菌負荷や薬物反応の高感度な縦断モニタリングが可能でしたが、これらは細菌負荷の集合を測定し、個々の細菌群や小規模な細菌群の解明、集合動態の追跡、空間的分布の明らかにはできませんマイコバクテリアと保存状態の完全な組織構造内の宿主細胞との関係。BSL-3互換多光子システムは肺24で病原性のMtbの画像化の原理実証を実証していますが、そのような実装には多くの研究室では利用できない専門的な封じ込めインフラが必要です。本研究は、シブラフィッシュ
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開示事項
著者らは競合する財務的利益やその他の利益相反を一切認めていません。
謝辞
この研究は以下の助成金によって支援されました:AI26170;エヴリン・リッパー・ファミリー財団およびグルス・リッパー・バイオフォトニクス・センター。NCIがんセンター助成金P30 CA013330の支援を受けた分析画像施設からの支援に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 ml conical tube | Corning | 430790 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, Inc | LA55G | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| 5-0 silk purse-string suture | Ethicon, Inc | 640G | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | 10 μLのブプレノルフィン（0.3 mg/mLの原液）を90 μLの無菌PBSに希釈した注射液（最終投与量＝0.1 mg/kg） |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 234790 | |
| D-calcium pantothenate | Acros | 243305000 | |
| ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety stand | BTX Harvard Apparatus | 45-0051 | |
| Electroporation cuvette | Fisher Scientific | FB102 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | 150 kDa |
| Glycerol | Fisher Chemicals | G33-1 | |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | 肺窓移植手術中、肋骨を把持し、挙上するために |
| Isoflurane | Pivetal | 78949580 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Kanamycin | Goldbio.com | K-120-25 | |
| L-arginine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | A5131-100G | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| MacBlue mice | Jackson Labs | Strain #: 026051 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | Difco | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | Becton Dickinson | 212351 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| PETG media inkwell bottle | Thermo Scientific | 342020 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-5623 | 手術中の挿管によってマウスの呼吸量をモニタリングするために |
| Plasmid pYUB1169 | Custom made plasmid | ||
| Rag2 KO mice | Jackson Labs | Strain #: 008449 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Sodium propionate | Thermo Scientific | A17440.36 | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB705 | |
| Sorval Centrifuge X pro series | Thermo Scientific | 75009020 | |
| Spectrophotometer Genesys 10 UV | Thermo Spectronic | 335903 | |
| SurgiSuite | Kent Scientific | SURGI-M02 | マウス用多機能手術台、保温機能付き |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22G |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T0307-50G | |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
参考文献
- Scheele, C., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-26 (2022).
- Niesner, R. A., Hauser, A. E., Entenberg, D. Life Through a Lens: Technological Development and Applications in Intravital Microscopy. Cytometry ....
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