ここでは、減衰BSL-2承認の 結核菌 のバイタル内画像診断プロトコルを提示します。マウス肺への圧力を永久肺窓で使用します。このアプローチにより、同じ肺微小環境内での初期宿主-病原体相互作用、例えば細菌局在、血管動態、マクロファージ取り込みなどの長期的単細胞分解解析が可能です。
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この記事について
サマリー
要約
イントラバイタル顕微鏡検査は、保存状態の全ての組織内で動的な細胞過程を直接可視化することを可能にします。しかし、結核菌(Mtb)への応用は、バイオセーフティレベル3(BSL-3)の封じ込め要件や、高解像度画像撮影のための肺の安定化という技術的課題により制限されています。ここでは、胸部の高解像度画像化マウス肺(WHRIL)と、BSL-2条件下での使用が承認された遺伝子定義された三重補助栄養性Mtb株mc27902を組み合わせたプロトコルを紹介します。また、mc27902のtdトマト発現誘導体mc28471の生成、静脈内感染への調製、およびレポーターマウスにおけるバイタル内イメージングへの応用についても説明しています。このシステムは、感染後最初の3日間に同じ肺微小環境内での迅速な細菌侵入、凝集、肺実質への拡散、マクロファージの取り込みを含む早期感染動態のリアルタイム可視化を可能にします。単一細胞分解能でバチル菌と宿主–病原体相互作用の縦断イメージングを可能にすることで、従来のイメージングや高封じ込めモデルに伴う主要な制約を克服します。このプロトコルは、肺内の減毒されたマイコバクテリアのリアルタイムインバイタルイメージングのための実用的なBSL-2互換プラットフォームを提供し、細菌生理学、宿主認識、免疫介在性クリアランスの機構研究の基盤を築きます。
概要
高解像度の生命体内顕微鏡法は、細胞移動、血管間相互作用、免疫監視を単一細胞分解能1,2,3,4で直接可視化することで、無傷組織内の動的な細胞挙動の研究を変革しました。これらのアプローチはがん研究で広く用いられていますが、呼吸運動、組織の脆弱性、バイオセーフティの制約により肺感染症への応用は制限されています。最近の胸部イメージングプラットフォームの進歩、例えば真空安定化および永久埋め込み型光学窓は、これらの技術的課題の多くに取り組み、長期間にわたる肺微小環境の安定かつ無動作の画像化を提供しています。6,7,8,9,10 .特に恒久的に埋め込み可能な窓は、血管の流れ、免疫細胞の動態、単細胞の挙動を数時間から数週間にわたって繰り返し可視化できるため強力なツールであり、がん転移、血管透過性、免疫監視のメカニズムの定義に重要な役割を果たしています(11,12)。
これらの進歩にもかかわらず、イントラバイタルイメージングはこれまで、生体内哺乳類肺におけるマイコバクテリウム結核(Mtb)感染に対して単細胞分解能で適用されたことはありません。最も近い前例は、他の環境でのマイコバクテリア感染のインバイタル画像検査です。ゼブラフィッシュ胚13におけるマイコバクテリウム・マリナム感染のリアルタイム画像では、早期マクロファージ相互作用と肉芽腫の開始が明らかになり、マウス肝臓14,15におけるBCG誘発肉芽腫の2光子画像では、肉芽腫発生中のマクロファージおよびT細胞の動態が明らかになり、肉芽腫性病変における抗原提示およびT細胞エフェクター機能の制限が示されました。これらの研究は菌菌の宿主-病原体相互作用に関する基礎的な知見を確立しましたが、完全な哺乳類肺にはアクセスできませんでした 8,16。
バイタル内イメージング手法は、肺の他の感染的および生物学的文脈にも適用されており、一般的な肺の画像診断8件は、パトロールする肺胞マクロファージが免疫系から細菌を隠すことを明らかにし、人間の肺におけるSARS-CoV-2感染に対する即時の骨髄反応を特徴づけた研究17.イントラバイタルイメージングは同様にインフルエンザ感染肺にも応用されており、感染した肺組織内の動的な免疫細胞の挙動を直接可視化することが可能です(18,19)。
ファイバーオプティック微小内視鏡励起20とレポーター酵素蛍光技術21,22を用いた全身光学イメージング手法により、マウス肺におけるMtbの感度検出は可能となりましたが、個々のまたは小さな菌群の検出、細菌の集まり動態の追跡、または無傷肺組織内でのマイコバクテリアと宿主細胞の直接的な相互作用の可視化はできません。感染肺に対して、BSL-3環境においてSARS-CoV-2感染23およびMtb焦点24多光子イメージングプラットフォームを含む高封じ込め型イントラバイタルイメージング手法が実施されています。これらの研究は感染した肺を封じ込め下で撮影することの実現可能性を示していますが、技術的には依然として要求が高く、広く利用可能ではありません。病原性MTBの治療にはBSL-3の封じ込めが必要であり、生命体内画像診断において重大な工学的およびバイオセーフティの課題を課しています。その結果、初期Mtb感染の多くの研究は、肺内の細菌の行動の空間的・時間的動態を捉えられない静的なエンドポイントアッセイに依存しています。
遺伝的に定義され、BSL-2承認された三重補助栄養型Mtb株の開発は、これらの制限を克服するユニークな機会を提供します。mc27902株は、H37Rvのパントテネート-ロイシン-アルギニンMtb補助栄養誘導体であり、完全に減衰しており、免疫不全マウスでは複製できず、古典的な酸ファスト染色を維持し、正常なファージ感受性を示し、BSL-3施設外でも安全に取り扱えます。これらの特性により、mc27902はバイオセーフティ封じ込めが低かった状態でのバイタル内イメージング手法の確立や宿主-病原体早期相互作用の調査に理想的な代替株となります。
ここでは、三重補助栄養性Mtb株mc27902の蛍光tdトマト発現誘導体mc28471を用いた高解像度肺画像ウィンドウ(WHRIL)を用いて、未開のマウス肺における早期Mtb感染を可視化します。免疫抑制状態のRag2-/-マウス26とMacBlueマウス27を交配して実験を行い、Csf1rプロモーターが単球、ミクログリア、樹状細胞やマクロファージのサブセットにおける増強シアン蛍光タンパク質(ECFP)の発現を駆動します。MacBlueトランスジーンは、初期のMtb感染時に単核食細胞集団を明確に可視化することを可能にします。Rag2欠損マウスを用いて、最も初期の宿主-病原体相互作用にシステムを集中させ、ここで検討した短い画像期間中の適応免疫応答の複雑さを避けるために選びました。重要なのは、この技術はRag2欠損マウスに限定されず、免疫能力のある動物でも実施可能であるという点です。
恒久的な肺ウィンドウとBSL-2互換蛍光減衰型Mtb株を組み合わせることで、このプラットフォームは同じ肺微小環境内で単一細胞分解能で複数日にわたる細菌と宿主細胞の相互作用を連続的にバイタル内イメージングすることを可能にします。ここで早期感染の実証は示されていますが、プラットフォーム自体は初期の時期に限定されておらず、実験モデルや研究設計によっては後期段階にも適用可能です。このイメージングプラットフォームの成功する適用は、ここで説明する特定の蛍光細菌調製剤の使用に依存するため、その試薬を生成・調製するために必要な基本的な手順を完全なプロトコルの一部として含めました。このプラットフォームは、Mtbの生 体内での行動を直接リアルタイムで画像化し、細菌生理学、宿主認識、免疫介在性クリアランスの将来の機構研究の基盤を築きます。
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プロトコル
すべての手技は機関のバイオセーフティおよび動物ケアガイドラインに従って実施され、アルバート・アインシュタイン医科大学動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認されました。株mc28471は、bc-2用途が承認された三重補助栄養型Mtb株mc27902のpYUB1169転質株です。生きた細菌を扱うすべての作業は、マイコバクテリアを取り扱う際の標準的な予防措置に従って行われました。
1. BSL-2承認のtdトマト発現型MTB株mc28471の製造
- プラスミド形質転換によるtdトマト発現BSL-2安全なmc28471の生成
- BSL-2承認の三重補助栄養株mc27902を、G13プロモーターから発現したtdトマト遺伝子を含むエピソーマル菌類プラスミドpYUB1169と転換し、蛍光誘導体mc28471を生成します。
- 100 μLのmc27902(600 nm(OD600 nm)で0.7-1.0)を無菌ミドルブルック7H9に接種し、30 mLのインク壺ボトルにOADC濃縮(10% (v/v))、グリセロール(0.2% (v/v))、 D-パントテネート(24 mg/L)、 L-ルイシン(50 mg/L)、 L-アルギニン(200 mg/L)、プロピオネートナトリウム(0.1 mM)、およびチロキサポル(0.05% (v/v))を補足します。
- 培養を37°Cでゆっくり(100rpm)振って、OD600 nmの0.7〜1.0に達するまで培養します。
- 細胞を15mLの円錐形遠心分離機チューブに移し、室温で3,000 x g の離心分離機で10分間分離します。上清液を廃棄し、細胞を0.05%(v/v)チロキサポルを含む10 mLの滅菌10%グリセロールに再懸濁します(洗浄#1)。遠心分離と洗浄を2回繰り返します。細胞ペレットを0.175mLの10%グリセロールに再懸浮させ、0.05%(v/v)のチロキサポルを含むと、pYUB1169 DNA2 μL(100〜200 ng ng)を加えます。
- mc27902とpYUB1169を0.2 cmの電気穿孔キューベットに移します。10分待って。キュベットを2回から3回叩いて気泡を取り除き、室温で2,500 mV、1,000 Ω、25 μF、時間定数20 msで電解します。
- 無菌ミドルブルック7H91mLにOADC濃縮(10% (v/v))、グリセロール(0.2% (v/v))、 D-パントテネート(24 mg/L)、 L-ルイシン(50 mg/L)、 L-アルギニン(200 mg/L)、プロピオネートナトリウム(0.1 mM)、チロキサポル(0.05% (v/v))を加え、クベットの内容物を15 mLの円錐形遠心分離機チューブに移します。チューブを37°Cで揺らしながら一晩孵化します。
- 変換混合物の0.1mLをミドルブルック7H10寒天プレートにプレートし、OADC濃縮剤(10%(v/v))、グリセロール(0.2%(v/v))、D-パントテネート(24 mg/L)、L-ロイシン(50 mg/L)、L-アルギニン(200 mg/L)、プロピオネートナトリウム(0.1 mM)、カナマイシン(20 mg/L)を補足します。残った形質転換混合物を遠心分離し、上清液を0.9mLを廃棄し、細胞ペレットを残留上清液に再懸濁させます。再懸浮した細胞を、同じサプリメントと抗生物質を含む2枚目のMiddlebrook 7H10寒天プレートにプレートします。プレートは37°Cで3〜4週間孵化します。ピンクのコロニーは成功したトランスフォームマントを示します。
- 1つのピンク菌株を選び、37°Cでゆっくりと振って、無菌ミドルブルック7H95mLにOADC濃縮剤(10%(v/v))、グリセロール(0.2%(v/v))、 D-パントテネート(24 mg/L)、 L-ロイシン(50 mg/L)、 L-アルギニン(200 mg/L)、プロピオネートナトリウム(0.1 mM)、チロキサポル(0.05% (v/v))、20 mg/Lのカナマイシンを補足して培養します。30 mLのインク壺ボトルです。
- 静脈内感染のためのmc28471の準備
- 37°Cでゆっくり揺らしながら10mLのmc2 8471を、無菌のMiddlebrook 7H9で培養し、30mLのインク壺(10%(v/v))、グリセロール(0.2%(v/v))、D-パントテネート(24 mg/L)、L-ルイシン(50 mg/L)、L-アルギニン(200 mg/L)、プロピオネートナトリウム(0.1 mM)、チロキサポル(0.05% (v/v))、および20 mg/Lのカナマイシンを30 mLのインク壺の中段まで培養します(OD600 nmは0.7から1.0の間)。
- 細胞を15mLの円錐形遠心分離機チューブに移し、室温で3,000 x gで10分間遠心分離します。上清液を廃棄し、細胞を0.05%(v/v)チロキサポル(PBS-T、洗浄#1)を含む10mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に再懸浮させます。遠心分離と洗浄を2回繰り返します。細胞ペレットをPBS-T4mLに再懸浮し、100Wの出力、2×1,000Jで細胞を超音波処理します。
- 培養液の光学密度を測定し、PBS-Tで希釈して最終濃度を5 x 106 CFUの1回の注入に求めます。これはOD600 nmが1が1 x 108 CFU/mLに相当するおおよその換算で得られます。この関係はひずみや成長条件によって異なるため、OD600 nmは正確かつ再現性を確保するために、プレート加工されたCFU値に対して経験的に較正されるべきです。
2. マウスにおける肺の永久窓インプラントによるバイタル内画像診断
- Rag2KOのMacBlueマウスをバイタル内画像診断用に準備してください。この研究では、体重30gの生後10週齢のオスマウスが使用されました。しかし、生後8〜12週のマウスは性別を問わず、その年齢の予想体重範囲内であればこの処置に適しています。この株は、Rag2ノックアウト背景下でマクロファージにおいて強化シアン蛍光タンパク質(ECFP)を発現し、B6.129S6-Rag2tm1FwaN12マウス(Rag2、モデルRAGN12)とTg(Csf1r-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J マウス(ストック番号026051)を交配して生成されました。
- 細菌感染の24時間前に肺の高解像度画像窓(WHRIL)を埋め込み、肺への安定した光学アクセスを確保し、画像撮影前の回復を可能にします。
- 誘導チャンバーで5%イソフルランで麻酔を誘導します。手術開始前に十分な麻酔深度を確認し、手術や画像診断の間ずっと動物を監視して痛み、苦痛、呼吸障害を防ぎましょう。
- 術前鎮痛投与:無菌PBS90μLに希釈したブプレノルフィン10 μL(0.1 mg/kg)を皮下注射します。
- 麻酔中の角膜乾燥を防ぐために両目に眼科軟膏を塗布してください。
- 22Gカテーテルの基部に2-0シルク縫合糸を巻き、カテーテルを固定するために~2インチのテールを残します。
- 縫合カテーテルでマウスを挿管してください。トランスライトで気管開口部を視覚化し、両側胸の膨らみ球を使って位置を確認します。
注意:不適切な挿管は気道損傷や換気不良を引き起こす可能性があります。正しい位置が両側胸部拡張によって確認された後にのみ進めてください。 - 挿管に成功した後、2-0シルク縫合糸を鼻先に結びつけて挿管カテーテルを固定してください。カテーテルを人工呼吸器に接続してください。
- マウスを右側デキュービトゥスに置き、加熱された手術台に置いて左胸部を露出させ、前肢、後肢、背中をテープで固定して手術中も安定した位置を維持します。
- 手術の残りの期間はイソフルランを3%に減らします。左上胸部の毛を除毛クリームで除去します。
- 手術部位を消毒液で準備してください。皮膚を持ち上げ、胸骨の左側約7mm、肋下縁の7mm上、6〜 7肋 間隙の中心に生検パンチ(33-35-SH)で5〜10mmの円形切開を行います。
- 露出した部位に浅い血管がないか点検してください。見える血管の分割が必要な場合は、両端を焼灼して止血を維持します。胸腔に入る前に、肋骨をはっきりと露出させるために上に覆われていた軟組織を取り除いてください。
- 6番または7番肋骨を鉗子で掴んで持ち上げ、鈍い微小解離ハサミ(丸い側が肺に向かう)で肋間筋を優しく貫通して胸腔に入ります。
注意:胸腔には、肺や肋間血管、周囲組織を傷つけないように、優しく直接観察しながら入ってください。 - 肋間開口部に短く優しい圧縮空気を吹き込み、隣接する肺表面を一時的にしぼみ、胸壁から分離させてから窓口を作ります。
- 生検パンチを切断工具に置き、切断工具を肋間開口部に導き、胸壁と平行に保ちます。肋骨に5mmの円形の欠損をパンチで開けてください。
- 円形欠損の縁から~1mmのところに5-0シルクの財布紐縫合を挟み、隣接する肋骨の間を通して開口部を囲みます。
- 窓枠を胸壁の欠陥の縁が枠の溝にぴったり収まるように装着し、その後、バッグ紐の縫合糸を締めて固定し、枠を固定します。
- 1mLの注射器にシアノアクリレートゲル接着剤を注入します。フレームを優しく持ち上げて肺から切り離し、その後フレームの裏面に薄いシアノアクリレート接着剤を塗布します。
- 肺の表面を連続的かつ穏やかな圧縮空気の流れで乾燥させ、表面がマットに見えるまで続けます。
注意:穏やかな空気の流れのみを使用し、長時間の乾燥は避けてください。過度な力や過度の乾燥は肺表面を損傷し、窓の接着を妨げる恐れがあります。 - 正の呼気末圧(PEEP)を使い、肺を膨らませてから窓をフレームに固定します。PEEPを離し、窓枠に20〜30秒間圧力をかけ続けてください。
注意:膨張時やフレーム設置時の過剰な圧力は肺を損傷したり、シールを損なう可能性があります。穏やかなアポジノイを得るために必要な最小限の圧力のみを加えてください。 - 皮膚切開の縁から1mmのところに2本目の5-0シルクのバッグストリング縫合糸を2本<置きます。枠の下に皮膚を隠し、余分な皮膚が窓枠の下に収まるか切り取られるかを確認し、バッグ紐の縫合糸をしっかり締めてしっかりと結びます。
- 真空ピックアップを使って、5mmカバースリップの裏側に非常に薄い接着剤を塗り、長方形のカバーガラスの端に余分なものをこそり落とします。再び、圧縮空気を連続的かつ優しく流して肺表面を乾燥させます。
- 円形カバースリップを窓枠のくぼみの中に、肺表面から浅い角度(~15°)に位置させます。気道圧を一時的に上げて肺を膨らませ、その後カバースリップを平行な位置に回転させ、肺の表面がガラスの裏側に向かうようにします。接着剤が固まるまで約25秒ほど優しく圧力をかけ続け、その後カバースリップから真空ピックアップを外します。
注意:カバースリップの設置時に気泡を閉じ込めたり、過剰な接着剤を塗ったりすることは避けてください。これらは画質を低下させたり、シールを乱したり、肺表面を傷つけたりする恐れがあります。 - カバースリップと金属フレームの界面に少量の液体シアノアクリレートを塗布し、気密シールを強化します。
- 滅菌針を1mLのインスリン注射器に取り付けます。針を剣突のすぐ下に差し込み、横隔膜を通って左肩に向かって胸腔に向かって進みます。残留した胸腔内の空気を除去するために、優しく吸引してください。
注意:肺、心臓、主要血管を刺さないように注意して針を進めてください。残留空気が除去されるまで、ゆっくりと吸引してください。 - イソフルランを止め、ほぼ正常な覚醒時の呼吸数が回復するまで100%酸素で換気を続けてください。回復中は動物を一人にしないでください。正常な自然呼吸がすぐに再開しない場合は、適切な支援ケアを提供するか、施設のガイドラインに従って安楽死してください。
- 固定糸を外し、ネズミを抜管し、清潔で温かいケージに入れて回復させます。動物が完全に歩けるまで監視し、正常な呼吸を取り戻せないマウスは、施設のガイドラインに従って安楽死させるべきです。
- 術後鎮痛を投与する:無菌PBS90μLに希釈したブプレノルフィン10 μL(0.1 mg/kg)を皮下注射します。
3. 生命体内画像検査
- 画像診断前に、窓埋め込み後はマウスが回復する時間を与えてください。手術後1〜5日以内に画像検査を行います。
- 3%イソフルランで麻酔を誘導し、画像診断中は1.5%を維持します。
- カスタムステージプレート-ウィンドウフレームアダプターを皮膚と肺窓枠の外縁の間に挿入し、標準的な顕微鏡ステージプレートを粘着テープで固定します。
- マウスをカスタムステージプレートウィンドウフレームアダプターをマイクロスコープの移動ステージに取り付けます。強制空気加熱チャンバーと温度センサーフィードバックループを用いて、体温を~37°Cに保ちます。
- マウスをステージプレートに乗せ、注射側の眼周の皮膚を優しく引き戻して内眼角を露出させ、FITCデキストラン(150 kDa; 20 mg/mL、100 μL)を眼後に注入して血管を標識します。
- 細菌注入前の肺血管のスナップショット、Zスタック、またはタイムラプス画像を以下のパラメータで取得します。
- 共焦点顕微鏡設定:ビットデプス:12ビット、フレームレート:2fps、画像サイズ:512 × 512ピクセル、ピクセルサイズ:0.497 μm/ピクセル、0.994 μm/ピクセル、Zステップサイズ:2 μm、総z深度:50–70 μm、フレーム平均:3、スキャン速度:2 μs/ピクセル(977ライン/秒)、レーザー励起波長:405 nm、488 nm、559 nm、試料時のレーザー出力: 230 μW(405 nm)、75 μW(488 nm)、40 μW(559 nm)、検出フィルター:430-470 nm(青)、505-540 nm(緑)、575-675 nm(赤)、検出器利得:青色800 V、緑色650 V、赤色 700 V、ピンホール直径:60 μmまたは559 nm 1エアリー単位
- 多光子顕微鏡では、共焦点顕微鏡と同じイメージングパラメータを使用しますが、試料には920 nmの励起レーザーと25 mWのレーザー出力が使用されました。
- 逆軌道注入5 x 106 CFU、tdトマト発現mc28471。
注意:適切な訓練と抑制のもとで後眼窩注射は行ってください。不適切な技術は眼の損傷、出血、接種失敗を引き起こす可能性があります。 - 3.6.1および3.6.2のイメージングパラメータを用いて、結核および蛍光標識細胞および血管のスナップショット、zスタック、タイムラプス画像を取得します。すべての検出器の利得を調整し、検出器の飽和を避けつつ信号を最大化します。
- 画像診断後、イソフルランを止め、マウスを顕微鏡から取り出します。マウスを温めて完全に回復するまでモニターしてください。
- mc28471注射後、0-60分、6時間、3日間の再撮影。各画像診断では、FITCデキストラン(100μL、眼窩後方)を再注入して血管を可視化し、その後ステップ3.8-3.9で説明された画像を取得します。
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結果
電気穿孔およびカナマイシン選択後、MC2 8471の単離コロニーは鮮やかな赤色蛍光を示し、安定したtdトマト発現を確認しました。MC28471バチルを増殖させ、単細胞懸濁液として準備し、手術的に埋め込まれたWHRILを持つマウスに静脈内投与しました。肺微小環境における初期のMTB感染動態を可視化するために、バイタル内イメージングが実施されました。本研究では、感染前の肺血管のベースライン画像を取得し(図1A)、その後60分以内、6時間後、そしてMC28471をRag2-/-×MacBlueマウスに注射後3日後に取得しました(図1B-D、図2A-B、図3A-C、補足ビデ...
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ディスカッション
このプラットフォームは、BSL-2条件下で無事哺乳類肺内の細菌と宿主細胞の相互作用を直接可視化することで、結核研究における真のギャップを埋めます。従来のin vivoイメージング戦略には、ファイバーオプティック微小内視鏡励起20、報告酵素蛍光イメージング21、近赤外蛍光タンパク質発現Mtb22を用いたものがあり、細菌負荷や薬物反応の高感度な縦断モニタリングが可能でしたが、これらは細菌負荷の集合を測定し、個々の細菌群や小規模な細菌群の解明、集合動態の追跡、空間的分布の明らかにはできませんマイコバクテリアと保存状態の完全な組織構造内の宿主細胞との関係。BSL-3互換多光子システムは肺24で病原性のMtbの画像化の原理実証を実証していますが、そのような実装には多くの研究室では利用できない専門的な封じ込めインフラが必要です。本研究は、シブラフィッシュ
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開示事項
著者らは競合する財務的利益やその他の利益相反を一切認めていません。
謝辞
この研究は以下の助成金によって支援されました:AI26170;エヴリン・リッパー・ファミリー財団およびグルス・リッパー・バイオフォトニクス・センター。NCIがんセンター助成金P30 CA013330の支援を受けた分析画像施設からの支援に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 ml conical tube | Corning | 430790 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, Inc | LA55G | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| 5-0 silk purse-string suture | Ethicon, Inc | 640G | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | 10 μLのブプレノルフィン（0.3 mg/mLの原液）を90 μLの無菌PBSに希釈した注射液（最終投与量＝0.1 mg/kg） |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 234790 | |
| D-calcium pantothenate | Acros | 243305000 | |
| ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety stand | BTX Harvard Apparatus | 45-0051 | |
| Electroporation cuvette | Fisher Scientific | FB102 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | 150 kDa |
| Glycerol | Fisher Chemicals | G33-1 | |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | 肺窓移植手術中、肋骨を把持し、挙上するために |
| Isoflurane | Pivetal | 78949580 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Kanamycin | Goldbio.com | K-120-25 | |
| L-arginine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | A5131-100G | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| MacBlue mice | Jackson Labs | Strain #: 026051 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | Difco | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | Becton Dickinson | 212351 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| PETG media inkwell bottle | Thermo Scientific | 342020 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-5623 | 手術中の挿管によってマウスの呼吸量をモニタリングするために |
| Plasmid pYUB1169 | Custom made plasmid | ||
| Rag2 KO mice | Jackson Labs | Strain #: 008449 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Sodium propionate | Thermo Scientific | A17440.36 | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB705 | |
| Sorval Centrifuge X pro series | Thermo Scientific | 75009020 | |
| Spectrophotometer Genesys 10 UV | Thermo Spectronic | 335903 | |
| SurgiSuite | Kent Scientific | SURGI-M02 | マウス用多機能手術台、保温機能付き |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22G |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T0307-50G | |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
参考文献
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