リポポリサッカライドにより損傷したCaco-2細胞におけるmiR-29b-3p結合を介したNEAT1依存的な腸管バリア機能不全

サマリー

本研究では、〜を評価した。 NEAT1 下痢型過敏性腸症候群における腸管バリア機能不全の診断マーカーおよび調節因子として。 NEAT1 患者血清中で上昇しており、miR-29b-3pに結合し、またそのノックダウンによってリポポリサッカライドで損傷させたCaco-2細胞におけるバリア機能、アポトーシス、および炎症の指標が改善した。

要約

下痢型過敏性腸症候群（IBS-D）の病態は未解明であり、利用可能な治療法は限られている。本研究では、IBS-DにおけるNEAT1の診断的価値を評価し、その潜在的な調節メカニズムを探索した。合計116名のIBS-D患者と116名の健康対照者を対象とした。血清NEAT1およびmiR-29b-3pレベルを逆転写定量リアルタイムPCR（RT-qPCR）で検出し、受信者動作特性（ROC）曲線を用いて診断的価値を評価した。メカニズム研究のため、リポ多糖（LPS）処理したCaco-2腸上皮細胞モデルを構築した。細胞生存率をCell Counting Kit-8（CCK-8）アッセイで、アポトーシスをフローサイトメトリーで、バリアの完全性を経上皮電気抵抗（TEER）で、そしてZO-1、occludin、claudin-2のmRNAレベルをRT-qPCRで評価した。Dual-luciferase reporter（DLR）およびRNA免疫共沈降（RIP）アッセイを用いて、NEAT1とmiR-29b-3pの結合関係を検証した。IBS-D患者ではNEAT1が高発現し、miR-29b-3pが低発現しており、両者のレベルは強い負の相関を示した。LPS処理Caco-2細胞において、NEAT1のノックダウンによりmiR-29b-3pレベルが上昇し、細胞生存率とTEERが向上し、アポトーシスが減少し、ZO-1およびoccludinのmRNAレベルが上昇し、claudin-2のmRNAレベルが低下し、バリア損傷に関連する指標が改善された。以上の結果は、血清NEAT1がIBS-Dのバイオマーカー候補であること、およびNEAT1/miR-29b-3p軸が腸管バリア機能不全に関与している可能性を示唆している。

概要

下痢型過敏性腸症候群（IBS-D）は、腹痛、腹部膨満感、および排便習慣の変化を特徴とする一般的な機能性胃腸疾患である¹。現在、IBS-Dの病態生理学的メカニズムは完全には解明されていない²。治療法は主に対症療法にとどまっており、効果が限定的で再発率が高い³。IBS-Dは一般的に、脳腸相関の調節不全、内臓過敏、軽度の腸管炎症、バリア機能不全などの複数の因子の相互作用が関与していると考えられている^4,5。これらの診断基準はある程度診断を標準化しているが、主観的な側面があり、特に患者の症状が炎症性腸疾患やその他の器質性疾患と重複する場合、診断の遅れや誤分類を招く可能性がある。日常的な臨床現場において、現在、IBS-Dに対する検証済みの客観的なバイオマーカーは存在しない。したがって、診断指標として機能し、かつ潜在的な治療価値を持つ新しい分子標的を探索することが、現在のIBS-D研究分野における急務となっている。

近年、エピジェネティック調節における鍵分子である長鎖非コードRNA（lncRNA）は、さまざまな疾患において診断マーカーおよび治療ターゲットとして大きな可能性を示しています^6,7。下痢型過敏性腸症候群（IBS-D）の主な原因は、腸管バリア機能の障害です⁸。タイトジャンクションタンパク質の破壊は"腸管漏出（intestinal leakage）"を引き起こし、それがさらに粘膜免疫応答を活性化させます^9,10。免疫系の活性化により数多くの炎症性因子が放出され、腸管の免疫神経系を活性化させることで腸管機能不全を引き起こします。いくつかのlncRNAが腸上皮バリアを調節できることが研究で示されています^11,12。潰瘍性大腸炎患者の大腸粘膜組織において、NEAT1の発現が上昇していることが報告されています¹³。LncRNA NEAT1の抑制は、潰瘍性大腸炎における腸上皮細胞（IECs）の機能不全を軽減させることができます¹⁴。しかし、IBS-DにおけるNEAT1の発現プロファイルおよびその診断的価値については、まだ調査されていません。さらに、NEAT1は診断バイオマーカーとしての可能性を有しています¹⁵。もしIBS-D患者の血清中でNEAT1が異常に発現していれば、分子診断ツールを提供することで現在のRome IV基準を補完できる可能性があります。一方で、IBS患者ではmiRNAの発現プロファイルも著しく変化しています。例えば、miR-29b-3p発現の低下がIBSの病態に関連していることが報告されています¹⁶。しかし、IBS-DにおけるmiR-29b-3p発現を制御する上流の調節機構は、完全に未解明のままです。特に、他の疾患ではこのメカニズムが十分に確立されていますが^17,18、IBS-DにおいてNEAT1がmiR-29b-3pの競合的内因性RNA（ceRNA）として果たす役割については、これまで調査されたことがありません。さらに、先行研究は主に組織レベルの発現に焦点を当ててきましたが、IBS-Dを診断するための非侵襲的な血清バイオマーカーとしての血中NEAT1の可能性は、全く未知のままです。

我々は、lncRNA-NEAT1がmiR-29b-3pをスポンジするceRNAとして機能することにより、IBS-Dにおける腸管バリア機能の調節に関与しているという仮説を立てた。以上の研究背景に基づき、本研究では以下のことを目的とする：(1) IBS-D患者の血清におけるNEAT1およびmiR-29b-3pのレベルと、その診断的価値を評価すること、(2) NEAT1とmiR-29b-3pの間の直接的な結合相互作用を検証すること、および(3) LPS処理したCaco-2細胞モデルを用いて、腸管バリアの完全性と炎症の調節におけるNEAT1/miR-29b-3p軸の機能的な役割を解明することである。

プロトコル

患者の組み入れ

すべての参加者は、研究内容を十分に理解した上で、書面によるインフォームドコンセントを提供した。上海市浦東新区人民医院の倫理委員会が本研究プロトコルを審査し、承認している（No. 2024k007）。サンプルサイズはG*Powerを用いて算出した。選択した検定はt検定であり、統計的検定は2つの独立したサンプル間の差を検出するように設計した。効果量 d = 0.5、α = 0.05、検出力 power = 0.9とした場合、計算により各群に最低86名の被験者を組み入れる必要があることが示された。試験中の不測の事態を考慮し、各群に116名の患者を組み入れた。2024年7月から2025年7月までに上海市浦東新区人民医院を受診したIBS-D患者計116名を、本研究の実験群とした。組み入れ基準は、(1) Rome IV診断基準を満たすIBS-Dであること、(2) 大腸内視鏡検査で粘膜に器質的病変が認められないこととした。除外基準は、(1) 炎症性腸疾患（IBD）や大腸がんなどの患者、(2) 糖尿病患者、(3) 最近に腹部手術の既往がある患者、(4) 重度の心不全、肝不全、または腎不全がある患者とした。同時に、年齢や性別などの人口統計学的特性が患者と一致する健康なボランティア116名を対照群として募集した。健康対照群は、慢性胃腸疾患の既往または対応する臨床症状がないことを確認した。全被験者から5 mLの末梢静脈血を採取した。その後、上清を-80 °Cの超低温冷凍庫に移し、次段階のRNA抽出に向けて凍結保存した。

各参加者は10日間のアンケートに回答し、以下の臨床症状を記録した：(a) 10段階のビジュアルアナログスケールを用いた腹痛の重症度評価、(b) 調査期間中の腹痛の頻度（腹痛があった日数）、(c) 排便回数（1日あたりの最大排便回数）、(d) 便の形態を評価するためのブリストル便形状スケール。被験者の精神状態は、病院不安・抑うつ尺度（HADS）を用いて評価された。

細胞培養およびモデリング

Caco-2細胞は、10%胎児ウシ血清（FBS）および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用い、37 °C、5% CO₂のインキュベーター内で通常培養した。Caco-2細胞株は、密接結合（タイトジャンクション）と微絨毛を持つ分極した単層細胞へと自然に分化し、成熟した腸上皮細胞に類似した形態的および機能的特性を示す。LPSは炎症反応を誘発し、腸上皮の密接結合を破壊して腸管透過性を亢進させるが、この過程はIBS-Dの病理学的特徴に非常に類似している。さらに、LPS処理したCaco-2細胞がIBS関連のバリア機能不全および炎症のモデルとして先行研究^19,20,21で広く用いられていることから、本研究ではIBS-Dのin vitroモデルを構築するために、Caco-2細胞へのリポポリサッカライド（LPS）処理を選択した。細胞のコンフルエンスが約80%に達した後、培地を5 µg/ml LPS²²を含む完全培地に交換し、24時間刺激した。LPSを加えず通常培養した細胞をコントロール群とした。

細胞へのトランスフェクション

Caco-2細胞におけるNEAT1およびmiR-29b-3pの役割を調べるため、Caco-2細胞にトランスフェクションを行った。細胞は以下の6つのグループに分けた：1. コントロール群（未処理）、2. LPS群、3. LPS + si-NC群、4. LPS + si-NEAT1群、5. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC群、および6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitor群。 NEAT1を標的とする2種類の小分子干渉RNA（si-NEAT1）を設計し、合成した：si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) および si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′)。ネガティブコントロールとして、非標的ランダム配列siRNA（si-NC）を使用した。同時に、miR-29b-3p inhibitorとそのネガティブコントロールも合成した。miR-29b-3p inhibitor: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’、ネガティブコントロール: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。

Caco-2細胞を24ウェルプレートに播種し、コンフルエンシーが60–70%に達した時点で、製造元のプロトコルに従ってトランスフェクションを行った。簡潔に述べると、1.25 µLのsiRNAを25 µLの低血清培地で希釈し、最終的なsiRNA濃度を50 nMとした。miRNA抑制については、2 µLのmiR-29b-3pインヒビターまたはそのネガティブコントロールを25 µLの低血清培地で希釈し、最終濃度を100 nMとした。別途、1.5 µLのトランスフェクション試薬を25 µLの低血清培地と混合した。その後、希釈したsiRNA（またはインヒビター/ネガティブコントロール）を希釈したトランスフェクション試薬と混合してトランスフェクション複合体を形成させ、これを細胞に滴下した。トランスフェクションの6時間後に、トランスフェクション混合液を新鮮な完全培地と交換し、後続の機能解析までさらに48時間細胞を維持した。さらに実験を進める前に、RT-qPCRを用いてノックダウンまたは抑制効率を確認した。

リアルタイム定量逆転写PCR (RT-qPCR)

指定の処理を施した血清サンプルおよびCaco-2細胞から全RNAを抽出した。簡潔に述べると、各サンプルを1 mLのRNA抽出試薬で溶解し、200 µLのクロロホルムと混合した。12,000 × g 4 °Cで15分間静置した後、上層の水相を新しいチューブに移し、500 µLのイソプロパノールと混合して−20 °Cで30分間保持した。その後、サンプルを12,000 × g 4 °Cで10分間静置した。得られたRNAペレットを75%エタノールで2回洗浄し、風乾させた後、20 µLのRNaseフリー水に再懸濁した。RNAの収量と純度をマイクロ分光光度計で測定し、A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8～2.0の値が使用された。RNAは製造元のプロトコルに従ってcDNAに逆転写された。～の検出には NEAT1, ZO-1、 オクルディン クローディン-2 および GAPDH1× RTバッファー、0.5 mM dNTPs、0.5 µM oligo(dT)プライマー、200 U 逆転写酵素、およびRNaseフリー水を含有する20 µLの逆転写反応1回につき、1 µgの全RNAを用いた。反応は37 °Cで15分間行い、続いて85 °Cで5秒間酵素を不活性化した。

SYBR GreenベースのリアルタイムPCRシステムを用い、cDNAをテンプレートとして定量的PCRを実施した。NEAT1、miR-29b-3p、ZO-1、occludin、およびclaudin-2の発現レベルを遺伝子特異的プライマーを用いて測定した。miR-29b-3pの参照遺伝子としてU6を用い、NEAT1およびタイトジャンクション関連遺伝子の正規化にはGAPDHを用いた。相対発現量は2−ΔΔCt法を用いて算出した。プライマー配列は表1に記載している。

細胞生存率アッセイ

対数増殖期のCaco-2細胞を、1ウェルあたり1 × 10⁴ cellsの密度で96ウェルプレートに播種した。ブランクコントロール群（培地のみ）、コントロール群（未処理細胞）、および実験群（異なる処理条件下にあるCaco-2細胞）を設定し、各群につき5～6ウェルの二連（duplicate）で作成した。細胞は、0、24、48、72 hの4つのタイムポイントに割り当てた。測定中のインキュベーターの開閉回数を減らすため、タイムポイントごとに個別の培養プレートを用意した。培養期間後、気泡が生じないように注意しながら、各ウェルに10 µLのCCK-8溶液を添加した。その後、培養プレートを37 °C、5% CO₂インキュベーターに戻し、暗所で2 hインキュベートした。直ちにマイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの450 nmにおける吸光度を測定した。最終的に、細胞生存率をパーセンテージで算出した。

細胞アポトーシスアッセイ

アポトーシスは、Annexin V-FITC/PI染色後、フローサイトメトリーにより定量化した。各処理群のCaco-2細胞を回収し、氷冷PBSで2回洗浄した。遠心分離は4 °Cにて300 × gで5分間行った。細胞ペレットを100 µLの1×バインディングバッファーで再懸濁し、続いて5 µLのAnnexin V-FITCおよび5 µLのPIを順次添加した。穏やかに混合した後、サンプルを室温・暗所で15分間インキュベートした。次に、300 µLの1×バインディングバッファーを添加し、懸濁液を注意深く混合してから5 mLフローサイトメトリー用チューブに移した。サンプルは1時間以内にフローサイトメトリーで解析した。

経上皮電気抵抗 (TEER)

透過性は、Caco-2細胞のTEER値を測定することで評価した²³。Caco-2細胞をTranswellチャンバーに播種し、21日間培養して緻密な単層を形成させた。各実験条件下で6つの独立した生物学的反復を行い、さらに各条件下で5つのテクニカルリプリケート（技術的反復）を実施した。実験処置の前後で、エタノールで滅菌しPBSで平衡化した電極を用いた膜貫通抵抗計により、各群のTEER値を測定した。簡潔に述べると、フィルター膜への接触を避けるため、電極の長い棒を基底側の培養液に、短い棒を頂端側の培養液に浸した。安定後、抵抗値（Ω）を読み取り、3回の安定した読み値が得られるまで測定を繰り返した。細胞を含まないブランクのTranswellフィルターの抵抗を同一条件で測定し、この値をすべての実験測定値から差し引いた。TEER（Ω·cm²）＝（サンプル抵抗 － ブランク抵抗）× 有効膜面積として算出した。データは（実験群／対照群）× 100%として的に示した。

酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)

24時間の培養後、異なる処理群のCaco-2細胞から上清を回収した。腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-8（IL-8）、およびインターロイキン-1β（IL-1β）を含む前炎症性サイトカインのレベルを、市販のELISA試薬を用いて製造者の指示に従い測定した。アッセイは、指示書に厳密に従って実施した。抗体が予めコーティングされたウェルにサンプルと標準物質を加え、インキュベート後、洗浄した。次に、ビオチン化検出抗体を添加した。再度インキュベートおよび洗浄を行った後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを添加した。最後に、呈色のために基質TMBを加え、停止液で反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて直ちに450 nmで測定した。

ウェスタンブロット

プロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファーを用いて、指示された処理後のCaco-2細胞からタンパク質を単離した。タンパク質量はBCAアッセイにより測定した。各サンプルについて、1レーンあたり30 µgのタンパク質を負荷し、10% SDS-PAGEゲルで分離後、PVDF膜に転写した。膜を5%脱脂粉乳で室温で1時間ブロッキングし、次いでZO-1 (1:1,000)、occludin (1:500)、claudin-2 (1:1,000)、およびGAPDH (1:5,000)に対する抗体を用いて4 °Cで一晩インキュベートした。洗浄後、膜をHRP標識二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。バンドを化学発光（ECL）法により検出し、バンド強度はImageJを用いて解析した。GAPDHをローディングコントロールとして用いた。

デュアルルシフェラーゼレポーター (DLR) アッセイ

ENCORIデータベース（https://rnasysu.com/encori/）を用いて、NEAT1配列に対するmiR-29b-3pの潜在的な結合部位を予測した。続いて、野生型（WT）または変異型（MUT）の結合部位を含むNEAT1断片をpmirGLOリポーターベクターにクローニングした。構築した組換えプラスミドを、miR-29b-3pミミック（Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’）または阻害剤、およびそれぞれのネガティブコントロール（mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）と共に細胞へ共導入した。導入から48時間後、細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼ検出試薬を用いてホタルルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼの活性を測定した。標準化のための内部参照としてレニラルシフェラーゼ活性を用いた。

RNA免疫沈降（RIP）アッセイ

RIPアッセイでは、Caco-2細胞を回収してPBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびRNase阻害剤を添加した200 µLのRIP溶解バッファー中で氷上15分間インキュベートした。細胞溶解物を4 °Cで16,000 × g、10分間遠心分離し、各上清10 µLをインプットコントロールとして回収した。免疫沈降では、40 µLのProtein A/G磁気ビーズを、5 µgのanti-Ago2抗体またはノーマルIgGを含む200 µLのRIP洗浄バッファー中で、室温で30分間回転混和した。500 µLのRIP洗浄バッファーで3回洗浄した後、ビーズ懸濁液100 µLを溶解物100 µLと混合し、RIP洗浄バッファーで最終容量1 mLに調整して、4 °Cで一晩回転インキュベートした。その後、ビーズを500 µLのRIP洗浄バッファーで5回洗浄し、同バッファー150 µLで再懸濁した。15 µLのproteinase K (20 mg/mL)および15 µLの10% SDSを添加し、55 °Cで30分間振盪しながらインキュベートしてタンパク質消化を行った。上清を回収し、抽出試薬を用いてRNAを単離し、一晩沈殿させた。その後、RT-qPCRによりNEAT1およびmiR-29b-3pの濃縮度を評価した。

細胞内局在解析

メーカーの指示に従い、市販の核・細胞質分画試薬を用いてCaco-2細胞を核画分と細胞質画分に分離した。これら2つの画分から全RNAを抽出し、RT-qPCRにより核および細胞質におけるNEAT1の分布を検出した。分画効率の指標として、U6（主に核に存在）およびGAPDH mRNA（主に細胞質に存在）を用いて校正を行った。

統計解析

臨床血清検体について、パワー分析（t-検定、d = 0.5、α = 0.05、power = 0.9）を行った結果、1群あたり最低86名の被験者が必要であることが示された。試験中の不測の事態を考慮し、臨床的に有意な差を検出するために各群116名の患者を登録した。連続変数のデータの正規性はShapiro-Wilk検定を用いて評価した。すべての連続データが正規分布に従っていたため（P > 0.05）、パラメトリック分析を適用した。カテゴリ変数はカイ二乗検定を用いて分析した。細胞ベースの実験では、6回の独立した生物学的反復を行い、各生物学的反復に対して5回のテクニカルリプリケートを作成した。データは平均値 ± SDとして提示している。2つの連続変数群間の比較にはStudentのt-検定を用い、複数群間の比較には一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、Tukeyのポストホック検定を用いて分析した。統計的有意性はP < 0.05と定義した。

結果

NEAT1の発現と診断的価値

健康対照（HC）群と比較して、IBS-D患者におけるNEAT1の発現レベルは著しく高くなっていました（P < 0.0001; Figure 1A）。受信者動作特性（ROC）曲線によって示されたNEAT1の曲線下面積（AUC）は0.867（95% CI: 0.821–0.913）でした。特異度は75.9%であり、感度は84.5%でした（Figure 1B）。この結果は、IBS-D患者の血清におけるNEAT1の異常発現が、本疾患の新しい診断バイオマーカーとして利用できる可能性を示唆しています。

さらに、健康対照群とIBS-D群の患者の臨床データを比較した。その結果、年齢、性別、およびその他の特性において、2群間に有意差は認められなかった（P > 0.05）。しかし、HADS、排便回数、および便形状には有意な差が見られた（P < 0.0001, Table 2）。腹痛の頻度に関しては、69名の患者が5日以上の症状を経験しており、症例の59.48%を占めていた。腹痛の重症度に関しては、72名の患者がスコア5以上であり、62.07%を占めていた（Table 2）。これは、IBS-D患者がその症状によって対照群と明確に区別できることを意味している。NEAT1の上昇とIBS-D症状との臨床的関連性を踏まえ、次にLPS処理したCaco-2細胞モデルを用いて、腸管バリア機能の完全性に対するNEAT1の機能的影響を検討した。

LPS処理したCaco-2細胞における腸管バリア損傷および炎症反応に対する低レベルNEAT1の影響

IBS-Dで見られる腸管バリア機能不全および軽度の炎症をモデル化するため、Caco-2細胞をLPSで処理した。細胞にLPSを添加すると、対照群と比較してNEAT1レベルが上昇した。si-NEAT1をトランスフェクションすると、LPS + si-NC群と比較してNEAT1レベルが著しく減少した（P < 0.0001, Figure 2A）。LPS処理は、対照群と比較して細胞生存率を低下させ、アポトーシスを増加させた。NEAT1をノックダウンすると、LPS + si-NC群と比較して細胞生存率が上昇し、アポトーシス率が低下した（P < 0.001; Figure 2B,C）。NEAT1をノックダウンすることで、LPSにより低下したTEERが有意に回復した（P < 0.0001, Figure 2D）。LPSは対照群と比較してZO-1およびoccludinのmRNA発現を減少させ、claudin-2の発現を増加させたが、NEAT1のノックダウンはこれらの変化を逆転させた（P < 0.001, Figure 2E-G）。LPS処理は細胞に炎症反応を誘発し得る。細胞内の炎症性因子TNF-α、IL-6、IL-8、およびIL-1βのレベルは、対照群よりも高かった。NEAT1をノックダウンすると、細胞内の炎症性因子の含量はsi-NC群と比較して有意に減少した（P < 0.0001, Figure 3A-D）。このことは、NEAT1レベルの低下がLPS誘発性の腸管バリア機能不全および炎症反応を軽減すること、ならびにNEAT1がIBS-Dの進行に関与している可能性を示唆している。

Caco-2細胞におけるNEAT1の直接結合およびmiR-29b-3pへの影響

Caco-2細胞において、NEAT1は主に細胞質に存在していた（図 4A）。NEAT1とmiR-29b-3pの結合部位はENCORIデータベースを用いて予測した。これに基づき、WT-NEAT1およびMUT-NEAT1の配列を設計した（図 4B）。DLR実験の結果、miR-29b-3p mimicはmimic NCと比較してWT-NEAT1の酵素活性を低下させた一方で、そのinhibitorはinhibitor NCと比較して活性を上昇させた。対照的に、いずれの処理もMUT-NEAT1には影響を与えなかった（P < 0.0001, 図 4C）。RIPアッセイでは、anti-IgG群と比較してanti-Ago2画分にNEAT1とmiR-29b-3pが著しく豊富に認められ、両者の特異的な相互作用が示された（P < 0.0001, 図 4D）。これらの結果は、NEAT1がmiR-29b-3pに特異的に結合することを示している。一方、IBS-D患者におけるmiR-29b-3pレベルは、HC群と比較して顕著に低下していた（P < 0.0001, 図 4E）。そのROC曲線のAUCは0.856（95% CI: 0.808–0.905）であり、感度は89.7%、特異度は71.6%であった（図 4F）。ピアソンの相関分析により、NEAT1レベルとmiR-29b-3pの発現との間に負の相関があることが明らかになった（r = -0.744, P < 0.0001, 図 4G）。

LPS処理したCaco-2細胞における腸管バリア損傷に対するNEAT1低発現の影響、およびmiR-29b-3pレベルへの影響

LPS処理したCaco-2細胞において、miR-29b-3pの発現は対照群と比較して著しく低下していた。si-NEAT1のトランスフェクションによりmiR-29b-3pレベルは上昇したが、miR-29b-3pインヒビターのトランスフェクションではmiR-29b-3pレベルが再び低下した（P < 0.0001, Figure 5A）。NEAT1のノックダウンは細胞生存率を上昇させ、アポトーシスを減少させたが、これらの効果はmiR-29b-3pインヒビターによって消失した（P < 0.01, Figure 5B,C）。LPSによって誘導されたTEERの低下はNEAT1ノックダウンによって回復したが、この回復はmiR-29b-3pインヒビターによって再び抑制された（P < 0.0001, Figure 5D）。LPS処理は、対照群と比較してZO-1およびoccludin mRNAの発現を低下させ、claudin-2 mRNAの発現を上昇させた。 NEAT1ノックダウン後、LPS + si-NC群と比較して、miR-29b-3pレベルが上昇し、ZO-1およびoccludin mRNAレベルが上昇し、claudin-2 mRNAレベルが低下した。miR-29b-3pを抑制した後は、LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC群と比較して、ZO-1およびoccludin mRNAレベルが低下し、claudin-2 mRNAレベルが上昇した（P < 0.001, Figure 5E-G）。NEAT1（主に細胞質サブタイプであるNEAT1_1）は、miR-29b-3pのスポンジとして機能する。NEAT1のノックダウンによりmiR-29b-3pが放出され、それによってZO-1およびoccludinが間接的にアップレギュレートされ、claudin-2がダウンレギュレートされることで、LPS誘導性のバリア破壊が軽減される。これらの結果は、本モデルにおいて、miR-29b-3pがZO-1およびoccludinの発現を正に調節し、claudin-2を負に調節すること、およびNEAT1ノックダウンの効果が少なくとも部分的にmiR-29b-3pを介していることを示唆している。

さらに、ウェスタンブロット解析を用いてタイトジャンクションタンパク質の発現レベルを検討した。図5Hに示すように、LPS + si-NC群と比較して、NEAT1ノックダウンはLPSによって低下したZO-1およびoccludinの発現を増加させ、claudin-2の発現を抑制した。しかし、miR-29b-3p阻害剤を共導入すると、LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC群と比較して、NEAT1ノックダウンによる保護効果が弱まった。これらの結果は、NEAT1ノックダウンが、少なくとも部分的にmiR-29b-3pを上方制御することによってタイトジャンクションタンパク質の発現を回復させ、それにより腸管バリア機能を改善するという結論を支持している。

LPS処理したCaco-2細胞における腸管炎症およびmiR-29b-3p発現に対する低レベルのNEAT1の影響

LPSで処理したCaco-2細胞において、LPSは炎症反応を誘発した。前炎症性因子であるTNF-α、IL-6、IL-8、およびIL-1βのレベルは、対照群よりも有意に高かった。NEAT1をノックダウンすると、si-NCと比較してmiR-29b-3pのレベルが上昇し、一方で前炎症性因子のレベルは有意に低下した。miR-29b-3pを阻害すると、炎症性因子のレベルが再び上昇した（P < 0.0001、図 6A-D）。したがって、NEAT1のノックダウンは、少なくとも部分的に miR-29b-3p をアップレギュレートすることにより、炎症性サイトカインの放出を抑制している。

これらの結果は、IBS-D患者の血清においてNEAT1レベルが異常に上昇していること、およびNEAT1がIBS-D患者と健常対照群を区別するための高いAUCを持つことを示しています。メカニズムとしては、NEAT1が細胞質内でmiR-29b-3pに直接結合し、これを捕捉します。細胞モデルおよび機能回復実験において、NEAT1のノックダウンはmiR-29b-3pの発現を増加させ、細胞生存率とTEERを改善し、アポトーシスを減少させ、前炎症性サイトカインの放出を抑制しました。これらの知見は、NEAT1がmiR-29b-3pを抑制することで腸管バリアの整合性を負に調節するという仮説を支持しており、NEAT1を標的とすることがIBS-Dの潜在的な診断および治療戦略となる可能性を示唆しています。

データの利用可能性：

図および表の根拠となる生データは、Supplemental File 1（生データ用スプレッドシート）およびSupplemental File 2（未編集のウェスタンブロット画像）として提供されています。

図1. IBS-D患者におけるNEAT1の発現および診断的価値。 (A) RT-qPCRにより検出した、健常対照群（HC, n = 116）およびIBS-D患者（n = 116）の血清中におけるNEAT1の発現レベル。 (B) IBS-D患者を健常対照群から識別するためのNEAT1のROC曲線分析。データは平均 ± SD（各群 n = 116）で示されている。 **** P < 0.0001。略語：IBS-D = 下痢型過敏性腸症候群、ROC = 受信者動作特性曲線。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 2. Caco-2細胞におけるLPS誘導性腸管バリア損傷に対するNEAT1の影響。 (A) si-NEAT1の導入により、LPSで誘導されたNEAT1レベルが減少する。 (B) CCK-8アッセイにより0、24、48、および72時間で測定した細胞生存率。NEAT1のノックダウンにより細胞生存率が向上する。 (C) Annexin V-FITC/PI染色を用いたフローサイトメトリーにより決定したアポトーシス率。NEAT1のサイレンシングによりアポトーシス率が低下する。 (D) Caco-2単層で測定した経上皮電気抵抗（TEER）。NEAT1の阻害により細胞のTEERが増加する。 (E-G) RT-qPCRにより測定した (E) ZO-1、(F) occludin、および (G) claudin-2 のmRNA発現レベル。NEAT1のサイレンシングにより、ZO-1およびoccludinのmRNA発現が上昇し、claudin-2のmRNAレベルが低下する。 データは6回の独立した実験（1群あたりn = 6）の平均値 ± SDとして示されている。*** P < 0.001; **** P < 0.0001、コントロールに対するLPS、およびLPS + si-NCに対するLPS + si-NEAT1の比較。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図3. Caco-2細胞におけるLPS誘導性の前炎症性サイトカイン放出に対するNEAT1ノックダウンの影響。 (A-D) ELISAにより測定した細胞培養上清中の(A) TNF-α、(B) IL-6、(C) IL-8、および(D) IL-1βの濃度。NEAT1ノックダウンにより、LPS誘導性のTNF-α、IL-6、IL-8、およびIL-1βレベルが減少する。データは6回の独立した実験からの平均値 ± SDとして提示（1群あたりn = 6）。**** P < 0.0001、LPS vs. コントロール、LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 4. NEAT1の直接結合およびmiR-29b-3pとの関連。(A) 核・細胞質分画法により決定したCaco-2細胞におけるNEAT1の細胞内局在（U6：核コントロール、GAPDH：細胞質コントロール）。NEAT1は主に細胞質に局在している；(B) ENCORIデータベースに基づく、miR-29b-3pに対するNEAT1の予測WTおよびMUT結合配列；(C) DLRアッセイにより検証されたNEAT1とmiR-29b-3pの結合関係；(D) RIPにより検証されたNEAT1とmiR-29b-3pの結合関係。A、C、およびDのデータは、6回の独立した実験（1群あたりn = 6）の平均値 ± SDである。(E) 健康対照群（HC、n = 116）およびIBS-D患者（n = 116）における血清miR-29b-3p発現レベル；(F) IBS-D患者を健康対照群から判別するためのmiR-29b-3pのROC曲線；(G) IBS-D患者におけるNEAT1レベルとmiR-29b-3pレベルのピアソン相関分析。NEAT1はmiR-29b-3pの発現と負の相関を示した（r = -0.744, P < 0.0001）。Eのデータは平均値 ± SD（1群あたりn = 116）である。**** P < 0.0001。略語：WT = 野生型；MUT = 変異型；DLR = デュアルルシフェラーゼレポーター；RIP = RNA免疫沈降。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 5. LPS処理したCaco-2細胞およびmiR-29b-3pにおけるNEAT1ノックダウンが腸管バリア機能に及ぼす影響。 (A) NEAT1のノックダウンによりmiR-29b-3pレベルが上昇し、一方でmiR-29b-3pインヒビターのトランスフェクションによりmiR-29b-3pの発現が低下する。 (B) CCK-8アッセイにより測定した細胞生存率。NEAT1の低レベル発現は、miR-29b-3pを増加させることで細胞生存率を高める。 (C) フローサイトメトリーにより決定したアポトーシス率。NEAT1の低レベル発現は、miR-29b-3pを増加させることでアポトーシス率を低下させる。 (D) NEAT1の低レベル発現は、miR-29b-3pレベルを上昇させることで細胞のTEERを増加させる。 (E-G) (E) ZO-1、(F) occludin、および(G) claudin-2のmRNA発現。NEAT1の低レベル発現は、miR-29b-3pを増強することでZO-1およびoccludinの発現を増加させ、claudin-2 mRNAの発現を低下させる。 (H) 示された処理条件下におけるZO-1、occludin、claudin-2、およびGAPDHのタンパク質発現を示す代表的なウェスタンブロット像。データは6回の独立した実験（各群 n = 6）の平均値 ± SDで示している。 ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS vs. コントロール、LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC、LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor vs. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC。略称：miR-inhibitor = miR-29b-3p インヒビター、TEER = 経上皮電気抵抗。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 6。LPS処理したCaco-2細胞における炎症およびmiR-29b-3pに対するNEAT1ノックダウンの影響。 (A-D) ELISAで測定した細胞培養上清中の(A) TNF-α、(B) IL-6、(C) IL-8、および(D) IL-1βの濃度。NEAT1の低発現は、miR-29b-3pを増加させることで、細胞上清中のTNF-α、IL-6、IL-8、およびIL-1βの含有量を減少させる。データは6回の独立した実験（1群あたりn = 6）の平均値 ± SDとして示している。**** P < 0.0001、LPS vs. コントロール、LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC、LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor vs. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC。略語：miR-inhibitor = miR-29b-3p インヒビター。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

遺伝子	プライマー配列
NEAT1 forward	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 reverse	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 forward	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 reverse	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin forward	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin reverse	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 forward	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 reverse	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p forward	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p reverse	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH forward	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH reverse	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 forward	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 reverse	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

表 1: プライマー配列。

指標	対照群 (N=116)	IBS-D群 (N=116)	P
年齢, years
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
性別
男性	64	66	0.895
女性	52	50
喫煙
なし	58	53	0.599
あり	58	63
飲酒
なし	63	58	0.599
あり	53	58
HADS, スコア
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
排便回数, 回/日
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
便形状, ブリストル・スコア
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
腹痛頻度, 日数
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
腹痛の重症度, スコア
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

表 2: 健康対照群とIBS-D患者における人口統計学的および臨床的特性の比較。 数値は各群の参加者数（n = 116/群）として報告されています。群間差はカイ二乗検定を用いて評価されました。略称：HADS = Hospital Anxiety and Depression Scale（病院不安・抑うつ尺度）、IBS-D = 下痢型過敏性腸症候群。

補完ファイル1： 図および表の根拠となる生データ。 このファイルには、以下の定量的な結果を算出するために使用された生の数値データが含まれています。 図1, 図2, 図3, 図4, 図5および 図6, および、～に要約された人口統計学的／臨床的データ 表2.こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 2：未編集のウェスタンブロット画像。このファイルには、図 5Hに示されている代表的なウェスタンブロットパネルに対応する、ZO-1、occludin、claudin-2、およびGAPDHの未編集のウェスタンブロット画像が含まれています。こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

IBS-Dは一般的な機能性胃腸管障害である。その病理学的メカニズムは完全には解明されていない。近年、エピジェネティック調節における重要な分子であるlncRNAは、疾患の診断および治療の分野で大きな可能性を示している。lncRNA NEAT1は、大腸がん²⁴、神経膠腫²⁵、心筋梗塞²⁶などの様々な疾患で研究されてきた。複数の研究により、NEAT1が炎症反応¹³、細胞増殖²⁷、および腸管バリアの完全性²⁸の調節に関与していることが示されている。しかし、IBS-DにおけるNEAT1の特異的な発現、その臨床的価値、およびIBS-Dの根底にある調節メカニズムについては、まだ十分に探索されていない。

NEAT1 肺炎などのさまざまな炎症性疾患において発現が上昇している²⁹, 変形性関節症³⁰, 鼻炎³¹、および敗血症³²我々の結果は、これらの研究で報告された結果と一致している。 NEAT1 発現はIBS-D患者において有意に上昇している。このことは、それがIBS-Dの発症に関連している可能性を示唆している。現在、IBS-Dの診断は主にRome IV診断基準に依存しており、客観的な検査バイオマーカーは存在しない。これらの基準は研究や多くの臨床現場で有効であることが証明されているが、主観性、他疾患との症状の重複、診断の遅れなどの限界が依然として存在する。さらに、ROC曲線分析の結果は、 NEAT1 IBS-D患者において比較的良好な診断能を有している。血清 NEAT1 発現レベルにより、AUC 0.867、および高い感度と特異度をもって、IBS-D患者を健常対照群から効果的に区別することができました。このことは、 NEAT1 Rome IV基準を補完する診断ツールとして、あるいは下痢型過敏性腸症候群（IBS-D）の新規診断マーカーとしての可能性を秘めています。例えば、慢性の腹痛と排便習慣の変化を呈し、且つ～の値が上昇している患者において、 NEAT1 バイオマーカーの結果をRome IV基準と併せて検討することで、より確信を持ってレベルを評価できる可能性があります。これにより、症状に合わせた治療を早期に開始でき、不必要な侵襲的検査を避けることが可能になります。逆に、バイオマーカーの結果は正常であるもののRome IV基準を満たす患者については、他の器質的疾患を除外するために、より詳細なモニタリングが必要です。したがって、これらのバイオマーカーを臨床現場に導入することは、診断の精度と効率の向上に寄与すると期待されますが、依然として臨床設定での前向き検証が必要です。

IBS-D患者が経験する臨床症状は、腸管バリア機能の低下に関連している可能性があります³³。この機能は主に腸管上皮細胞間の密接結合（TJ）構造によって媒介されており、ZO-1およびoccludinタンパク質が重要な役割を果たしています^34,35。ZO-1は、粘膜上皮の物理的バリアと透過性の維持に関与しています³⁶。Occludinは主に細胞間の密接結合の形成を担っており、これはバリア機能を維持するために不可欠です³⁷。密接結合タンパク質のclaudin-2は、その他の機能に加え、細胞バイパスポアチャネルの形成に重要な役割を果たしています³⁸。IBS-D患者では、通常ZO-1とoccludinが減少し、claudin-2が増加しており、腸管バリアが損傷し透過性が亢進しています。本研究では、NEAT1のノックダウンによりin vitro細胞モデルのTEERが上昇することが判明し、このモデルにおいてNEAT1が腸管バリアに損傷を与える影響を持つことが裏付けられました。分子レベルでは、NEAT1発現の抑制により、主要な密接結合タンパク質であるZO-1およびoccludinのmRNA発現レベルが有意に回復し、一方でclaudin-2の発現は減少しました。このことは、NEAT1が密接結合タンパク質の発現を負に調節し、腸管上皮の物理的バリアを破壊して透過性を高める可能性を示唆しています。最終的に、これは「リーキーガット」現象につながる可能性があります。さらに、IBS-Dに広く見られる低グレードの炎症は、バリア損傷を悪化させる重要な要因です³⁹。多くの研究により、lncRNAが炎症性シグナル伝達経路における重要な調節ノードとして機能することが確認されています⁴⁰。我々の研究結果もこれと一致しています。NEAT1のノックダウンにより、LPSによって誘導される前炎症性サイトカインTNF-α、IL-6、IL-8、およびIL-1βの放出が有意に抑制されました。これは、他の炎症モデルにおける前炎症性lncRNAとしてのNEAT1の役割と非常に類似しており、IBS-Dにおいて、NEAT1が重要な役割を果たす「炎症ーバリア損傷ー炎症」の悪循環が存在する可能性を示しています。

マイクロRNA（miRNA）は、疾患の制御に関与するもう一つの重要な因子クラスです。miR-29b-3pは、さまざまなLPS誘発性の細胞炎症反応において低発現しています^41,42。多くの研究結果と一致して、我々はIBS-D患者の血清においてmiR-29b-3pレベルが著しく低下しており、NEAT1の上昇と強い負の相関があることを見出しました。さらに、本モデルにおいて、NEAT1が細胞質内でmiR-29b-3pに直接結合し、スポンジとして機能することを示しました。機能回復実験により、NEAT1がCaco-2細胞の生存率およびアポトーシス、ならびにZO-1, occludin, and claudin-2 mRNAのレベルに影響を及ぼすことが、少なくとも部分的にmiR-29b-3pを介しており、最終的に腸管バリアの完全性に影響を与えることが示されました。特筆すべきは、我々のデータが、IBSに関連する腸管バリア機能不全の状況において、miR-29b-3pレベルがZO-1およびoccludinレベルと正の相関にあることを示している点です。この正の制御は間接的である可能性があり、例えば、miR-29b-3pが転写抑制因子を標的にすることでタイトジャンクションタンパク質の転写を抑制し、それによって抑制を解除してZO-1およびoccludinの発現を促進するという機序が考えられます。この仮説は、miR-29b-3pがバリア機能の負の調節因子を標的にすることで、炎症条件下で保護的な役割を果たすことを報告した先行研究によっても支持されています⁴²。

しかしながら、miR-29b-3pがZO-1およびoccludinのmRNA発現を制御する標的遺伝子については、ceRNAネットワークを完結させるためにさらなる調査が必要であり、これが本研究の限界となっています。さらに、本研究には他の限界もあります。第一に、本研究は単一施設での研究であり、サンプルサイズが比較的小さい（IBS-D患者116名のみを対象とした）ことです。NEAT1の臨床診断における価値については、大規模な多施設共同前方視的コホート研究によるさらなる検証が必要です。第二に、本研究は主に臨床的な相関分析およびin vitroの細胞モデルに基づいていることです。今後は、この軸のin vivoにおける役割を検証するために動物モデルが必要となるでしょう。第三に、IBS-Dの病態に関与するmiR-29b-3pの特異的な下流標的遺伝子ネットワークがまだ完全には解明されていないことです。今後の研究では、(1) IBS-CおよびIBS-M患者におけるNEAT1およびmiR-29b-3pの診断的価値の検証、(2) 動物モデルにおけるNEAT1標的介入療法の治療効果の試験、(3) miR-29b-3pがタイトジャンクションタンパク質を制御する正確な分子メカニズムの解明に焦点を当てるべきです。このような取り組みにより、我々の知見の臨床応用が促進されると考えられます。

結論として、NEAT1はIBS-D患者において高度に発現しており、本コホートにおいて良好な診断価値を有しています。LPS処理したCaco-2細胞において、低レベルのNEAT1はmiR-29b-3pレベルを上昇させることで、細胞生存能を促進し、アポトーシスを減少させ、腸管バリア損傷を軽減し、炎症反応を抑制することができます。NEAT1/miR-29b-3p軸は、IBS-Dの複雑な病態生理学的メカニズムに新たな視点を提供します。NEAT1はIBS-Dの潜在的な診断バイオマーカーとして機能する可能性があり、NEAT1/miR-29b-3p軸は本疾患の潜在的な治療ターゲットとなる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェルプレート	Corning	CLS3524	細胞播種用
96ウェルプレート	Corning	CLS3599	CCK-8アッセイでの細胞播種用
Annexin V-FITC/PI アポトーシス検出キット	Invitrogen	V13242	アポトーシス率の検出用
Anti-AGO2 モノクローナル抗体	Proteintech	67934-1-Ig	Ago2結合RNA複合体の免疫沈降用
Anti-Claudin-2 抗体	Invitrogen	32-5600	一次抗体、希釈倍率 1:1000
Anti-GAPDH 抗体	Cell Signaling Technology	5174	一次抗体、希釈倍率 1:5000、ローディングコントロール
Anti-Human IgG 抗体	Proteintech	10284-1-AP	RIPアッセイのネガティブコントロールとして使用
Anti-Occludin 抗体	Abcam	ab31721	一次抗体、希釈倍率 1:500
Anti-ZO-1 抗体	Proteintech	21773-1-AP	一次抗体、希釈倍率 1:1000
Caco-2 細胞	SUNNCELL	SNL-068	腸上皮バリアモデルの構築用
CCK-8 キット	Solarbio	CA1210	細胞増殖アッセイキット
クロロフォーム	Sigma-Aldrich	C2432	RNA抽出時の相分離用
DMEM培地	Gibco	11965092	細胞培養用
Dual-Luciferase Reporter Assay Kit	ThermoFisher	16186	ルシフェラーゼ活性の検出用
ELISAキット（IL-1β用）	R&D Systems	DY201	細胞培養上清中の標的タンパク質の検出用
ELISAキット（IL-6用）	R&D Systems	D6050B	細胞培養上清中の標的タンパク質の検出用
ELISAキット（IL-8用）	R&D Systems	NBP3-28022	細胞培養上清中の標的タンパク質の検出用
ELISAキット（TNF-α用）	R&D Systems	DTA00D	細胞培養上清中の標的タンパク質の検出用
強化化学発光 (ECL) 基質	Thermo Fisher	32106	タンパク質バンドの可視化用
エタノール (75%)	Sigma-Aldrich	459844	RNAペレットの洗浄用
FBS (ウシ胎児血清)	Gibco	10099141	細胞培養用
フローサイトメーター	Beckman Coulter	B53002	アポトーシス率の検出用
HRP標識二次抗体	Cell Signaling Technology	7074	ECL基質による化学発光信号の生成を触媒する
イソプロパノール	Sigma-Aldrich	1133502500	RNA沈殿用
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	トランスフェクション試薬
リポポリサッカライド (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	細胞モデル構築の誘導用
マイクロプレートリーダー	BioTek	Epoch 2	96ウェルプレート中のサンプルの吸光度検出用
Nanodrop マイクロ分光光度計	Thermo Scientific	ND-2000C	RNA濃度および純度の決定用
脱脂粉乳	Coolaber	CN7861	メンブレンのブロッキング用（5%溶液）
PARIS Kit	Thermo Fisher	AM1921	核・細胞質分画用
ペニシリン–ストレプトマイシン	Gibco	15140122	細胞増殖時のコンタミネーション防止用
Pierce BCA プロテインアッセイキット	Thermo Fisher	23225	タンパク質濃度の決定用
pmirGLO Dual-Luciferase ベクター	Promega	E1330	デュアルルシフェラーゼリポーター遺伝子ベクター
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara	RR047A	RNAからcDNAへの逆転写用
PVDF メンブレン	Millipore	IPVH00010	SDS-PAGE後のタンパク質転写用
リアルタイム蛍光定量PCR装置	Applied Biosystems	4365464	標的遺伝子の検出用
RIPAライシスバッファー（プロテアーゼ阻害剤含有）	Thermo Fisher	89901	細胞からの全タンパク質抽出用
RNA結合タンパク質免疫沈降キット	Sigma-Aldrich	17-701	Protein A/G マグネットビーズを用いた RNA結合タンパク質免疫沈降 (RIP) アッセイ
SDS-PAGE 試薬 (10% ゲル)	TargetMol	C0189	分子量によるタンパク質分離用
SYBR Green マスターミックス	Thermo Fisher	4309155	PCR検査用
TEER 測定器 (電圧・電流計)	Millipore	MERS00002	経上皮電気抵抗測定器、単層の完全性の測定用
Transwell チャンバー	Corning Costar	CLS3413	細胞単層の培養およびTEER測定用
TRIzol 試薬	Invitrogen	15596026CN	全RNA抽出用