本研究では、〜を評価した。 NEAT1 下痢型過敏性腸症候群における腸管バリア機能不全の診断マーカーおよび調節因子として。 NEAT1 患者血清中で上昇しており、miR-29b-3pに結合し、またそのノックダウンによってリポポリサッカライドで損傷させたCaco-2細胞におけるバリア機能、アポトーシス、および炎症の指標が改善した。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
研究記事
* These authors contributed equally
本研究では、〜を評価した。 NEAT1 下痢型過敏性腸症候群における腸管バリア機能不全の診断マーカーおよび調節因子として。 NEAT1 患者血清中で上昇しており、miR-29b-3pに結合し、またそのノックダウンによってリポポリサッカライドで損傷させたCaco-2細胞におけるバリア機能、アポトーシス、および炎症の指標が改善した。
下痢型過敏性腸症候群（IBS-D）の病態は未解明であり、利用可能な治療法は限られている。本研究では、IBS-DにおけるNEAT1の診断的価値を評価し、その潜在的な調節メカニズムを探索した。合計116名のIBS-D患者と116名の健康対照者を対象とした。血清NEAT1およびmiR-29b-3pレベルを逆転写定量リアルタイムPCR（RT-qPCR）で検出し、受信者動作特性（ROC）曲線を用いて診断的価値を評価した。メカニズム研究のため、リポ多糖（LPS）処理したCaco-2腸上皮細胞モデルを構築した。細胞生存率をCell Counting Kit-8（CCK-8）アッセイで、アポトーシスをフローサイトメトリーで、バリアの完全性を経上皮電気抵抗（TEER）で、そしてZO-1、occludin、claudin-2のmRNAレベルをRT-qPCRで評価した。Dual-luciferase reporter（DLR）およびRNA免疫共沈降（RIP）アッセイを用いて、NEAT1とmiR-29b-3pの結合関係を検証した。IBS-D患者ではNEAT1が高発現し、miR-29b-3pが低発現しており、両者のレベルは強い負の相関を示した。LPS処理Caco-2細胞において、NEAT1のノックダウンによりmiR-29b-3pレベルが上昇し、細胞生存率とTEERが向上し、アポトーシスが減少し、ZO-1およびoccludinのmRNAレベルが上昇し、claudin-2のmRNAレベルが低下し、バリア損傷に関連する指標が改善された。以上の結果は、血清NEAT1がIBS-Dのバイオマーカー候補であること、およびNEAT1/miR-29b-3p軸が腸管バリア機能不全に関与している可能性を示唆している。
下痢型過敏性腸症候群（IBS-D）は、腹痛、腹部膨満感、および排便習慣の変化を特徴とする一般的な機能性胃腸疾患である1。現在、IBS-Dの病態生理学的メカニズムは完全には解明されていない2。治療法は主に対症療法にとどまっており、効果が限定的で再発率が高い3。IBS-Dは一般的に、脳腸相関の調節不全、内臓過敏、軽度の腸管炎症、バリア機能不全などの複数の因子の相互作用が関与していると考えられている4,5。これらの診断基準はある程度診断を標準化しているが、主観的な側面があり、特に患者の症状が炎症性腸疾患やその他の器質性疾患と重複する場合、診断の遅れや誤分類を招く可能性がある。日常的な臨床現場において、現在、IBS-Dに対する検証済みの客観的なバイオマーカーは存在しない。したがって、診断指標として機能し、かつ潜在的な治療価値を持つ新しい分子標的を探索することが、現在のIBS-D研究分野における急務となっている。
近年、エピジェネティック調節における鍵分子である長鎖非コードRNA（lncRNA）は、さまざまな疾患において診断マーカーおよび治療ターゲットとして大きな可能性を示しています6,7。下痢型過敏性腸症候群（IBS-D）の主な原因は、腸管バリア機能の障害です8。タイトジャンクションタンパク質の破壊は"腸管漏出（intestinal leakage）"を引き起こし、それがさらに粘膜免疫応答を活性化させます9,10。免疫系の活性化により数多くの炎症性因子が放出され、腸管の免疫神経系を活性化させることで腸管機能不全を引き起こします。いくつかのlncRNAが腸上皮バリアを調節できることが研究で示されています11,12。潰瘍性大腸炎患者の大腸粘膜組織において、NEAT1の発現が上昇していることが報告されています13。LncRNA NEAT1の抑制は、潰瘍性大腸炎における腸上皮細胞（IECs）の機能不全を軽減させることができます14。しかし、IBS-DにおけるNEAT1の発現プロファイルおよびその診断的価値については、まだ調査されていません。さらに、NEAT1は診断バイオマーカーとしての可能性を有しています15。もしIBS-D患者の血清中でNEAT1が異常に発現していれば、分子診断ツールを提供することで現在のRome IV基準を補完できる可能性があります。一方で、IBS患者ではmiRNAの発現プロファイルも著しく変化しています。例えば、miR-29b-3p発現の低下がIBSの病態に関連していることが報告されています16。しかし、IBS-DにおけるmiR-29b-3p発現を制御する上流の調節機構は、完全に未解明のままです。特に、他の疾患ではこのメカニズムが十分に確立されていますが17,18、IBS-DにおいてNEAT1がmiR-29b-3pの競合的内因性RNA（ceRNA）として果たす役割については、これまで調査されたことがありません。さらに、先行研究は主に組織レベルの発現に焦点を当ててきましたが、IBS-Dを診断するための非侵襲的な血清バイオマーカーとしての血中NEAT1の可能性は、全く未知のままです。
我々は、lncRNA-NEAT1がmiR-29b-3pをスポンジするceRNAとして機能することにより、IBS-Dにおける腸管バリア機能の調節に関与しているという仮説を立てた。以上の研究背景に基づき、本研究では以下のことを目的とする：(1) IBS-D患者の血清におけるNEAT1およびmiR-29b-3pのレベルと、その診断的価値を評価すること、(2) NEAT1とmiR-29b-3pの間の直接的な結合相互作用を検証すること、および(3) LPS処理したCaco-2細胞モデルを用いて、腸管バリアの完全性と炎症の調節におけるNEAT1/miR-29b-3p軸の機能的な役割を解明することである。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
患者の組み入れ
すべての参加者は、研究内容を十分に理解した上で、書面によるインフォームドコンセントを提供した。上海市浦東新区人民医院の倫理委員会が本研究プロトコルを審査し、承認している（No. 2024k007）。サンプルサイズはG*Powerを用いて算出した。選択した検定はt検定であり、統計的検定は2つの独立したサンプル間の差を検出するように設計した。効果量 d = 0.5、α = 0.05、検出力 power = 0.9とした場合、計算により各群に最低86名の被験者を組み入れる必要があることが示された。試験中の不測の事態を考慮し、各群に116名の患者を組み入れた。2024年7月から2025年7月までに上海市浦東新区人民医院を受診したIBS-D患者計116名を、本研究の実験群とした。組み入れ基準は、(1) Rome IV診断基準を満たすIBS-Dであること、(2) 大腸内視鏡検査で粘膜に器質的病変が認められないこととした。除外基準は、(1) 炎症性腸疾患（IBD）や大腸がんなどの患者、(2) 糖尿病患者、(3) 最近に腹部手術の既往がある患者、(4) 重度の心不全、肝不全、または腎不全がある患者とした。同時に、年齢や性別などの人口統計学的特性が患者と一致する健康なボランティア116名を対照群として募集した。健康対照群は、慢性胃腸疾患の既往または対応する臨床症状がないことを確認した。全被験者から5 mLの末梢静脈血を採取した。その後、上清を-80 °Cの超低温冷凍庫に移し、次段階のRNA抽出に向けて凍結保存した。
各参加者は10日間のアンケートに回答し、以下の臨床症状を記録した：(a) 10段階のビジュアルアナログスケールを用いた腹痛の重症度評価、(b) 調査期間中の腹痛の頻度（腹痛があった日数）、(c) 排便回数（1日あたりの最大排便回数）、(d) 便の形態を評価するためのブリストル便形状スケール。被験者の精神状態は、病院不安・抑うつ尺度（HADS）を用いて評価された。
細胞培養およびモデリング
Caco-2細胞は、10%胎児ウシ血清（FBS）および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用い、37 °C、5% CO₂のインキュベーター内で通常培養した。Caco-2細胞株は、密接結合（タイトジャンクション）と微絨毛を持つ分極した単層細胞へと自然に分化し、成熟した腸上皮細胞に類似した形態的および機能的特性を示す。LPSは炎症反応を誘発し、腸上皮の密接結合を破壊して腸管透過性を亢進させるが、この過程はIBS-Dの病理学的特徴に非常に類似している。さらに、LPS処理したCaco-2細胞がIBS関連のバリア機能不全および炎症のモデルとして先行研究19,20,21で広く用いられていることから、本研究ではIBS-Dのin vitroモデルを構築するために、Caco-2細胞へのリポポリサッカライド（LPS）処理を選択した。細胞のコンフルエンスが約80%に達した後、培地を5 µg/ml LPS22を含む完全培地に交換し、24時間刺激した。LPSを加えず通常培養した細胞をコントロール群とした。
細胞へのトランスフェクション
Caco-2細胞におけるNEAT1およびmiR-29b-3pの役割を調べるため、Caco-2細胞にトランスフェクションを行った。細胞は以下の6つのグループに分けた：1. コントロール群（未処理）、2. LPS群、3. LPS + si-NC群、4. LPS + si-NEAT1群、5. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC群、および6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitor群。 NEAT1を標的とする2種類の小分子干渉RNA（si-NEAT1）を設計し、合成した：si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) および si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′)。ネガティブコントロールとして、非標的ランダム配列siRNA（si-NC）を使用した。同時に、miR-29b-3p inhibitorとそのネガティブコントロールも合成した。miR-29b-3p inhibitor: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’、ネガティブコントロール: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。
Caco-2細胞を24ウェルプレートに播種し、コンフルエンシーが60–70%に達した時点で、製造元のプロトコルに従ってトランスフェクションを行った。簡潔に述べると、1.25 µLのsiRNAを25 µLの低血清培地で希釈し、最終的なsiRNA濃度を50 nMとした。miRNA抑制については、2 µLのmiR-29b-3pインヒビターまたはそのネガティブコントロールを25 µLの低血清培地で希釈し、最終濃度を100 nMとした。別途、1.5 µLのトランスフェクション試薬を25 µLの低血清培地と混合した。その後、希釈したsiRNA（またはインヒビター/ネガティブコントロール）を希釈したトランスフェクション試薬と混合してトランスフェクション複合体を形成させ、これを細胞に滴下した。トランスフェクションの6時間後に、トランスフェクション混合液を新鮮な完全培地と交換し、後続の機能解析までさらに48時間細胞を維持した。さらに実験を進める前に、RT-qPCRを用いてノックダウンまたは抑制効率を確認した。
リアルタイム定量逆転写PCR (RT-qPCR)
指定の処理を施した血清サンプルおよびCaco-2細胞から全RNAを抽出した。簡潔に述べると、各サンプルを1 mLのRNA抽出試薬で溶解し、200 µLのクロロホルムと混合した。12,000 × g 4 °Cで15分間静置した後、上層の水相を新しいチューブに移し、500 µLのイソプロパノールと混合して−20 °Cで30分間保持した。その後、サンプルを12,000 × g 4 °Cで10分間静置した。得られたRNAペレットを75%エタノールで2回洗浄し、風乾させた後、20 µLのRNaseフリー水に再懸濁した。RNAの収量と純度をマイクロ分光光度計で測定し、A260/A280 1.8～2.0の値が使用された。RNAは製造元のプロトコルに従ってcDNAに逆転写された。～の検出には NEAT1, ZO-1、 オクルディン クローディン-2 および GAPDH1× RTバッファー、0.5 mM dNTPs、0.5 µM oligo(dT)プライマー、200 U 逆転写酵素、およびRNaseフリー水を含有する20 µLの逆転写反応1回につき、1 µgの全RNAを用いた。反応は37 °Cで15分間行い、続いて85 °Cで5秒間酵素を不活性化した。
SYBR GreenベースのリアルタイムPCRシステムを用い、cDNAをテンプレートとして定量的PCRを実施した。NEAT1、miR-29b-3p、ZO-1、occludin、およびclaudin-2の発現レベルを遺伝子特異的プライマーを用いて測定した。miR-29b-3pの参照遺伝子としてU6を用い、NEAT1およびタイトジャンクション関連遺伝子の正規化にはGAPDHを用いた。相対発現量は2−ΔΔCt法を用いて算出した。プライマー配列は表1に記載している。
細胞生存率アッセイ
対数増殖期のCaco-2細胞を、1ウェルあたり1 × 104 cellsの密度で96ウェルプレートに播種した。ブランクコントロール群（培地のみ）、コントロール群（未処理細胞）、および実験群（異なる処理条件下にあるCaco-2細胞）を設定し、各群につき5～6ウェルの二連（duplicate）で作成した。細胞は、0、24、48、72 hの4つのタイムポイントに割り当てた。測定中のインキュベーターの開閉回数を減らすため、タイムポイントごとに個別の培養プレートを用意した。培養期間後、気泡が生じないように注意しながら、各ウェルに10 µLのCCK-8溶液を添加した。その後、培養プレートを37 °C、5% CO₂インキュベーターに戻し、暗所で2 hインキュベートした。直ちにマイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの450 nmにおける吸光度を測定した。最終的に、細胞生存率をパーセンテージで算出した。
細胞アポトーシスアッセイ
アポトーシスは、Annexin V-FITC/PI染色後、フローサイトメトリーにより定量化した。各処理群のCaco-2細胞を回収し、氷冷PBSで2回洗浄した。遠心分離は4 °Cにて300 × gで5分間行った。細胞ペレットを100 µLの1×バインディングバッファーで再懸濁し、続いて5 µLのAnnexin V-FITCおよび5 µLのPIを順次添加した。穏やかに混合した後、サンプルを室温・暗所で15分間インキュベートした。次に、300 µLの1×バインディングバッファーを添加し、懸濁液を注意深く混合してから5 mLフローサイトメトリー用チューブに移した。サンプルは1時間以内にフローサイトメトリーで解析した。
経上皮電気抵抗 (TEER)
透過性は、Caco-2細胞のTEER値を測定することで評価した23。Caco-2細胞をTranswellチャンバーに播種し、21日間培養して緻密な単層を形成させた。各実験条件下で6つの独立した生物学的反復を行い、さらに各条件下で5つのテクニカルリプリケート（技術的反復）を実施した。実験処置の前後で、エタノールで滅菌しPBSで平衡化した電極を用いた膜貫通抵抗計により、各群のTEER値を測定した。簡潔に述べると、フィルター膜への接触を避けるため、電極の長い棒を基底側の培養液に、短い棒を頂端側の培養液に浸した。安定後、抵抗値（Ω）を読み取り、3回の安定した読み値が得られるまで測定を繰り返した。細胞を含まないブランクのTranswellフィルターの抵抗を同一条件で測定し、この値をすべての実験測定値から差し引いた。TEER（Ω·cm2）＝（サンプル抵抗 － ブランク抵抗）× 有効膜面積として算出した。データは（実験群／対照群）× 100%として的に示した。
酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)
24時間の培養後、異なる処理群のCaco-2細胞から上清を回収した。腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-8（IL-8）、およびインターロイキン-1β（IL-1β）を含む前炎症性サイトカインのレベルを、市販のELISA試薬を用いて製造者の指示に従い測定した。アッセイは、指示書に厳密に従って実施した。抗体が予めコーティングされたウェルにサンプルと標準物質を加え、インキュベート後、洗浄した。次に、ビオチン化検出抗体を添加した。再度インキュベートおよび洗浄を行った後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを添加した。最後に、呈色のために基質TMBを加え、停止液で反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて直ちに450 nmで測定した。
ウェスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファーを用いて、指示された処理後のCaco-2細胞からタンパク質を単離した。タンパク質量はBCAアッセイにより測定した。各サンプルについて、1レーンあたり30 µgのタンパク質を負荷し、10% SDS-PAGEゲルで分離後、PVDF膜に転写した。膜を5%脱脂粉乳で室温で1時間ブロッキングし、次いでZO-1 (1:1,000)、occludin (1:500)、claudin-2 (1:1,000)、およびGAPDH (1:5,000)に対する抗体を用いて4 °Cで一晩インキュベートした。洗浄後、膜をHRP標識二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。バンドを化学発光（ECL）法により検出し、バンド強度はImageJを用いて解析した。GAPDHをローディングコントロールとして用いた。
デュアルルシフェラーゼレポーター (DLR) アッセイ
ENCORIデータベース（https://rnasysu.com/encori/）を用いて、NEAT1配列に対するmiR-29b-3pの潜在的な結合部位を予測した。続いて、野生型（WT）または変異型（MUT）の結合部位を含むNEAT1断片をpmirGLOリポーターベクターにクローニングした。構築した組換えプラスミドを、miR-29b-3pミミック（Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’）または阻害剤、およびそれぞれのネガティブコントロール（mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）と共に細胞へ共導入した。導入から48時間後、細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼ検出試薬を用いてホタルルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼの活性を測定した。標準化のための内部参照としてレニラルシフェラーゼ活性を用いた。
RNA免疫沈降（RIP）アッセイ
RIPアッセイでは、Caco-2細胞を回収してPBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびRNase阻害剤を添加した200 µLのRIP溶解バッファー中で氷上15分間インキュベートした。細胞溶解物を4 °Cで16,000 × g、10分間遠心分離し、各上清10 µLをインプットコントロールとして回収した。免疫沈降では、40 µLのProtein A/G磁気ビーズを、5 µgのanti-Ago2抗体またはノーマルIgGを含む200 µLのRIP洗浄バッファー中で、室温で30分間回転混和した。500 µLのRIP洗浄バッファーで3回洗浄した後、ビーズ懸濁液100 µLを溶解物100 µLと混合し、RIP洗浄バッファーで最終容量1 mLに調整して、4 °Cで一晩回転インキュベートした。その後、ビーズを500 µLのRIP洗浄バッファーで5回洗浄し、同バッファー150 µLで再懸濁した。15 µLのproteinase K (20 mg/mL)および15 µLの10% SDSを添加し、55 °Cで30分間振盪しながらインキュベートしてタンパク質消化を行った。上清を回収し、抽出試薬を用いてRNAを単離し、一晩沈殿させた。その後、RT-qPCRによりNEAT1およびmiR-29b-3pの濃縮度を評価した。
細胞内局在解析
メーカーの指示に従い、市販の核・細胞質分画試薬を用いてCaco-2細胞を核画分と細胞質画分に分離した。これら2つの画分から全RNAを抽出し、RT-qPCRにより核および細胞質におけるNEAT1の分布を検出した。分画効率の指標として、U6（主に核に存在）およびGAPDH mRNA（主に細胞質に存在）を用いて校正を行った。
統計解析
臨床血清検体について、パワー分析（t-検定、d = 0.5、α = 0.05、power = 0.9）を行った結果、1群あたり最低86名の被験者が必要であることが示された。試験中の不測の事態を考慮し、臨床的に有意な差を検出するために各群116名の患者を登録した。連続変数のデータの正規性はShapiro-Wilk検定を用いて評価した。すべての連続データが正規分布に従っていたため（P > 0.05）、パラメトリック分析を適用した。カテゴリ変数はカイ二乗検定を用いて分析した。細胞ベースの実験では、6回の独立した生物学的反復を行い、各生物学的反復に対して5回のテクニカルリプリケートを作成した。データは平均値 ± SDとして提示している。2つの連続変数群間の比較にはStudentのt-検定を用い、複数群間の比較には一元配置分散分析（one-way ANOVA）後、Tukeyのポストホック検定を用いて分析した。統計的有意性はP < 0.05と定義した。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
NEAT1の発現と診断的価値
健康対照（HC）群と比較して、IBS-D患者におけるNEAT1の発現レベルは著しく高かった（P < 0.0001; Figure 1A）。受信者動作特性（ROC）曲線で示されるNEAT1の曲線下面積（AUC）は0.867（95% CI: 0.821–0.913）であった。特異度は75.9%、感度は84.5%であった（Figure 1B）。このことは、IBS-D患者の血清におけるNEAT1の異常発現が、本疾患の新規な診断バイオマーカーとして利用できる可能性を示唆している。
さらに、健康群とIBS-D群の患者の臨床データを比較した。その結果、年齢、性別、その他の特性において2群間に有意な差は認められなかった（P > 0.05）。しか...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
IBS-Dは一般的な機能性胃腸管障害である。その病理学的メカニズムは完全には解明されていない。近年、エピジェネティック調節における重要な分子であるlncRNAは、疾患の診断および治療の分野で大きな可能性を示している。lncRNA NEAT1は、大腸がん24、神経膠腫25、心筋梗塞26などの様々な疾患で研究されてきた。複数の研究により、NEAT1が炎症反応13、細胞増殖27、および腸管バリアの完全性28の調節に関与していることが示されている。しかし、IBS-DにおけるNEAT1の特異的な発現、その臨床的価値、およびIBS-Dの根底にある調節メカニズムについては、まだ十分に探索されていない。
NEAT1 肺炎などのさまざまな炎症性疾...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者らに開示すべき利益相反はありません。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24ウェルプレート | Corning | CLS3524 | 細胞播種用 |
| 96ウェルプレート | Corning | CLS3599 | CCK-8アッセイでの細胞播種用 |
| Annexin V-FITC/PI アポトーシス検出キット | Invitrogen | V13242 | アポトーシス率の検出用 |
| Anti-AGO2 モノクローナル抗体 | Proteintech | 67934-1-Ig | Ago2結合RNA複合体の免疫沈降用 |
| Anti-Claudin-2 抗体 | Invitrogen | 32-5600 | 一次抗体、希釈倍率 1:1000 |
| Anti-GAPDH 抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | 一次抗体、希釈倍率 1:5000、ローディングコントロール |
| Anti-Human IgG 抗体 | Proteintech | 10284-1-AP | RIPアッセイのネガティブコントロールとして使用 |
| Anti-Occludin 抗体 | Abcam | ab31721 | 一次抗体、希釈倍率 1:500 |
| Anti-ZO-1 抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | 一次抗体、希釈倍率 1:1000 |
| Caco-2 細胞 | SUNNCELL | SNL-068 | 腸上皮バリアモデルの構築用 |
| CCK-8 キット | Solarbio | CA1210 | 細胞増殖アッセイキット |
| クロロフォーム | Sigma-Aldrich | C2432 | RNA抽出時の相分離用 |
| DMEM培地 | Gibco | 11965092 | 細胞培養用 |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | ThermoFisher | 16186 | ルシフェラーゼ活性の検出用 |
| ELISAキット（IL-1β用） | R&D Systems | DY201 | 細胞培養上清中の標的タンパク質の検出用 |
| ELISAキット（IL-6用） | R&D Systems | D6050B | 細胞培養上清中の標的タンパク質の検出用 |
| ELISAキット（IL-8用） | R&D Systems | NBP3-28022 | 細胞培養上清中の標的タンパク質の検出用 |
| ELISAキット（TNF-α用） | R&D Systems | DTA00D | 細胞培養上清中の標的タンパク質の検出用 |
| 強化化学発光 (ECL) 基質 | Thermo Fisher | 32106 | タンパク質バンドの可視化用 |
| エタノール (75%) | Sigma-Aldrich | 459844 | RNAペレットの洗浄用 |
| FBS (ウシ胎児血清) | Gibco | 10099141 | 細胞培養用 |
| フローサイトメーター | Beckman Coulter | B53002 | アポトーシス率の検出用 |
| HRP標識二次抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | ECL基質による化学発光信号の生成を触媒する |
| イソプロパノール | Sigma-Aldrich | 1133502500 | RNA沈殿用 |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | トランスフェクション試薬 |
| リポポリサッカライド (LPS) | Sigma-Aldrich | L2880 | 細胞モデル構築の誘導用 |
| マイクロプレートリーダー | BioTek | Epoch 2 | 96ウェルプレート中のサンプルの吸光度検出用 |
| Nanodrop マイクロ分光光度計 | Thermo Scientific | ND-2000C | RNA濃度および純度の決定用 |
| 脱脂粉乳 | Coolaber | CN7861 | メンブレンのブロッキング用（5%溶液） |
| PARIS Kit | Thermo Fisher | AM1921 | 核・細胞質分画用 |
| ペニシリン–ストレプトマイシン | Gibco | 15140122 | 細胞増殖時のコンタミネーション防止用 |
| Pierce BCA プロテインアッセイキット | Thermo Fisher | 23225 | タンパク質濃度の決定用 |
| pmirGLO Dual-Luciferase ベクター | Promega | E1330 | デュアルルシフェラーゼリポーター遺伝子ベクター |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Takara | RR047A | RNAからcDNAへの逆転写用 |
| PVDF メンブレン | Millipore | IPVH00010 | SDS-PAGE後のタンパク質転写用 |
| リアルタイム蛍光定量PCR装置 | Applied Biosystems | 4365464 | 標的遺伝子の検出用 |
| RIPAライシスバッファー（プロテアーゼ阻害剤含有） | Thermo Fisher | 89901 | 細胞からの全タンパク質抽出用 |
| RNA結合タンパク質免疫沈降キット | Sigma-Aldrich | 17-701 | Protein A/G マグネットビーズを用いた RNA結合タンパク質免疫沈降 (RIP) アッセイ |
| SDS-PAGE 試薬 (10% ゲル) | TargetMol | C0189 | 分子量によるタンパク質分離用 |
| SYBR Green マスターミックス | Thermo Fisher | 4309155 | PCR検査用 |
| TEER 測定器 (電圧・電流計) | Millipore | MERS00002 | 経上皮電気抵抗測定器、単層の完全性の測定用 |
| Transwell チャンバー | Corning Costar | CLS3413 | 細胞単層の培養およびTEER測定用 |
| TRIzol 試薬 | Invitrogen | 15596026CN | 全RNA抽出用 |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。