脊髄損傷(SCI)患者では、 CASC11 のアップレギュレーションが損傷の重症度と関連しています。 in vitroでは 、CASC11 のダウンレギュレーションがアポトーシスと炎症を緩和し、miR-130b-5p/SPP1 軸との関連を示唆しました。これらの結果は 、CASC11がSCIの病因におけるバイオマーカー候補としての役割を果たす可能性を示唆しています。
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研究記事
* These authors contributed equally
脊髄損傷(SCI)患者では、 CASC11 のアップレギュレーションが損傷の重症度と関連しています。 in vitroでは 、CASC11 のダウンレギュレーションがアポトーシスと炎症を緩和し、miR-130b-5p/SPP1 軸との関連を示唆しました。これらの結果は 、CASC11がSCIの病因におけるバイオマーカー候補としての役割を果たす可能性を示唆しています。
脊髄損傷(SCI)は重度の中枢神経系の外傷です。この単一施設、観察的および in vitro 研究は、臨床血清サンプルおよびリポ多糖刺激細胞モデルを用いて、 CASC11 の診断可能性およびSCIにおける調節機構を調査 しました。 CASC11、miR-130b-5p、 およびSPP1 レベルはリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)で測定されました。細胞機能および標的関係は、細胞計数kit-8(CCK-8)、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、デュアルルシフェラーゼレポーター、RNA免疫沈殿(RIP)アッセイを用いて評価されました。 CASC11 は脊髄損傷で高発現し、炎症と関連し、診断バイオマーカーとして期待されていました。リポ多糖(LPS)処理されたPC-12細胞では、 CASC11 をサイレンシングすることで細胞活性の抑制、アポトーシス、炎症が緩和され、これらはmiR-130b-5p阻害剤によって逆転しました。これらの結果は、 CASC11 が脊髄損傷の重症度と関連していることを示唆し、 in vitro データでは CASC11/miR-130b-5p/SPP1 軸を通じて炎症およびアポトーシス応答に関与していることが示されています。本研究は単一センター設計と生 体内 検証の欠如により制約があります。
脊髄損傷(SCI)は、外的要因や疾患によって引き起こされる脊髄損傷に起因する一時的または永続的な全身性障害を指し、運動、感覚、反射、自律神経系の機能障害を招くことを指します。患者は生涯にわたる身体機能の欠損や合併症に遭遇し、個人や家族に大きな苦痛と負担を強いることが多いです。脊髄損傷の病因は大きく外傷性と非外傷性の起源に分類されます。外傷は主に交通事故、高所からの転落、スポーツ関連の事故などの外的要因による脊椎骨折に起因し、SCI4の臨床管理においてますます大きな課題となっています。一方で、一次損傷後に始まる二次損傷の連鎖、特に炎症反応の調節障害や神経細胞のアポトーシスは、神経機能の継続的な悪化に寄与する重要な要因と考えられています。最近の研究では、神経炎症、再生、機能回復がSCI5の病態生理および修復において重要な役割を果たすことが強調されています。神経炎症は中枢的な二次反応として、組織損傷と修復の過程で二重の役割を果たします。損傷した脊髄の再生能力が限られていることから、抗炎症治療、細胞移植、リハビリテーション、分子介入を組み合わせた相乗的な治療アプローチが必要です。脊髄損傷に対する診断および治療戦略は幅広く確立されていますが、現在の臨床実践は主に画像診断に依存しています7。しかし、これらの技術は高度な機器の要求が高く、患者に厳しい前提条件があり、多額の費用がかかるため制約があります。したがって、便利で正確かつ非侵襲的な実験室用バイオマーカーの緊急かつ未充足のニーズが存在しています。このようなマーカーの特定により、従来の治療プロトコルを乱すことなくSCIの早期診断が可能となり、よりタイムリーで効果的な治療介入の開発が促進されます。
長く非コードRNA(lncRNA)は、タンパク質コード能力は欠けているものの、炎症やアポトーシスの調節など幅広い生物学的機能に不可欠な機能RNA分子の主要なカテゴリーです。LncRNAはマイクロRNA(miRNA)の分子スポンジとして機能し、これらのmiRNAが標的mRNAに結合しサイレンシングするのを効果的に妨げます10。例えば、lncRNA MAGI2-AS3はmiR-223-3pを媒介して骨折治癒を加速させます11。lncRNAのOIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2ネットワークを標的とすることは、SCI12の回復を改善する有望な治療アプローチを示しています。 CASC11は872塩基の転写産物が染色体8q24.21に位置し、さまざまなヒトがんで発現調節異常を持つ分子として認識されています13。CASC11は閉経後骨粗鬆症患者で陽性発現を示し、患者と健康な対照群を区別する能力を持っています14。さらに、CASC11も骨折患者において同様のアップレギュレーションパターンと治療的潜在力を示します15。これらの報告に基づき、CASC11は炎症反応や細胞活動を調節する可能性がある。これらの知見にもかかわらず、SCIにおけるCASC11の発現パターンや生物学的役割は依然として全く解明されていません。過炎症とアポトーシスが二次性SCIの主な原因であることを踏まえ、CASC11がSCIのバイオマーカーおよび調節因子候補である可能性を仮説しました。本研究は、患者コホートおよびin vitro細胞モデルを解析することで、SCIにおけるCASC11の臨床関連およびバイオマーカーの可能性を調査しました(図1)。さらに、CASC11の分子メカニズムの可能性、特にSCI後の炎症反応の調節におけるその役割の可能性も探りました。
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科目の登録
2023年1月から2025年5月にかけて病院で治療を受けた急性脊髄損傷(n = 300)患者は、米国脊髄損傷協会障害尺度(AIS分類)に基づき、完全脊髄損傷(CSCI)群(グレードA、n = 98)、不完全脊髄損傷(ISCI)群(グレードB、C、D;n=95)、および正常神経機能(NNF)群(グレードE、n=107)に選抜・分類されました。NNF群の患者では、浮腫、打撲、圧迫などの脊髄損傷の放射線学的証拠はMRI(MRI)で確認されましたが、感覚や運動の欠損は認められませんでした。同じ期間に募集された健康な90名の参加者が対照群として選ばれました。選択基準は以下の通りです:(1) 確立された臨床管理ガイドラインに従い、画像診断(MRIまたはCT)で確定した脊髄損傷(SCI)16;(2) 入院前24時間以内に負った外傷;および(3)臨床データが完全な成人参加者。除外基準は以下の通りです:(1) 骨折または脊髄損傷に関連する既往手術歴;(2) 重度の冠動脈疾患または重大な心肺疾患;(3) 急性重度の頭蓋脳損傷;および(4)悪性腫瘍、心血管・脳血管疾患、または免疫疾患。本研究の承認は深圳第四人民病院倫理委員会から得られ、被験者からインフォームド・コンセントも得られました。本研究で用いられた手続きはヘルシンキ宣言の原則に沿ったものでした。
標本の収集
入院時には、損傷から24時間以内に血清分離管を使用して静脈血サンプル(5 mL)を採取しました。血液は室温で30分間凝固させ、その後3,000× g で4°Cで10分間遠心分離しました。 上澄液は慎重に分離され、RNaseフリーマイクロチューブに分割され、-80°Cで保存され、さらなる分析を待った。
細胞培養とLPS誘導
ラットの褐色細胞細胞(PC-12)およびマウスの微粒膠細胞(BV-2)は、10%胎児用牛血清を37°Cで添加したDulbecco's modified Eagle培地で培養しました。 in vitro 炎症性損傷モデルを構築するために、PC-12およびBV-2細胞を0、1、5、10 μg/mLの濃度で12時間17分にわたりリポ多糖(LPS)にさらしました。各濃度は3つの独立した生物学的複製で試験されました。
RT-qPCR
フェノール・クロロホルム抽出プロトコルを用いてサンプルから全RNAを単離し、その後イソプロパノールで沈殿しました。RNA純度は分光光度測定で評価され、下流解析にはA260/280 nm 比の1.8〜2.1 nmのサンプルが使用されました。RNAは逆転写キットプロトコルに従ってcDNAに逆転写され、得られたcDNAはPCR機器上のSYBR Greenプレミックスを用いたRT-qPCR反応のテンプレートとして使用されました。グリセラルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)が CASC11 および SPP1 mRNAの参照遺伝子として用いられ、miR-130b-5pの参照遺伝子として小さな核RNA(U6)が用いられました。血清サンプルでは、RNA抽出前に合成セル-miR-39を血清にスパイクし、RNA回復の変動を制御しました。プライマーは以下の通りです: CASC11 前方 5'-ACCCTATGGAACCGAGAC-3' および逆方向 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAGAAT-3';miR-130B-5P前進5'-ATCCATGGGTGAGCTCCG-3'および後退5'-TAGTGCAACCTCGTCAGC-3';および SPP1 mRNAは順方向に5'-GTTAAACAGGCTGATTGG-3'、逆方向は5'-CATGGTCATCATCATCTTCA-3'です。発現は2-ΔΔCt 法を用いて計算されました。各RT-qPCR反応は、3回の生物学的複製を含む三重の技術的複製で実施されました。
トランスフェクション
CASC11(si-CASC11)、miR-130b-5pミミック/阻害剤、SPP1過剰発現プラスミド(ov-SPP1)、およびそれぞれの陰性対照群(NC)を合成し、トランスフェクション試薬を用いてPC-12およびBV-2細胞にトランスフェクトしました。トランスフェクション効率は、三重生物複製体で48時間後に評価されました。
増殖およびアポトーシスアッセイ
細胞生存可能性アッセイでは、細胞を96ウェルプレートに5個×10個3個の セルでシードし、24時間培養して付着を可能にしました。このインキュベーション後、各ウェルに10 μLのCCK-8試薬を投入し、その後37°Cで2時間のインキュベーションが行われました。 その後、マイクロプレートリーダーで450 nmの光学密度を記録しました。アポトーシス検出のために、トリプシンで細胞を剥離し、リン酸緩衝生食塩水(PBS)で2回洗浄し、結合バッファー中に懸浮して最終濃度1 ×10 6 cells/wellにしました。次に、懸濁液100μLを5mLのフローサイトメトリーチューブに投与し、その後5μLのAnnexin V-FITCおよび5μLのプロピジウムヨウ化物(PI)染色液を加えました。サンプルは優しく混ぜ、室温で15分間光を遮断して保管しました。その後、結合バッファーを1本あたり400μLの追加体積に加え、フローサイトメトリーでアポトーシス細胞を定量化しました。すべての条件は、3つの独立した生物学的実験で3つの技術的再現を用いて解析されました。
デュアルルシフェラーゼ活性アッセイ
CASC11およびmiR-130b-5pの下流標的は、バイオインフォマティクスのウェブサイト(lncRNASNP2およびTargetScan)を通じて予測されました。野生型(wt)または変異型(mut)の補完配列を含む断片を合成し、デュアルルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングしてwtおよびmutレポータープラスミドを構築しました。PC-12細胞はmiR-130b-5pミミック/阻害剤および構築されたwt/mutプラスミドと共トランスフェクトされ、脂質系トランスフェクション試薬を用いました。48時間後、ルシフェラーゼ活性を定量化し、相互作用を評価しました。各グループは3つの技術的複製と3つの生物学的複製で構成されていました。
RNA免疫沈殿法(RIP)アッセイ
RIPはRNA結合タンパク質免疫沈殿キットを用いて実施されました。細胞は溶解バッファーで溶解され、抗Ago2抗体または正常IgG抗体で培養されました。RNAタンパク質複合体は磁気ビーズを用いて濃縮されました。洗浄後、結合タンパク質を除去し、免疫沈殿したRNAを単離しました。 CASC11 およびmiR-130b-5pの濃縮レベルはRT-qPCRで定量されました。各グループは3つの技術的複製と3つの生物学的複製で構成されていました。
ウェスタン・ブロット
PC-12およびBV-2細胞から細胞溶解バッファーを用いてタンパク質溶解液を製製し、総タンパク質含有量はBCAアッセイで測定しました。各サンプルに対して、30μgのタンパク質を12%のSDS-PAGEゲルに負荷し、電気泳動分離後にPVDF膜に移しました。膜は室温でTBSTで希釈した5%脱脂乳で2時間ブロックされ、その後4°CでBcl-2、Bax、切断カスパーゼ3、GAPDHに対する一次抗体を希釈1:1,000で一晩培養しました。洗浄後、膜はHRP結合二次抗体で室温で1時間インキュベートされました。画像解析ソフトウェアでタンパク質信号を解析し、バンド密度を用いてアポトーシス関連タンパク質の発現を評価しました。ウェスタンブロット実験には3回の生物学的複製が含まれ、各グループごとに3回の技術的重複が行われました。
エリサ
患者血清中の炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6の濃度とPC-12およびBV-2細胞上清液は、製造元の指示に従ってELISAキットを用いて定量化しました。サンプルは事前にコーティングされたウェルで培養され、検出抗体が追加されてさらなる培養が行われました。酵素共役体が追加され、培養されました。洗浄後、色素の発現用基質が追加され、反応は終了しました。吸収はマイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定され、提供された標準曲線に基づいて炎症因子濃度に変換されました。各ELISAアッセイは、3つの独立した生物学的複製にまたがる三重の技術的複製として実施されました。
統計解析
連続変数は平均±標準偏差(SD)として報告され、カテゴリ変数は数値とパーセンテージ(n, %)で示されました。2つのグループ間の比較は学生の t検定を用いて行われました。2群以上の比較では、一方移動分散分析(ANOVA)を適用し、その後Tukeyの事後検査を行った。CASC11が臨床グループ間で識別できる能力は、受講者運転特性(ROC)曲線解析を用いて評価されました。2つの変数間の関連はピアソン相関解析で調査されました。細胞ベースの実験では、各グループに3つの独立した生物学的複製が含まれ、各測定は3つの技術的重複で繰り返し行われました。統計的有意は P < 0.05と定義されました。
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被験者の基本データ
対照群、NNF、ISCI、CSCI群の患者の基準的特徴は 表1に示されています。統計解析では、性別、年齢、体格指数(BMI)、損傷の原因、損傷時刻などの変数に有意なグループ間差は認められませんでした(P > 0.05)。4群間で入院期間、ASIAグレード、炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン1β(IL-1β)、インターロイキン6(IL-6)の濃度において有意な差が観察されました(P < 0.001)。
SCIにおける CASC11 上昇の診断可能性
血清中のCASC11レベルは、すべてのSCI患者群で対照群と比較して有意に高値が見られました。この上昇はCSCIと診断された人で最も顕著でし...
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脊髄損傷は中枢神経系に壊滅的な疾患であり、感覚、運動制御、自律神経機能に著しい障害をもたらすことが多いため、患者の生活の質と長期予後を大幅に低下させます。脊椎外傷後に機能障害や感覚喪失を呈する患者はおり、MRIなどの画像検査を用いてSCI19の発生を評価することができます。脊髄損傷の発症は有害な二次損傷カスケードを引き起こし、激しい神経炎症、浮腫、炎症細胞の浸潤を特徴とします。この連鎖反応は外傷性の痛みのストレスと相まって、徐々に神経機能を乱します20,21。損傷後の初期段階は臨床的悪化のリスクが高いことが特徴であり、病気の進行を止める上で適時の医療介入が不可欠であることを強調しています。
脊椎外傷や神経損傷に関する臨床研究の領域は急速に変革を遂げており、この疾患の根本的なメカニズムに対する新たな視点を提...
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著者には開示すべき利益相反はありません。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BCAタンパク質アッセイキット | Yeasen、中国 | P0010 | |
| CCK-8溶液 | Sigma-Aldrich、米国 | 96992 | |
| デュアルルシフェラーゼレポーターベクター | Promega、米国 | E133A | pmirGLOベクター |
| Dulbecco’s改変イーグル培地 | ATCC、マナッサス、VA、米国 | 30-2002 | |
| IL-1β用ELISAキット | R&D Systems、米国 | DY401 | |
| IL-6用ELISAキット | R&D Systems、米国 | HS600B | |
| TNF-α用ELISAキット | R&D Systems、米国 | DTA00C | |
| 胎児ウシ血清 | Gibco、グランドアイランド、NY、米国 | 10099141 | |
| フローサイトメーター | BD FACSCalibur、米国 | FACS101 | |
| 画像解析ソフトウェア | NIH、ベセスダ、MD、米国 | バージョン1.44p | ImageJソフトウェア |
| イソプロパノール | 北京化工厂、中国 | 32064 | |
| 脂質ベースのトランスフェクション試薬 | Invitrogen、カールスバッド、CA、米国 | L3000008 | Lipofectamine 3000 |
| リポポリサッカライド | Sigma-Aldrich、米国 | L2880 | |
| ライシスバッファー | Beyotime、中国 | P0013D | RIPAライシスバッファー |
| マイクロプレートリーダー | Reagen、中国 | RNE90002 | |
| PC-12およびBV-2細胞 | ATCC、マナッサス、米国 | ||
| フェノール-クロロホルム試薬 | Thermo、米国 | 15596026 | Trizol試薬 |
| 逆転写キット | Takara、日本 | RR047A | PrimeScript RTキット |
| RNA結合タンパク質免疫沈降キット | Millipore、米国 | 17-700 | Magna RIPキット |
| RNaseフリーマイクロチューブ | Axygen、Corning、NY、米国 | MCT-150-C-S | |
| 血清セパレーターチューブ | テルモ、東京、日本 | VP-AS109K60 | |
| 統計解析ソフトウェア | サンディエゴ、米国 | バージョン9.0 | GraphPad Prism |
| SYBR Greenプレミックス | Takara、日本 | RR420A | SYBR Premix Ex Taq |