生理的パルサタイルせん断応力と振動性高血糖を組み合わせた内皮機能障害をモデル化するためのマイクロ流体システム

Summary

ここでは、内皮細胞に同期振動性高血糖およびパルサタイルせん断応力を曝露するマイクロ流体システムを製作・運用するプロトコルを提示します。このアプローチは、糖尿病の内皮機能障害を研究するための生理学的に関連性の高い in vitroモデルを提供します。このプロトコルにより、酸化ストレスおよび内皮細胞応答の定量的測定が可能になります。

Abstract

糖尿病血管合併症における内皮機能障害は、代謝障害、特に振動性グルコース(OG)と脈拍せん断ストレス(PSS)との複雑な相互作用を伴います。これらの要因は個別に調査されていますが、従来のモデルは静的な高血糖または単純化された層流に限定されており、糖尿病血管に見られる統合された時空間的結合を模倣する能力が不足しています。プログラム可能なマイクロ流体プラットフォームを活用することで、同期振動性高血糖と生理的PSSが内皮細胞に与える統合的影響を調査する貴重なプラットフォームを提供します。本プロトコルは、生理学的に関連した代謝および機械的結合条件下での内皮機能障害をモデル化することを目的としています。ポリジメチルシロキサン(PDMS)チップと圧力駆動制御システムを組み合わせることで、流れ波形やグルコース濃度プロファイルの正確かつ独立した変調が可能となります。システムの血行動態の忠実度はマイクロ粒子画像速度測定法(Micro-PIV)によって検証され、細胞応答は細胞内活性酸素種(ROS)レベルと細胞生存率の監視によって定量的に特徴付けられます。代表的な結果は、生理学的PSSがOGによる酸化損傷を効果的に減弱することを示しています。この効果は、細胞内ROSレベルの低下と、複合刺激条件下での細胞生存率の向上によって示されています。研究課題に応じて、せん断応力パターン、グルコース振動周波数、チャネル形状などのパラメータを調整できます。この方法は、メカノ生物学的経路のメカニズム的研究や糖尿病血管疾患の治療的介入のための薬物スクリーニングのための多用途ツールとして機能します。

Introduction

内皮機能障害は、代謝障害と異常な血行^{動態の両方によって引き起こされ}る糖尿病血管合併症の重要な初期イベントです^1,2。OGレベルは持続的な高血糖だけでなく、内皮細胞における酸化ストレスや炎症シグナル伝達の強力な誘発因子としてますます認識されており、血管損傷や恒常性の障害を引き起こす^3,4,5。同時に、血行動態のせん断応力は内皮表現型の主要な決定要因であり、生理的運動条件下でのPSSは一酸化窒素の産生、抗酸化防御、血管保護を促進する^6,7,8。したがって、振動性高血糖と血行動態刺激の統合的な影響を理解することは、内皮機能障害のメカニズムを解明するために不可欠です。

従来のin vitroモデルは、静的な高血糖条件や単純化された層流に依存することが多いため、生体内で存在する代謝と機械的な手がかりの複雑で動的な相互作用を再現^{できません。}動物モデルは糖尿病の全身的側面を捉えていますが、制御された微小環境条件下でシグナル伝達を解析するための細胞レベルの解像度を欠いています¹²。マイクロ流体技術は、生理学的に重要な幾何学における生化学的および生体力学的刺激の正確な時空間制御を提供する効果的な代替手段^{を提供し、さまざまな}革新的な生物医学応用における重要な進展を推進しています(^14,15)。例えば、Chenらは空間的および時間的な壁せん断応力とATPシグナル伝達を用いたマイクロ流体^{デバイスを設計}し、細胞内^Ca2+の動態を研究しました。Yuら¹¹は、生理的PSSと高グルコース濃度の異なる組み合わせ下での細胞反応を検出するための血行動態マイクロ流体チップシステムを開発しました。これらのシステムはせん断ストレスや単一因子代謝異常に対する内皮反応の研究に用いられてきましたが、グルコース振動とPSSの両方を単一のシステム内に統合することに成功したものはほとんどありません。したがって、制御されたマイクロ流体環境下で両要素を同期させる標準化され再現可能なプロトコルが欠如しています。

この手法は、結合されたOGとPSSを供給可能な再現可能なマイクロ流体システムを構築することで、このギャップを埋めます。このアプローチの主な目的は、酸化ストレス、細胞生存能力の低下、および内皮機能障害の基盤となる機械生物学的応答を生理学的に関連性のある形でモデル化することです。静的培養や従来の灌流室とは異なり、このアプローチは既存のモデルを改良し、代謝刺激と機械刺激の両方を同時かつ制御された調節可能にし、糖尿病の血管微小環境により近いものです。さらに、このシステムは生細胞イメージング、リアルタイムモニタリング、分子解析にも対応しており、機構研究、疾患モデリング、内皮機能や損傷の薬物スクリーニングなど幅広い用途に適しています。

Protocol

倫理声明:

注:本プロトコルで使用されるすべての試薬、装置、ソフトウェアは 材料表に記載されています。

1. マイクロフルイディックチップ製造

1. コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使ってマイクロ流体チップの構造(W x L x H = 2 mm x 30 mm x 0.1 mm、 図1A)を設計し、商業会社を通じてSU-8マスターモールドを製作します。
2. PDMS硬化剤とプレポリマーを重量比10:1の比率で清潔なミキシングカップに入れ、5分間激しく手動でかき混ぜます。
3. 混合中に閉じ込められた気泡を除去するため、最低15分間、-0.08MPa以下の真空チャンバーに入れてください。
   注意:気泡の除去を迅速化し溢れを防ぐために、チャンバーを一時的に大気圧まで排気して大きな気泡を破裂させ、その後すぐに再び真空をかけてください。この排気サイクルを2〜3回繰り返し、バルク混合気が完全に透明になり、巨視的な気泡がなくなるまで続けます。
4. PDMSをガラスのペトリ皿に置いたウェハーに注ぎます。
5. PDMSは鋳造中にできた気泡を除去するために、さらに15分間乾燥機でウェハーに注ぎ込みました。
   注意:SU-8マスターモールド構造の近くまたは内部に頑固なマイクロバブルが残っている場合は、それを優しく吹き出すか、手動のゴム製エアブロワーで破裂させてください。マイクロチャネル内の構造的欠陥を防ぐためには、気泡を完全に除去することが極めて重要です。
6. カビとポリマーを含むペトリ皿を80°Cの高温オーブンに2時間入れます。
   注意:熱い物質を扱う際は耐熱性の手袋を着用してください
7. メスを使って、固まったポリマースラブをマスターモールドから慎重に剥がします。
8. コアパンチツール(例:直径1.2mm)を使って、ポリマースラブの指定されたチャネル端に入口と出口ポートを作成します。
9. ガラスカバースリップとポリマースラブの模様入り面を接着テープで拭き取ります。
   一時停止点:硬化・パンチ加工されたPDMSスラブは、プラズマ処理と接着の前に、室温で数週間保管できます。
10. ポリマースラブとガラスカバースリップの両方を、プラズマクリーナーで65Wの電力で室内空気下で60秒処理してください。
11. すぐにポリマーチャンネルの面をガラスカバーの処理面に合わせます。
12. 優しく押すと、永久的な閉じたマイクロ流体チャネルが形成されます。

2. 内皮細胞の調製とシーディング

1. 結合されたマイクロ流体チップを脱イオン水を入れたホウ素化ガラス瓶に入れ、121°C、15psiで20分間のオートクレーブ消毒を行います。
   注意:オートクレーブ時には、圧力を均等化しPDMSマイクロチャネルの変形を防ぐためにチップを水に浸してください。これにより、閉じ込められた気泡を除去し、その後の流体導入のためのチャネルの準備も整えます。
   一時停止点:滅菌されたマイクロ流体チップは、密閉ガラス瓶の室温で数週間安全に保管でき、細胞シーディングの際に必要になるまで保管できます。
2. 滅菌したチップを、リン酸バッファー生理食塩水(PBS)と低グルコースのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)を1:1の混合液で満たした60mmの培養皿に入れます。
3. 1 mLのシリンジを使って100 μg·^mL-1 フィブロネクチンをチャネルに注入し、37°Cで4時間培養します。
   注意:マイクロフルイディックチップは液体より低い位置に置くことを必ず確認してください。アダプターホースを注射器の針に接続し、ホースに液体を入れて液体のレベルより下に差し込み、インレットを接続してから注入し、気泡が入らないようにします。
4. 低グルコースDMEM(5.5mMグルコース)に24.5 mM D-マンニトールを加え、浸透圧を高めます。5 mM D-グルコースを高グルコースDMEM(25mM)に加え、最終30 mMグルコースに加えます。正常グルコース(NG)培養培地と高グルコース(HG)培養培地に、それぞれ20%の胎児用牛血清(FBS)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を補足します。
5. 37°Cの水浴で1×PBS、トリプシン、NG、HG培地を温めます。 培養皿からヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を90%の合流率で採取します。細胞を0.25%トリプシン-EDTA溶液で剥離し、37°Cで30秒培養します。採取した細胞数をカウントし、NG培地とHG培地でそれぞれ1×10⁶ cells/mLの濃度を調整します。
6. 1mLのシリンジを使い、マイクロフルイディックチップの入口ポートに細胞懸濁液100μLを注入します。対照群にはNG培地、実験群にはHG培地を使用します。マイクロ流体チップを37°Cの加湿インキュベーターに5%の_CO2 で48時間置きます。
   注意:細胞がさらに処理される前に少なくとも4時間は付着させてください。静的培養段階では振動性高血糖を刺激するために、2時間ごとに2つの培地を交互に手動で使います。細胞のグルコースを一晩5.5 mMのまま保ち、生体内の状況を模倣します(図1B)。

3. 動的刺激のセットアップ

1. 2つの100 mL貯蔵槽にそれぞれNGとHG培養培地を充填し、プログラム可能な圧力制御システムの対応チャネルに接続します。
2. リザーバー、2段階の三方向磁気弁、そしてシリコーンチューブでマイクロフルイディックチップを接続します。
3. PDMSチップの入口と出口ポートをチューブに接続するために、直径1.3mmの90°角度のステンレス製コネクターを使用します。
   注意:100 mLの貯蔵庫、シリコーンチューブ、ステンレス製コネクターは、事前に高圧・高温のオートクレーブで滅菌してください。
4. 目標PSS(τ)を達成するために必要な流量(Q)を計算します。式τ = (6μQ)/(wh²)を用い、粘度μ、wがチャネル幅、hがチャネル高さです。
5. 生理的PSSを目標設定します(τ = 10 ± 2 dyn·^cm-2, 1 Hz)。これは計算流量200 ± 40 μL·^min-1に対応します。
6. プログラム可能なエアポンプをプログラムして、PSSを維持するために正弦波関数を生成させます。バルブコントローラーを5分ごとにチャンネルを切り替え、動的刺激中に方形波のグルコース振動を発生させるようにプログラムします。
7. プログラム可能なポンプシステムを起動し、OGとPSSを合計30分間供給します。

4. 流場検証のためのマイクロPIV

1. 蛍光微粒子の体積濃度0.05%(1μm)を含むNGおよびHG培地を準備します。粒子が均等に分散し、集まりがないことを確認してください。
2. 逆形蛍光顕微鏡のステージに、細胞実験で使われているものと同じクリーンでセルフリーのマイクロフルイディックチップを設置します。
3. システム内のすべてのコンポーネントを接続します(図1C)。
   1. 圧力源を圧力コントローラーに接続してください。
   2. 圧力コントローラーをバルブコントローラーに接続し、バルブコントローラーはコンピュータと連携して圧力波形の自動制御を行います。
   3. 圧力コントローラーの出口をHGとNGのリザーバーに別々のチューブラインで接続します。
   4. 両方のリザーバーを3/2圧力バルブに接続し、プログラムされた振動グルコースプロトコルに従ってHGとNGメディアを切り替えます。
   5. 3/2圧力弁の出口をチューブでマイクロ流体チップの入口に接続します。
   6. マイクロフルイドチップの出口を廃棄物貯留槽に接続します。
   7. 実験全体を通じてライブセルイメージングのために、マイクロフルイディックチップを顕微鏡ステージに置きます。
      注: 流れを始める前に、すべてのチューブ接続部がしっかり固定され漏れがないことを確認してください。
4. 流れが安定した後、高速カメラ(ダブルフレームモードで15Hz動作)を作動させ、流れる微粒子の連続画像ペアを撮影します。各ペアの2フレーム間の正確な時間遅延(Δt)を80μsに設定します。
5. チャンネル内の関心地域(ROI)用の画像を撮影します。直線チャネル区間の中央(図2A)でROIを選択し、入口と出口から等距離に位置し、最終効果を避けて流量の代表性を保ちます。
6. 取得した画像ペアはPIV解析ソフトウェアで処理します。適応型マルチパスクロスコレレーションアルゴリズムを用い、初期の照会面積を64×64ピクセルから始め、最終的に16 × 16ピクセル、グリッドステップサイズ8×8ピクセルに仕上げ、2フレーム間の粒子の変位ベクトル(Δx)を決定します。
7. 各尋問領域の速度ベクトル(v)を式v = Δx / Δtで計算します。

5. データ取得

注:カルセインAM/ヨウ化プロピジウム(PI)キットおよび生細胞酸化ストレス蛍光プローブを用いて細胞の生存率と機能を定量化し、血糖変動による損傷を検証し、共刺激の効果を評価してください。

1. 細胞生存率
   1. 実験エンドポイントの製造指示に従ってCalcein-AM/PI作動溶液を準備します。
      注意: PIは既知の変異原であり、DNAに挿入される発がん性物質と疑われています。細心の注意を払って扱ってください。指定された安全な作業場内で手袋とハンドルを着用してください。
   2. PBSでチャンネルを一度洗い流し、Calcein-AM/PIの動作溶液をチャンネルに導入します。デバイスを37°Cで5%の_CO2 で暗闇で30分間孵化します。
   3. 10×対物レンズを備えた逆型蛍光顕微鏡で、染色細胞の蛍光画像を即座に撮影します。カルセインAMにはFITC(緑)フィルターを使い、PIにはTRITCまたはRhodamine(赤)フィルターを使いましょう。
2. 細胞内ROSを測定する
   1. 製造者が指定した濃度(5μM)でPBSで、生細胞酸化ストレス蛍光プローブ(材料 表参照)の作動溶液を準備します。
      注意: 蛍光プローブやその一般的な溶媒(DMSOなど)は有毒であり、皮膚を通じた有害物質の吸収を促進する可能性があります。指定された安全な作業場内で手袋とハンドルを着用してください。
   2. チャネルを3回PBSでフラッシュし、生細胞酸化ストレス蛍光プローブ溶液をチャネルに注入します。チップを37°Cで5%のCO2で暗闇で30分間孵化します。
   3. チャネルをPBSで3回フラッシュして、未結合プローブを取り除きます。20×の対物レンズを通して、極赤線フィルターセット(励起度640 nm、発光665 nm)を用いて蛍光画像を即座にキャプチャし、全グループの露出パラメータを全く同じに保ちます。
      注: 蛍光強度が上昇するとROSレベルが高いことを示します。

6. データ分析

一時停止点:すべての生蛍光画像および高速カメラ画像が取得され、ハードドライブに安全に保存された後、その後の画像処理、定量分析、統計比較は一時停止し、後で行うことができます。

1. 細胞生存率の定量化
   1. 取得したCalcein-AM(緑)およびPI(赤)画像をImageJ(材料 表参照)で開いてください。各チャンネルの閾値を手動で調整して蛍光信号と背景信号を区別します。細胞カウンター関数を使って蛍光細胞の数を数え、観察された細胞サイズに応じて最小細胞サイズを調整し、複数の視野で生きている(N個の_生存)細胞と死んだ(N個の_死んだ)細胞の数を数えます。
      注:NはカルセインAM陽性(緑色)細胞_の数、N死はPI陽性(赤色)細胞_{の数を示します。}
   2. 各実験条件ごとにスプレッドシートソフトを使って、生存細胞の割合(N_{live / (} N_live + N_Dead)×100%)を計算します。複数の視野における平均偏差と標準偏差を統計解析ソフトウェアを用いてグループ間の比較を行います。
2. 細胞内ROSを定量化する
   1. ImageJで好きな画像をドラッグしてください。顕微鏡のメタデータ(または既知の基準グリッド)を使ってピクセルサイズをキャリブレーションしてスケールを設定してください: 解析 |スケールを設定しましょう。
   2. 背景減算関数を用いて画像全体から非特異的な均一背景信号を除去します: プロセス | 背景を差し引く。
   3. 手動でしきい値スライダーを調整してセグメントと細胞内ROS信号を定義してください: 画像 |調整 |しきい値。閾値が設定されたら、 Analyze | 測定値を「 面積」と「平均」グレー値を選択します。観察セルサイズに基づいて最小セルサイズを設定し、セル単層ROI内で分割信号の平均強度を測定します: 解析 | 粒子を分析する。
   4. 各実験条件のROSレベルを、チップごとにランダムに選ばれた少なくとも3つの視野から導き出された測定値(例:平均強度)の平均として報告します。
3. 統計的比較の実施
   1. 定量的な結果(生存率パーセンテージおよびROS平均強度)をデータ分析およびグラフ作成ソフトウェア(材料 表参照)に入力します。
   2. 実験群と対照群を比較し、二者分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定し、その後Tukeyの事後検定を行い、有意水準p=0.05とします。ソフトウェアを使って解析を行い、標準偏差(SD)を表す誤差バー付きのプロットを生成します。

Results

マイクロ流体チャネル内のフローフィールドのマイクロPIV検証
図1D は、結合した代謝刺激および機械的刺激に対する内皮反応を調査するために用いられるマイクロ流体プラットフォームの概要を示しています。このシステムは、直流チャネルPDMSマイクロ流体チップと圧力駆動フロー制御モジュールを統合しており、OG条件と生理的PSSの適用を可能にします。プログラム可能なバルブスイッチング戦略が用いられ、NGとHG媒体間で周期的に交互に変化し、パルサタイルフロー波形はコンピュータ制御の圧力調整によって同期されました。

マイクロ流体システムの血行動態忠実度を検証するため、マイクロチャネル内の流れ特性をMicro-PIVを用いて定量的に解析しました。このROI内で測定された実際の流量は、プログラムされた入力波形に密接に沿った安定かつ再現可能な振動を示しました(図2B)。定量回...

Discussion

ここで述べるマイクロ流体システムは、OGとPSSが内皮細胞機能に与える統合的な影響を調査するための堅牢で生理学的に重要なプラットフォームを提供します。この手法の主な利点は、特定の微小環境内で機械的刺激と生化学的刺激を正確に制御・分離できる能力にあります。従来の静的培養では血行動態力学が欠如したり、細胞レベルのシ^{グナル伝達}をしばしば隠す動物モデルが4,17,18,19で、このプロトコルは流れパターンやグルコース濃度プロファイルの独立した調節を可能にします^20,21。代謝障害と血行動態力学の動的な相互作用を再現することで、このシステムは糖尿病の血管合併症の背後にある機械生物学的メカニズムを解明する独自の機...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	細胞解離
1 mL シリンジ	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	流体注入
60 mm 培養皿	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	細胞培養
90° 角度 ステンレス鋼コネクタ	Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd.	1.3 mm	アダプター密封装置
AutoCAD ソフトウェア	Autodesk	RRID:SCR_014981	コンピュータ支援設計ソフトウェア
ホウ素ガラス瓶	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	ダブルパス 100mL	リザーバー
Calcein-AM/PI Kit	Beyotime	byt-c2015	染色
細胞培養器	ESCO	Esco CelMate	細胞培養
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	染色
D-グルコース	Sigma Aldrich	47249	グルコース
D-マンニトール	Macklin	M813423	浸透圧バランス
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	PIV 解析ソフトウェア
胎児ウシ血清 (FBS)	Gibco	14190-094	培地
フィブロネクチン	Sigma Aldrich	F-2006	細胞接着
蛍光マイクロ粒子	Thermo Scientific	G0100	マイクロ PIV
ガラスカバースリップ	Citotest Scientific Co.,Ltd.	#1	マイクロ流体チップ
高グルコース DMEM	Solarbio	12100	培地
高速カメラ	Dantec Dynamics	FlowSense EO	マイクロ PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	画像処理ソフトウェア
反転蛍光顕微鏡	Olympus	IX73	細胞生存率
反転蛍光顕微鏡	Olympus	IX83	観察と撮影
低グルコース DMEM	Solarbio	31600	培地
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	データ分析とグラフ作成ソフトウェア
PDMS	Dow lnc.	184	マイクロ流体チップ
ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	培地
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	細胞培養
プラズマクリーナー	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	マイクロ流体チップ
プログラム可能な圧力制御システム	Elvesys	OB1 MK4	フロー制御
シリコーンチューブ	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
SU-8 マスターモールド	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	マイクロ流体チップ
バルブコントローラー	Elvesys	MUX Wire V3	フロー制御