Method Article

生理的パルサタイルせん断応力と振動性高血糖を組み合わせた内皮機能障害をモデル化するためのマイクロ流体システム

DOI:

10.3791/71037

⸱

May 12th, 2026

 ,  ,  , 
1Institute of Cardio-Cerebrovascular Medicine, Central Hospital of Dalian University of Technology, 2School of Mechanical Engineering, Dalian University of Technology, 3School of Biomedical Engineering, Faculty of Medicine, Dalian University of Technology, 4Key Laboratory of Integrated Circuit and Biomedical Electronic System, Dalian University of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、内皮細胞に同期振動性高血糖およびパルサタイルせん断応力を曝露するマイクロ流体システムを製作・運用するプロトコルを提示します。このアプローチは、糖尿病の内皮機能障害を研究するための生理学的に関連性の高い in vitroモデルを提供します。このプロトコルにより、酸化ストレスおよび内皮細胞応答の定量的測定が可能になります。

Abstract

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糖尿病血管合併症における内皮機能障害は、代謝障害、特に振動性グルコース(OG)と脈拍せん断ストレス(PSS)との複雑な相互作用を伴います。これらの要因は個別に調査されていますが、従来のモデルは静的な高血糖または単純化された層流に限定されており、糖尿病血管に見られる統合された時空間的結合を模倣する能力が不足しています。プログラム可能なマイクロ流体プラットフォームを活用することで、同期振動性高血糖と生理的PSSが内皮細胞に与える統合的影響を調査する貴重なプラットフォームを提供します。本プロトコルは、生理学的に関連した代謝および機械的結合条件下での内皮機能障害をモデル化することを目的としています。ポリジメチルシロキサン(PDMS)チップと圧力駆動制御システムを組み合わせることで、流れ波形やグルコース濃度プロファイルの正確かつ独立した変調が可能となります。システムの血行動態の忠実度はマイクロ粒子画像速度測定法(Micro-PIV)によって検証され、細胞応答は細胞内活性酸素種(ROS)レベルと細胞生存率の監視によって定量的に特徴付けられます。代表的な結果は、生理学的PSSがOGによる酸化損傷を効果的に減弱することを示しています。この効果は、細胞内ROSレベルの低下と、複合刺激条件下での細胞生存率の向上によって示されています。研究課題に応じて、せん断応力パターン、グルコース振動周波数、チャネル形状などのパラメータを調整できます。この方法は、メカノ生物学的経路のメカニズム的研究や糖尿病血管疾患の治療的介入のための薬物スクリーニングのための多用途ツールとして機能します。

Introduction

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内皮機能障害は、代謝障害と異常な血行動態の両方によって引き起こされる糖尿病血管合併症の重要な初期イベントです1,2。OGレベルは持続的な高血糖だけでなく、内皮細胞における酸化ストレスや炎症シグナル伝達の強力な誘発因子としてますます認識されており、血管損傷や恒常性の障害を引き起こす3,4,5。同時に、血行動態のせん断応力は内皮表現型の主要な決定要因であり、生理的運動条件下でのPSSは一酸化窒素の産生、抗酸化防御、血管保護を促進する6,7,8。したがって、振動性高血糖と血行動態刺激の統合的な影響を理解することは、内皮機能障害のメカニズムを解明するために不可欠です。

従来のin vitroモデルは、静的な高血糖条件や単純化された層流に依存することが多いため、生体内で存在する代謝と機械的な手がかりの複雑で動的な相互作用を再現

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Protocol

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倫理声明:

注:本プロトコルで使用されるすべての試薬、装置、ソフトウェアは 材料表に記載されています。

1. マイクロフルイディックチップ製造

  1. コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使ってマイクロ流体チップの構造(W x L x H = 2 mm x 30 mm x 0.1 mm、 図1A)を設計し、商業会社を通じてSU-8マスターモールドを製作します。
  2. PDMS硬化剤とプレポリマーを重量比10:1の比率で清潔なミキシングカップに入れ、5分間激しく手動でかき混ぜます。
  3. 混合中に閉じ込められた気泡を除去するため、最低15分間、-0.08MPa以下の真空チャンバーに入れてください。
    注意:気泡の除去を迅速化し溢れを防ぐために、チャンバーを一時的に大気圧まで排気して大きな気泡を破裂させ、その後すぐに再び真空をかけてください。この排気サイクルを2〜3回繰り返し、バルク混合気が完全に透明になり、巨視的な気泡がなくなるまで続けます。
  4. PDMSをガラスのペトリ皿に置いたウェハーに注ぎます。
  5. PDMSは鋳造中にできた気泡を除去する....

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Results

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マイクロ流体チャネル内のフローフィールドのマイクロPIV検証
図1D は、結合した代謝刺激および機械的刺激に対する内皮反応を調査するために用いられるマイクロ流体プラットフォームの概要を示しています。このシステムは、直流チャネルPDMSマイクロ流体チップと圧力駆動フロー制御モジュールを統合しており、OG条件と生理的PSSの適用を可能にします。プログラム可能なバルブスイッチング戦略が用いられ、NGとHG媒体間で周期的に交互に変化し、パルサタイルフロー波形はコンピュータ制御の圧力調整によって同期されました。

マイクロ流体システムの血行動態忠実度を検証するため、マイクロチャネル内の流れ特性をMicro-PIVを用いて定量的に解析しました。このROI内で測定された実際の流量は、プログラムされた入力波形に密接に沿った安定かつ再現可能な振動を示しました(図2B)。定量回.......

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Discussion

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ここで述べるマイクロ流体システムは、OGとPSSが内皮細胞機能に与える統合的な影響を調査するための堅牢で生理学的に重要なプラットフォームを提供します。この手法の主な利点は、特定の微小環境内で機械的刺激と生化学的刺激を正確に制御・分離できる能力にあります。従来の静的培養では血行動態力学が欠如したり、細胞レベルのシグナル伝達をしばしば隠す動物モデルが4,17,18,19で、このプロトコルは流れパターンやグルコース濃度プロファイルの独立した調節を可能にします20,21。代謝障害と血行動態力学の動的な相互作用を再現することで、このシステムは糖尿病の血管合併症の背後にある機械生物学的メカニズムを解明する独自の機.......

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Disclosures

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著者たちは利益相反を一切認めていない。

Acknowledgements

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この研究は中国国家自然科学基金(助成金番号12372304、12172081)および中央大学基礎研究基金(DUT25YG272)の支援を受けました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% トリプシン-EDTANESTバイオテクノロジー株式会社211052細胞解離
1mLシリンジ上海正邦医科学有限公司1mLインジェクトフルード
60mm培養皿NESTバイオテクノロジー株式会社705001細胞培養
90°角度付きステンレス鋼コネクター洛陽美耶貿易有限公司1.3mmアダプター密封装置
AutoCADソフトウェアオートデスクリッド:SCR_014981コンピュータ支援設計ソフトウェア
ホウ素化ガラス瓶湖南アイデット科学機器有限公司ダブルパス100mL貯水池
カルセイン-AM/PIキットビヨタイムBYT-C2015染色
セルインキュベーターESCOエスコ・セルマテ細胞培養
CellROX ディープレッドインビトロジェンC10422染色
D-グルコースシグマ・オルドリッチ47249グルコース
D-マンニトールマックリンM813423浸透圧のバランス
ダイナミックスタジオダンテック・ダイナミクスV8.6PIV解析ソフトウェア
胎児用牛血清(FBS)ギブコ14190-094メディア
フィブロネクチンシグマ・オルドリッチF-2006細胞接着
蛍光微小粒子サーモ・サイエンティフィックG0100マイクロPIV
ガラスカバースリップシトテスト・サイエンティフィック株式会社#1マイクロ流体チップ
高グルコースDMEMソーラービオ12100メディア
高速カメラダンテック・ダイナミクスFlowSense EOマイクロPIV
イメージJNIHリッド:SCR_003070画像処理ソフトウェア
逆転蛍光顕微鏡オリンポスIX73細胞生存率
逆転蛍光顕微鏡オリンポスIX83観察と獲得
低血糖DMEMソーラービオ31600メディア
起源オリジンラボリッド:SCR_014212データ分析およびグラフ作成ソフトウェア
PDMSダウ社。184マイクロ流体チップ
ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)NESTバイオテクノロジー株式会社211092メディア
リン酸塩バッファー生理食塩水(PBS)NESTバイオテクノロジー株式会社211031細胞培養
プラズマクリーナー嘉潤万峰科技有限公司PC-6Dマイクロ流体チップ
プログラム可能な圧力制御システムエルヴェシスOB1 MK4流量制御
シリコーンチューブ南京潤澤流体制御設備有限公司964101mm×3mm
SU-8マスターモールド博鰲生物グループ株式会社該当なしマイクロ流体チップ
バルブコントローラーエルヴェシスMUXワイヤーV3流量制御

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., Dellsperger, K. C., Zhang, C. The link between metabolic abnormalities and endothelial dysfunction in type 2 diabetes: An update. Basic Research in Cardiology. 107 (1), 237(2011).
  2. Yang, D. R., Wang, M. Y., Zhang, C. L., Wang, Y.

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Endothelial DysfunctionMicrofluidic SystemPulsatile Shear StressOscillatory HyperglycemiaDiabetic Vascular DiseasePolydimethylsiloxane ChipPressure Driven ControlMicro Particle Image VelocimetryReactive Oxygen SpeciesCell Viability
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