方法論記事

多孔質媒体中の金属酸化物の微生物沈殿を調査するためのマイクロ流体プラットフォーム

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DOI：

10.3791/71047

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2026年6月12日

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

この記事について

サマリー

このプロトコルは、マンガン酸化物鉱物の微生物沈殿を研究するためのマイクロ流体システムを提示します。バイオミネラル形成は、光学顕微鏡と画像解析を用いて 現地 で測定されます。 この手法は、多孔質環境における他の特徴的な色を持つ生物性鉱物の沈殿調査にも応用可能です。

要約

微生物は一般的に土壌、堆積物、その他の環境に関わる多孔質媒体中に金属酸化物ナノ粒子を沈殿させます。しかし、マンガン(Mn)および鉄(Fe)酸化物の生成および反応性は、物理的に複雑な環境下で依然として十分に特徴づけられていません。実験室システムでは多孔質培地を基質として取り込むこともできますが、破壊的サンプリングが必要であり、孔隙スケール解析には容易ではありません。多孔質培地の動的でありながらアクセス困難な性質は、微生物媒介による鉱物沈殿を現 地 かつリアルタイムで分解する能力を必要とします。このギャップを埋めるために、モデル孔空間内の金属酸化物の微生物沈殿を評価するためのマイクロ流体プラットフォームが開発されました。このプラットフォームは、Mn酸化細菌 Pseudomonas putida GB-1で検証されています。バイオフィルムの発生およびそれに伴うMn酸化物の沈殿は、タイムラプスカラーブライトフィールド顕微鏡による連続流下で可視化されます。その後、画像減算アルゴリズムとエンドポイント質量測定を組み合わせて、酸化物Mnの降水率を推定します。この手法は、金属酸化物の微生物沈殿が物理的・化学的条件の変化に応じてどのように変化するかを体系的に検証するツールを提供します。

概要

金属酸化物鉱物は生地球化学的循環において重要な役割を果たします。マンガン(Mn)および鉄(Fe)酸化物は、環中性pHで負に帯電し、2,3,4,5,6,7,8を容易にソルブ化し、根圏および地下層における微量栄養素の利用可能性と汚染物質の移動性を調整します。これらの鉱物は有機物の安定性と分解に影響を与えます。9,10,11,12が植物や土壌微生物による炭素の吸収を決定します。人工的システム(例:水処理フィルターや人工湿地)では、金属酸化物の沈殿が直接利用され、MnまたはFeの除去および共存汚染物質13,14,15,16,17の除去に利用されます。これらの金属酸化物は、黄土から濃い茶色、黒色まで特徴的な色で識別できます18,19。

金属酸化物の沈殿は、バイオミネラル化20,21,22と呼ばれる過程で微生物によって一般的に促進されます。多数のMn酸化細菌や菌類は、多銅酸化酵素や過酸化酵素を合成し、好気条件下でMn(II)からMn(III)およびMn(IV)への電子移動を触媒し、ビルネサイト様Mn(III, IV)酸化鉱物2,23,24を沈殿させます。さらに、多様なFe酸化細菌は、酸素が制限された中性または酸性環境で酵素的にFe(II)をFe(III)に酸化し、フェリヒドライトや磁鉄鉱25,26,27,28を含むFe(II, III)(オキシヒドール)酸化物を生成します。これらの生物由来鉱物は細胞表面に隣接して沈殿し、細胞外ポリマー、鞘、その他の細胞構造に蓄積して微生物-鉱物集合体2,23,25,27,29,30を形成します。

複雑な環境でMnおよびFeのバイオミネラル化が広く存在しているにもかかわらず、孔規模の洞察は不足しています。孔隙空間は構造的に不均一であり、優先流体の流れと不均一な反応物輸送を示し、生地球化学反応の分布を決定します。31,32,33,34,35。さらに、微生物活動は局所的な地球化学的勾配を生み出し、生物鉱化を促進したり制限したりする可能性があり、孔流体化学の変動(pH、溶存酸素、酸化還元電位など)は鉱物沈殿を促進または溶解を促進することがある34,35。MnおよびFeの生物鉱化の研究は、通常、よく混合されたバッチ条件30,36,37,38,39,40またはカラム41,42,43,44に依存し、酸化速度論の定量や生物鉱物沈殿の特性評価を行います。しかし、バッチ実験は多孔質システムに固有の空間的異質性を欠いています。充填された粒状媒体を含むカラムは関連する物理的構造を提供しますが、静的な時間点での破壊サンプリングが必要であり、実験の進行が止まり、無攪拌の孔スケール観測が妨げられるため、その有用性は限定的です。したがって、多孔質媒体中の金属酸化物の微生物沈殿を調査するためには新たな実験的アプローチが必要です。

マイクロ流体システムは、生地球化学反応を現場およびリアルタイムで研究するためのツールです。マイクロ流体リアクターは、自然または理想化された多孔質媒体を再現可能かつカスタマイズ可能な形状で、迅速かつ低コストで製造可能です。その結果生まれた装置は光学的に透明であり、バイオフィルム形成46,47,48,49、ホットスポット発生50,51、非生物金属沈殿52,53、方解石バイオミネラル化34,54,55,56などの孔間プロセスの非破壊的な可視化と定量化を可能にしています.さらに、マイクロ流体システムは金属濃度、溶存酸素の有無、流体流量などの境界条件を制御・体系的に調整することを可能にします。最後に、原子炉基板の材料に応じて、X線、ラマン、赤外分光法57を用いて微生物・鉱物・流体相互作用の直接測定が可能です。このようなマイクロ流体ベースのプラットフォームの開発により、金属酸化物の微生物沈殿を研究することは、多孔質環境における炭素、栄養素、汚染物質の循環を駆動するMnまたはFe鉱物相の形成と反応性に関する新しい研究の道を提供します。

本研究では、ミノチュラルの生鉱化をケーススタディとして用いて、動的多孔質環境下での金属酸化物の微生物沈殿を定量化しています。以下のプロトコルは、成長段階でMn(II)をMn(III, IV)に酸化することが知られているモデル細菌であるPseudomonas putida GB-1を用いたマイクロ流体リアクターの製造と接種方法を示します(58,59)。圧力ベースの流量制御システムを用いて、栄養豊富な成長培地と最小限の塩溶液を順次注入し、それぞれバイオフィルム形成を促進し、ミノルノキシド沈殿を誘導します。マイクロ流体孔空間の高解像度カラーブライトフィールド画像を一定時間間隔で収集し、P. putida GB-1バイオフィルムと蓄積するMn酸化物との色のコントラストを捉えます。各実験終了時に、原子炉内のすべてのMn酸化物が分解され、帰納結合型プラズマ質量分析法(ICP-MS)で総質量が測定されます。Mn酸化物の降水率は、これらの終端質量測定値を画像減算アルゴリズムと統合することで時間の関数として推定されます。このワークフローは、さまざまな環境条件下で他の生物や金属酸化物沈殿プロセスの調査に容易に適応できます。

プロトコル

注:このプロトコルはユーザーの背景知識や利用可能な計測に関していくつかの仮定をしています。まず、ユーザーはクリーンルームにアクセスでき、マイクロ流体型を製造するためのフォトリソグラフィー手順に精通しているか、または市販型を購入する必要があります。次に、無菌技術の使用、ストック溶液の準備、プレートのストリークなど、基本的な微生物学的手法に慣れておく必要があります。また、オートクレーブ、マイクロ遠心分離機、シェーカーインキュベーター、質量分析計へのアクセスも必要です。最後に、ユーザーは光学顕微鏡と画像解析に熟達していることが求められます。

1. マイクロ流体原子炉の製造および組み立て

注:本プロトコルで使用されるマイクロ流体リアクターは、Wangら55から適用した砂粒形状のAutoCADで設計されています。各型は6つのレプリケートチャネルを生成し、15 mm×10 mmの孔隙間、0.41の孔隙率、2.3 μLの孔積を持ちます。プラズマ処理を除き、低塵環境を維持するためにリアクターは層流キャビネット内で製造されます。

  1. マイクロ流体チャネルをポリジメチルシロキサン(PDMS)でソフトリソグラフィーを用いて鋳造します。
    1. プラスチックカップで、エラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で計量します(ここではそれぞれ25gと2.5gです)。
    2. プラスチックナイフでエラストマーベースと硬化剤を10分間よく混ぜます。
    3. 真空乾燥器で1時間、カップ内のPDMSを脱ガスして気泡を除去します。
    4. PDMSを型に注ぎ、30分間脱ガスして残留空気を取り除きます。
    5. 型をホットプレートに置き、95°Cで3時間硬化させます。
    6. 硬化・冷却が完了したら、メスでPDMSを切り取り、型から剥がします。
    7. カッティングマットの上で、6つのマイクロ流体チャネルをカミソリの刃で切り開き、各チャネルの縁に2〜3mmの隙間を残します。各チャネルの入口と出口の穴を生検パンチで開けます。
    8. 各マイクロフルイディックチャネルの両側に透明テープの帯を貼り、ほこりの蓄積を防ぎ、100mmのペトリ皿に保管してください。
  2. 実験の前日に、最終的なマイクロ流体炉を空気プラズマで組み立てます。
    1. 1つのマイクロ流体チャネルから透明テープを取り除き、PDMSとガラスカバーのスリップを70%エタノールですすいで、圧縮窒素で乾燥させます。
      注意:エタノールは可燃性です。安全データシートに従って取り扱い、保管してください。
    2. マイクロ流体チャネルとカバーのスリップをプラズマクリーナーの表向きに置きます。チャンバーを1分間真空させ、その後1分間(18W、~0.5torr)プラズマを適用します。
    3. プラズマクリーナーからマイクロフルイディックチャネルとカバースリップを取り出し、カバースリップをPDMSに置き、優しく叩いて接合を確実にします。組み立てた原子炉は100mmペトリ皿に一晩保管します。

2. マイクロ流体流量制御システム

注:Elveflowのモジュラーシステムは、圧力と流量の妨げを最小限に抑えて連続流体注入を促進するために使用されています。システムコンポーネントには、空気圧縮機、流量コントローラー、分配弁、流量センサー、流体リザーバーラック(15 mL円錐管用)、およびElveflowスマートインターフェース(ESI)ソフトウェア(図1)が含まれます。シリンジポンプなどの他の流量制御システムは、注入モードまたは引き出しモードで使用可能で、各注入液ごとに専用の注射器やリザーバーを備え、低デッドボリュームスプリッターバルブを備えて、単一のチューブラインを通じて順次注入を容易にします。ただし、シリンジポンプの使用は、バイオフィルムを外す可能性のある圧力変動を最小限に抑えるために注意が必要です。

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図1:流量制御システムとマイクロ流体原子炉の形状。 この実験システムは、フローコントローラー(1)空気圧チューブを介して(2)流体リザーバーラックに接続、(3)成長媒体(GMMn)および塩溶液(SSMn)の逐次注入を提供する分配バルブ(4)フローセンサー(5)で、リアルタイムのフィードバックと流量調整を行うフローコントローラー(6)流体抵抗を提供する小径のPEEKチューブ(7)マイクロ流体リアクター上流のバブルトラップ(8)で構成されています。システムの回路図はスケールしません。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

  1. メーカーの指示に従ってすべてのハードウェアをセットアップし、キャリブレーションしてください。
    注:流体リザーバーラック、分配バルブ、流量センサーは、実験温度を30°Cに保つために特注の顕微鏡インキュベーター内に設置されています。
  2. エアコンプレッサーの圧力調整器を3バールに設定し、空気圧ポリウレタンチューブで空気圧縮機の出口をフローコントローラーの入口に接続します。
  3. フローコントローラーの出口に疎水フィルターを取り付けて流体の逆流を防ぎ、その後、マニホールドとバーブアダプターを使って空気圧ポリエーテルポリウレタンチューブで流体リザーバーラックの2つの入口ポートに接続します。
  4. 流体リザーバーラック、分配バルブ、流量センサーは、特に記載がない限り1/16インチ外径チューブにはフランジェレス継手を使用して以下の通りチュービングで接続します。
    1. 流体リザーバーラックの2つの出口ポートを、配水バルブの最初の2つの入口ポートに、80cmの1/32インチ内径(ID)ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブで接続します。
    2. 配水バルブの出口ポートを流量センサーの入口ポートに、直径500μmのPTFEチューブ15cmとアダプターフィッティングで接続します。
    3. 63.5μm内径60cmのポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブを、アダプタフィッティングを使ってフローセンサーの出口ポートに接続します。
      注意:異なる流量を必要とする実験では、流量安定性を確保するために十分な流体抵抗を提供するためにPEEKチューブの長さを必要に応じて調整してください。
    4. PEEKチューブをユニオンフィッティングを使って10cmの500μm内径PTFEチューブに接続します。
    5. PTFEチューブを、PTFE膜フィルター(孔径~10μm)を備えたマイクロ流体バブルトラップの入口ポートに接続します。
    6. バブルトラップの出口ポートに75cmの直径200μmのPTFEチューブを取り付け、効果的な気泡除去のための逆圧を作ります。このチューブはマイクロ流体リアクターの入口ホールに接続されます。
  5. 実験の前に、すべてのチューブとハードウェアを接続した状態で、システム容積の3倍(1本あたり7.0μL·min-1で1本あたり約4時間)の漂白剤溶液を洗浄し、その後同じ期間無菌の超純水を洗浄して流量制御システムを滅菌します。
  6. 実験の合間には、流量制御システムを以下のように清掃します。
    1. 配水バルブと流量センサーは、100%イソプロパノールと滅菌超純水で洗浄し、残留物や沈殿物の蓄積を防ぎます。
      注意:イソプロパノールは可燃性です。安全データシートに従って取り扱い、保管してください。
    2. バブルトラップをオートクレーブ消毒してください。
    3. 各実験後にバブルトラップ膜フィルターと直径200μmのPTFEチューブを交換し、詰まり(膜フィルター)や細菌の定着(チューブ)を防ぎます。

3. 実験媒体と溶液

  1. 液体ルリアブロス(LB、ミラーズ製剤)培地を、2.5% LB粉末を121°Cの超純水に20分間オートクレートして調製します。LB寒天プレートの場合、2.5%LB粉末と1.5%寒天を121°Cの超純水で20分間オートクレーブし、その後100mmのペトリ皿(1皿あたり~20mL)に注ぎ、固まるまで冷ます。
  2. アメリカ化学会(ACS)または細菌級試薬を超純水で調製したフィルター滅菌済みのストック溶液から、以下のそれぞれをそれぞれ30mLずつ作ります。塩溶液および成長培地組成はGehinら59から適用しています。
    1. Mn(II)(SS0)なしの塩溶液を準備します:0.4 mM CaCl 2.2H 2O、0.25 mM MgSO4.7H 2O、0.25 mM Na2HPO4.2H 2O、0.15 mM KH2PO4、Fe(III)-EDTA 1:2(20 μM FeCl3.6H 2O および 40 μM EDTA、pH 6.5 に調整、1M NaOH 付き)、 10 mM HEPESバッファー(pH 7.0に調整し、1M NaOHを含み)、5 mM(NH4)2SO4、および微量金属(40 nM CuSO4.5H 2O、273 nM ZnSO4.7H 2O、84 nM CoCl2·6H2O、53.7 nM Na2MoO4·2H2O)を無菌超純水に使用します。
    2. Mn(II)(SSMn)を含む塩溶液を準備します:SS0 と同じで、50 μM MnCl2·4H2Oを加えます。
    3. Mn(II)(GM0)なしの成長培地を準備する:SS0 と同じで1.5 g·L-1 酵母抽出物と1.5g·L-1 カサミノ酸を添加しました。
    4. Mn(II)(GMMn)で成長培地を準備する:GM0 と同じで、50 μM MnCl2·4H2Oを加えます。
      注意:塩溶液や成長培地には健康および環境の両方に危険な金属が含まれています。安全データシートに従って取り扱い、保管してください。
  3. マイクロフルイディック反応器内でのMn酸化物の消化のために、40 mMのシュウ酸二水和物と2%硝酸を含む超純水溶液を準備します。
    注意:シュウ酸二水和物と硝酸は腐食性であり、硝酸は強い酸化剤です。安全データシートに従って取り扱い、保管してください。
  4. ICP-MSサンプルの希釈のために、超純水に1%の硝酸溶液を準備します。

4. 細菌培養

注:細菌培養は、ベンゼンバーナーを用いて作業台上で無菌技術で行われます。特に記載がない限り、素材は無菌状態です。潜伏期間はP. putida GB-1に特有であり、他の微生物に合わせて調整する必要がある場合があります。

  1. -80°Cのストックから、LB寒天プレートにP . putida GB-1をストリークします。培地を約20時間、30°Cで培養し、細菌コロニーの成長を促します。
  2. 実験の前夜、50mLの円錐形チューブにLB培地10mlを加え、1つのプレートコロニーで接種します。LBの前培養をシェーカーインキュベーターで30°C、180rpmで16時間孵育し、定常段階に到達させます。
  3. 16時間の培養後、1.5mLのマイクロ遠心分離管にLBの前培養液1mlを分離し、8,000 x gの圧力で1分間遠心分離して細菌をペレットします。
  4. アリコートを3回洗浄し、上清液を捨て、細胞ペレットを1 mLのSS0に再懸浮させ、8,000 x g で1分間遠心分離します。最終ペレットを1 mLのSS0に再懸浮させます。
  5. 非滅菌キュベットの洗浄セル懸濁液の光学密度(OD600)をセル密度計で測定します。この段階でP. putida GB-1の予想OD600は3.6〜3.8であり、SS0の希釈率は少なくとも5倍必要です。
  6. 50mLのエルレンマイヤーフラスコに、洗浄細胞懸濁液を注入したGM0200を初発OD600(0.01)に接種します。30°C、180rpmで6時間培養し、指数関数の中間段階に到達します。

5. バイオミネラリゼーション実験

  1. 実験当日の朝、流れ制御システムを準備しろ。
    1. 顕微鏡インキュベーターを30°Cに予熱します。
    2. GMマンとSSマンを10mLを2本の15mL円錐形チューブに注ぎ、チューブを流体リザーバーラックに接続します。システム体積の約3倍(7.0μL·min-1で~4時間)SSをフラッシュし、その後同じ時間GMMnをフラッシュします。
  2. 中期指数培養接種後5時間で準備済みマイクロ流体リアクターを飽和させます。
    注:リアクターの飽和および接種は、ベンゼンバーナーを用いて作業台上で無菌技術で行われます。特に記載がない限り、素材は無菌状態です。
    1. 原子炉を真空乾燥器で20分間脱ガスします。
    2. 反応器が脱ガス中である間、3 mLのプラスチックシリンジに1〜2 mLのSS0 を抽出し、鈍い先端の針と20cmの0.02インチ内径タイゴンチューブを接続します。チューブが完全に飽和するまでシリンジプランジャーを押します。
    3. 乾燥装置から原子炉を取り外し、角度のあるピンセットでチューブを原子炉の出口穴に取り付け、注射器で手動で原子炉を飽和させ、原子炉入口に液滴が形成されるまで加熱します。
    4. 原子炉の入口に直径0.02インチのタイゴンチューブ20cmを取り付けます。すべての気泡が除去されるまで(200〜300μL)SSMnをリアクターに供給し続けます。
  3. 原子炉接種装置を準備し、マイクロ流体原子炉に接種してください。
    1. 接種から6時間後にシェーカーインキュベーターから中間指数培養液を取り出し、OD600を測定します。この段階での期待OD600 は1.6〜1.8なので、SS0 の4倍希釈が推奨されます。
    2. 2 mLマイクロ遠心分離機管内で、2 mLのマイクロ遠心分離管で2 mLのSSMn で中間指数培養液を希釈し、初期OD600 0.005にします。チューブを何度か反転させて混ぜます。
    3. 原子炉入口チューブをマイクロ遠心分離機チューブ内に設置し、液体の滴が接種装置に接触するようにして、チューブ内の空気侵入を防ぎます。マイクロ遠心分離機のチューブを部分的に閉じ、蓋をテープで固定して汚染を防ぎます。
    4. 4〜5 mLのSSMn を5 mLのガラス密封シリンジに抽出してバレルを湿らせ、その後0.5 mLがシリンジ内に残るまで投与します。注射器を注射ポンプに注入します。
    5. プラスチックの注射器から針を抜き、ガラス製の注射器に取り付けます。針のハブに空気が閉じ込められないように注意してください。
    6. シリンジポンプで反応器に接種し、8.33 μL·min-1 (~70孔体積)の流量で接種物を20分間反応器内に抽出します。
    7. 接種後はシリンジポンプを止め、細菌が1時間静止して付着するのを待ちます。
    8. 1時間後にシリンジをポンプから外しますが、出口チューブには接続したままにしてください。
  4. 接種されたマイクロ流体リアクターを流量制御システムに接続します。
    1. 反応器と注射器を作業台から顕微鏡インキュベーターに移します。
    2. 顕微鏡段階では、原子炉から入口チューブを取り外します。
    3. シリンジプランジャーを優しく押して、原子炉の入口穴に滴を作ります。
    4. PTFEチューブを流量制御システムから直角(チューブの端から約1cm)に手動で曲げ、PDMS表面に垂直に接点を合わせることで、側面の力や原子炉入口への空気の侵入を最小限に抑えます。
    5. PTFEチューブの端を1%ポリエチレングリコールジアクレート(PEG-DA)の溶液に浸し、外側の疎水性チューブを湿らせます。PTFEチューブの端にGMミュロン の滴を確実にし、チューブを原子炉の入口穴に接続してください。
    6. 注射器を切り離し、出口チューブを非滅菌の5mLマイクロ遠心分離機管に入れて原子炉の排水液を回収します。
    7. 流量制御システムのソフトウェアで流量を1.33 μL·min-1 に設定します。バイオフィルム形成を促進するためにGMミュロン を15時間(~500孔体積)供給し、その後SSミネラル を28.5時間(~1,000孔体積)供給してMn生鉱化を誘導するプログラムを設定します。
  5. マイクロ流体リアクターを顕微鏡段挿入部に取り付けます。
    注:顕微鏡ステージインサートに取り付けられた特注の紫外線C(UVC)照射システムは、マイクロ流体孔隙空間外での不要な細菌の増殖や鉱物沈殿を抑制するために使用されます(図2)。この設計はRamosら60 から応用されており、自動プログラムで制御可能です。詳細はFadelyら61 を参照してください。
    1. 安定性を確保するために試料フレームをリアクターの下に設置し、フレームとリアクターを段インサート内にしっかりと取り付けて完全に固定します。
    2. PTFEチューブをステージインサートにテープで固定し、チューブが原子炉入口から外れないようにします。
    3. UVCアームは入口側の孔隙の端から3mm、出口側で2mmの距離に合わせ、紫外線やバイオフィルムの散乱を最小限に抑えましょう。
      注意:適切なUVC整列により、原子炉入口領域でのバイオマス蓄積はほとんど、あるいは全くありません(図3A)。UVCアームが孔隙の入口端から離れすぎている(図3B)や照射が欠如している(図3C)は、孔隙空間の上流に鉱物沈殿をもたらします。
    4. 原子炉照射プログラムを立ててください。反応器の入口および出口領域をt=0時間で5分間処理し、接種時に沈着した細菌を不活化し、その後出口領域をt=17.5時間で5分間処理して残ったバイオフィルムを不活化します。

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図2:マイクロ流体原子炉用のカスタム製造紫外線C(UVC)照射システム。 (A)顕微鏡ステージインサートに取り付けられたシステムのトップビューは、ポーズ可能なアーム(青)とUVC発光ダイオード(LED)アレイ(黄色の長方形)と、サンプルフレーム(小さな灰色の長方形)に取り付けられたマイクロフルイドリアクターを示しています。(B)システムの下部図。ポーズ可能なアームに埋め込まれたUVC LED(タン色の四角い)が示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:UVC照射がマイクロ流体リアクター入口領域に与える影響。(A)5分間のUVC処理をt=0hで行ったリアクター入口領域は、不要なバイオフィルムを完全に除去するための適切な整列を示しました。(B)不適切に整列されたUVCアレイの原子炉入口領域で、入口ホールおよび孔隙空間外に残留バイオフィルムが残り、Mn酸化物が上流に沈殿しました。(C)UVC処理がない原子炉入口領域で、広範なバイオフィルム成長と鉱物沈殿が発生します。グレーの陰影が毛孔の空間を区切っています。スケールバーは2mmです。 この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

6. 光学タイムラプス顕微鏡

注:デジタルカメラ(1画角あたり2304×2304ピクセル)、白色光エンジン、4倍対物レンズ(1.62μm·ピクセル-1)、およびNIS Elementsソフトウェアを搭載したニコンTi2エクリプス逆型エピ蛍光顕微鏡がカラー明視野イメージングに使用されます。カラーイメージングが可能な他の光学顕微鏡も適しています。カラーイメージングの利用により、低ミノル素酸化物質量に対する感度が向上します。タイムラプスの自動化ができない場合は、ユーザーが手動で画像を収集し、時系列として後処理することができます。

  1. 高品質な画像を得るために、以下のアライメントおよび補正手順を実行します:
    1. 均一な照明を確保するために、メーカーの指示に従ってケーラーのアライメントを手動で調整してください。
    2. 画像の過彩度や過彩度を防ぐために明界照明を最適化してください(Fusion Pad > Color > Auto Brightness 、 Fusion Pad > Color > Auto White)。
      注意:既にバイオフィルムやミノルノキズルを含む原子炉では明界照明を一度だけ最適化し、その後は同じ露光時間と色のバランスをすべての実験に適用して一貫した照明を得るのが最善です。ここでは、赤が97.58%、緑が44.76%、青が100%の5msの照明が使われています。
    3. マイクロ流体空間の縫い目画像を取得する際のキルティングアーティファクトを防ぐために、シェーディング補正(Acquire > Shading Correction Panel)を適用してください。
  2. 縫い付けた画像の中心座標を設定してください(ND取得> XY)。
  3. ステッチ画像スキャン領域(こちらは5×4の視野角)を設定し、1%のオーバーラップ(ND取得>大型画像)を適用します。
  4. 4倍対物レンズ(ND取得>λ)でカラーブライトフィールド画像の取得を設定してください。
  5. 画像撮影の周波数を、1時間15時間(成長期)、0.5時間間隔で28.5時間(鉱化期)(ND取得>時間)を設定し、タイムラプスプログラムを実行します。
    注:成長および石灰化の期間はP . putida GB-1に特有であり、他の微生物に応じて必要に応じて調整可能です。
  6. 実験が完了したら、タグ付き画像ファイルフォーマット(TIFF)(マクロパネル>画像をTIFFにエクスポート)として画像をエクスポートします。

7. 酸の消化とMn質量測定

注:ICP-MSはマイクロ流体炉内に保持されるMn質量を測定するために使われますが、光発光分光器(ICP-OES)などの他の機器も使用可能です。分析機器がない場合、酸で分解されたサンプルは商業検査機関に送られることがあります。

  1. 実験終了時に、顕微鏡ステージインサートから原子炉を取り外し、入口と出口のチューブを切断します。
  2. 1.5mLの酸溶液を5mLのガラス気密シリンジ(接種用シリンジとは別)に抽出します。鈍い先端の針と直径1/32インチのPTFEチューブ20cmを注射器に取り付け、酸を手動で滴り出してチューブの先端に滴ができるまで続けます。
  3. 作業台の上でシリンジをシリンジポンプに積み込み、チューブを原子炉入口に繋ぎます。気泡が閉じ込められないように注意してください。気泡が酸溶液が全孔に浸透しないように注意してください。1/32インチ内径のPTFEチューブ30cmを原子炉出口穴に接続し、出口チューブの端を2mLのマイクロ遠心分離機チューブに入れます。
  4. 酸溶液を10分間、流量100 μL·min-1でリアクターに注入します。
  5. 酸溶液を注入した後、鈍い先端の針をガラス注射器から切り離します。10mLのプラスチックシリンジに空気を入れ、鈍い先端の針に接続し、手動でシリンジ内の空気をすべて抽出して、リアクターとチューブから残った酸を2mLのマイクロ遠心分離機管に排出します。
    注:空気注入後、少量の酸溶液が孔隙内に閉じ込められることがありますが、注入された総体積に比べて無視できる程度です。低孔隙性の形状を扱うユーザーは、接続不良の孔から流体膜や残留酸を除去するために、追加の空気量を洗浄することを検討できます。
  6. ICP-MSの校正範囲に従って、消化サンプルを1%硝酸で希釈します。ここで、15mLの円錐形チューブに100倍希釈液(総容量5 mL)を準備します。
  7. 薄めたサンプル中のMn濃度をICP-MSで測定します。測定濃度を希釈係数と総試料体積で補正し、反応器内に保持されるMn質量を算出します。

8. 画像解析

注:MATLABは画像解析用の組み込み機能がテキストに含まれているため推奨されます。しかし、ImageJやPythonの画像解析ライブラリなど、他のツールも同様の解析を行うことができます。画像分析の主要なステップは 図4に示されています。すべての画像解析スクリプトは補足ファイル(補足ファイル1、 補足ファイル2、 補足ファイル3)として提供されます。

figure-protocol-4
図4:Mn酸化物析出物を分離するための画像引き算ワークフロー。 タイムラプスカラーの明視野画像から、基準画像(tref)(1)が特定され、以降のすべてのタイムポイント画像から基底の定常相バイオフィルムの強度を除去しました(tn)(2)すべてのTNの二値マスク(3)を作成し、tref(4)および対応するTN(5)を掛け合わせてバイオフィルム-バイオミネラルの範囲を捉えました。最後に、マスクドtnをマスクtrefから差し引いた(6)。得られる強度補正行列は、各ピクセルでの酸化物の蓄積による強度(a.u.)の減少を定量化します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

  1. AutoCADからエクスポートしたマイクロ流体孔空間ジオメトリの高解像度TIFFをワークスペースに読み込み、グレインマスク (imread)として使用します。
  2. 色の明視野画像をまっすぐにしてレジスタを合わせて、グレインマスクを効果的に適用してください。
    1. 最初のタイムポイント画像(t = 0 h)のレジストレーションバイナリを生成します。
      1. カラーのブライトフィールドTIFFをワークスペースに読み込みます(imread)。
      2. 画像を孔隙の大きさより少し大きくトリミング(削り取り)してください。
      3. 粒子境界の解像度を向上させるために画像をシャープ化(シャープ化)してください。
      4. 暗い特徴を優先する適応閾値を用いて画像を二語化します(RGB2Gray、前景色の極性=「暗」で感度を必要に応じて調整する adaptthresh 、 imbinarize、 補足)。
      5. 得られる正勢二重の粒子を埋めて立体特徴を作ります(「穴」を指定して埋めます )。すべての穀物が充填されているわけではないことに注意してください。
      6. 必要に応じてレジストリのバイナリをエロデロして背景ノイズを除去し、その後グレインエッジで失われたピクセルを補うために拡大します(イエロド、 イミレイト)。
    2. スケール不変特徴変換(SIFT)のレジストレーションアルゴリズムを用いて、レジストレーションバイナリをグレインマスクに整列させるために必要な変換行列を計算します(detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d 、transform type = "affine")。
    3. この変換行列をレジストレーション2進数と最初のタイムポイント画像に適用し、グレインマスクと重ねてフィット(imwarp、imshowpair)を評価します。
    4. SIFTの登録後もアライメント不良が続く場合は、必要に応じてローカル登録(cpselect、 fitgeotform2d 、変換タイプ="lwm"、 imwarp)を適用します。
    5. マトリックスエッジのレジストレーションアーティファクトを除去するために、登録画像とグレインマスクを必要に応じてトリミングし、その後孔空間の寸法(15 mm x 10 mm)(編集・縮小)にリサイズします。
    6. すべてのカラーブライトフィールド画像をループして同じレジストレーション(イムワープ)を適用します。
  3. バイオフィルムが初めて静止相に入るとき(図4のパネル1参照)を視覚的に識別し、継続的な動きや成長の欠如(ここでt=18.5時間)と判断します。
  4. 各タイムポイント画像(tn、 図4のパネル2)(rgb2gray、 adaptthresh (前景極性=「暗」、感度は必要に応じて調整、 非二化、 補不補)をバイナライズし、バイオフィルム・バイオミネラル集合体=1、粒子および空洞=0にします。各タイムポイントマスクに反結晶粒マスク(補欠)を掛けて残留粒界を除去します。
  5. tnを対応するタイムポイントマスク(図4のパネル3)で対象のバイオフィルム・バイオミネラル領域を分離し(図4のパネル5)、さらにtを各タイムポイントマスクで掛けて同じ領域を分離します(図4のパネル4)。
  6. マスクされたt参照からすべてのマスキングtnを差し引き、各時刻におけるMn酸化物蓄積に関連するピクセル強度の減少を定量化します(imsubtract)。その後、合成強度補正行列(rgb2gray、図4のパネル6)に変換します。
  7. 孔空間(a.u.)にわたる鉱物の空間分布を評価するには、各強度補正行列の列(次元=1の和 )に沿った和を算出します。
  8. Mn酸化物の時間経過による沈殿率(μg·h-1)を推定するには:
    1. 各強度補正行列(次 元 = 「all」)を合計して、各時刻における補正強度の合計を定量化します。
    2. 各時点での補正強度を最終時点の補正強度で割り、最終時点=1となり、それ以降の値はすべて分数になります。ICP-MSで測定したMn質量を掛けてμgに再スケールします。
    3. 時間に関する微分は、連続した時間点間の質量増加(μg)を画像間の時間間隔(0.5時間)で割ることで取る。

結果

このプロトコルは、バイオフィルム形成およびMnバイオミネラル化の時空間解析イメージングのための実験的プラットフォームを提供します。カラーブライトフィールド画像により、 P. putida GB-1バイオフィルムは、Mn酸化物沈殿開始前のt = 18.5時間でマイクロ流体孔空間全体に均一に分布していることが示されました(図5A)。その後、Mn酸化物はMn(II)源に最も近い孔隙の入口側に優先的に蓄積されました(図5B)。参照画像とその後の画像時点の差により、Mn酸化物沈殿物が全体の画像強度に孤立的に寄与していることが明らかになり(図5C)、鉱物蓄積における原子炉スケール勾配の定量化が可能となりました(図5D)。バイオフィルムスケールでは、この画像減算法は、バイオフィルム表面にミネラル酸化物が徐々に沈殿し、間隙流体と接触したバイオフィルムの縁に鉱物が蓄積する様子を捉えました(図6)。

さらに、このプロトコルは画像の引き算およびICP-MS測定からMn酸化物沈殿の動力学を推定するワークフローを提供します。三重マイクロ流体炉は最終実験時間で4.29 ± 0.22 μgの原子力を含んでいました。以前、シンクロトロンを用いたミノロケモノ質量測定を用いて、原子炉内容物の酸分解が検証され、誤差が18%未満であることが確認されました61。したがって、強度補正行列はこの最終質量に再スケールされました。その結果、Mn酸化物の推定降水率は非単調的で、t=19.5hからt=21hの間に急激に増加し、0.29±0.04μg·h-1 でピークを迎え、t=43.5hまで徐々に減速しました(図7)。この速度計算では、光学顕微鏡の分解能を下回るナノ粒子状Mn酸化物や、実験期間中の輸送による酸化物質量の損失は考慮されていないことに注意が必要です。これは最小限と予想されます。このアプローチは、利用可能な顕微鏡技術を活用し、バイオミネラル化の動態における時間的傾向を半定量的に評価します。

figure-results-1
図5:バイオフィルムおよびMn酸化物の反応器規模分布。 (A) 定常相開始時のマイクロ流体孔空間内の P. putida GB-1バイオフィルムのカラー明視野画像(t = 18.5 h, tref)。(B)ミノオキシドのカラー明視野画像は、最終実験時間(t = 43.5時間)にP . putida GB-1バイオフィルム上およびその周辺に沈殿します。(C)最終実験時点(t = 43.5時間)における鉱物蓄積の強度補正マトリックスで、粒子は灰色、孔は白色で示されています。スケールバーは1mm(D)です。孔空間の入口(左)から出口(右側)までの総補正強度の一次元空間分布(t = 43.5 h)。実線は入口から出口までの孔空間に沿った1 mmの移動平均で、三重実験で平均化したものを表し、陰影は標準偏差を表しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-2
図6:バイオフィルムスケールの酸化物Mn蓄積。 (A)代表的な P. putida GB-1バイオフィルムのカラーブライトフィールド画像を選択してください。マンガン酸化物は、まずバイオフィルム表面の灰色から茶色への色変化として検出されました(t=20hおよびt=21hで表示)、その後バイオフィルムの縁に濃い茶色の沈殿が蓄積して現れました(t=33h、t=43hで示されました)。(B) 鉱物蓄積の強度補正マトリックスで、粒子は濃い灰色、孔は白色、下層バイオフィルムは淡い灰色。スケールバーは150μmです。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図7:時間経過によるミノノキス化物降水率の推定。 速度(μg·h-1)は、各時点での補正強度をICP-MSで測定したエンドポイントのMn質量に再スケールし、その後時間に関する微分を取ることで定量化されました。マーカーは三重実験の平均を表し、陰影は標準偏差を表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足ファイル1:Step1_ImageRegistration.m.このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル2:Step2_ImageSubtraction.m.このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル3:Step3_Figures.m.このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

この実験プラットフォームは、高忠実度データの取得を妨げるアーティファクトのない多孔質環境における生地球化学プロセスの時空間的ダイナミクスを調査する独自の機会を提供します。この手法は特に、特徴的な黄土色、茶色、黒色の鉱物沈殿を生成するMnおよびFeの生物鉱化に適しており、光学顕微鏡や画像解析で容易に区分できます。Mn生鉱化をケーススタディとして用いることで、鉱物沈殿のパターンや速度を高い空間的・時間的分解 能で評価することが可能です。

このプロトコルのいくつかの側面により、生物地球化学的変換の再現可能な測定値の収集が可能となりました。まず、低デッドボリュームのシーケンシャルインジェクションバルブを使用することで、マイクロ流体間隙内のバイオフィルムを乱すことなく複数の流体を用いた実験が可能になりました。この構成により、注入液の切り替え時に生じる圧力サージが剥がれたり、シリンジポンプなど他の機器で発生する可能性のあるバイオフィルムの変位を防ぐことで、初期のバイオフィルムの空間分布が維持されます。このコンポーネントは、居住する微生物に課される地球化学的条件をカスタマイズする柔軟性も提供します。最後に、初期バイオフィルム分布を保持するため、異なるバイオフィルム形態やバイオマス量がMn酸化物の分布や沈殿速度にどのように影響するかを体系的に検証できます。

第二に、マイクロ流体孔隙空間における気泡の形成と侵入を軽減することで、Mnバイオミネル化の環境的に重要な時間スケールを捉える数日間の実験が可能となりました。気泡は室温62,63以上の長時間の実験で一般的かつしばしば避けられない問題であり、個々の孔を破片化・塞ぎ、流体の流れを迂回させ、反応の進行を妨げることがあります。孔隙空間での気泡の捕捉を防ぐため、接種前に原子炉は完全に飽和状態にしていました。流量制御システムに気泡が入るのを最小限に抑えるため、顕微鏡インキュベーターは実験のかなり前に30°Cに設定され、接種反応器を取り付ける前に複数の量の流入溶液を洗浄しました。この工程により、チューブや継手から閉じ込められた空気が除去され、実験中の流体の放出リスクが最小限に抑えられました。また、残留気泡を捕捉するためのバブルトラップも流れ制御システムに組み込まれており、トラップ出口には200μm内径PTFEチューブが取り付けられ、抵抗を増やし気泡除去効率を高めました。最後に、インフルエントチューブと原子炉入口ホールの界面での空気の閉じ込めや漏れを防ぐため、すべての接続はチューブの両端と穴に流体の滴を用いて行われ、疎水性PTFEチューブには1%のPEG-DAがコーティングされ、挿入チューブの端部は実験中ずっとPDMS表面に対して垂直に保たれました。

第三に、実験プラットフォームに特注のUVC照射システムを組み込むことで、明確な地球化学的境界条件を維持し、マイクロ流体孔隙空間内のMn生体鉱化を再現性的に制限しました。パイロット実験では、原子炉入口領域の余分なバイオフィルムが孔隙空間の上流にMn酸化物を沈殿させ、下流のMn(II)の利用を制限していることが示されました。ノーフロー沈降期間後に原子炉入口および出口領域を適切に照射し、最初に沈着した細菌のバイオフィルム発生を防いでいます。この初期UVC処理後の持続的な一方向流体の流れにより、原子炉入口部の再定着を防ぎました。静止相開始および可視化ミノノキシド沈殿の前にt=17.5時間で原子炉出口領域を照射することで、孔隙空間下流での鉱物蓄積量を最小限に抑えました。これにより、ICP-MSで解析・測定されたMn質量と色の明視野画像データを直接比較することが可能となりました。

画像減算とエンドポイント質量測定の組み合わせにより、ミノノオキシド沈殿の動態を評価するための半定量的手法が提供 されました。 しかし、非常に高い鉱物密度では、暗い色に対するカメラ感度が制限されるため、ピクセル強度は酸化物の質量に比例しなくなることに注意が必要です。この非線形挙動の評価は、定められた時間点で酸を消化し、消化質量と最終実験時点でスケールした元の質量を比較することで改善できます。鉱物質量の正確な定量が必要な場合は、既知の強度と質量を持つ鉱物試料を用いてキャリブレーション曲線を作成することができ、これは以前Fadelyら61で実証されています。またはシンクロトロンを用いたX線蛍光による直接測定が可能です。

ここで紹介するマイクロ流体プラットフォームは、幅広い環境条件下での生鉱化プロセスを調査するために応用可能です。代表的な実験はP. putida GB-1に最適化されましたが、このセットアップは、MnやFeの濃度、炭素源、共存金属の有無、流量、温度、微生物コンソーシアムの有無など、さまざまな影響付き溶液化学物質を体系的に試験するためにも利用できます。Fe酸化細菌に適した特定の酸性またはサブオキシ性条件は、影響するpHを下げるか、PDMSを酸素不透過性ポリマーでコーティングすることで模擬できます。生物ミネラル化に対する微生物制御の洞察は、リポーター遺伝子融合株の実装とその結果生じる光学蛍光の追跡によって得られます。マイクロ流体リアクターは、粒子のサイズ分布、形状、多孔度を変えたり、PDMSを粘土粒子や天然有機物の表面電荷を模倣するように機能化することで、多様な多孔質環境をシミュレートするために再設計できます。追加の改良(例:ガラス基質をプラスチックに置き換えるなど)により、金属酸化状態、鉱物学、オルガンミネラル結合、二次金属の吸収や共沈殿の直接的な分光測定をサポートできます。最後に、この実験プラットフォームは、光学的特性が十分に異なって画像セグメンテーションが可能であれば、他の金属バイオミネラル(リン酸塩、炭酸塩、硫化物など)の沈殿を調査するために拡張可能です。したがって、このプロトコルは関連する多孔質環境における生体石灰化および微生物・鉱物・流体相互作用を包括的に調査するための枠組みを提供します。

開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

このプロジェクトは、米国国立科学財団バイオメディエイテッド・バイオインスパイアド地盤工学センター(ERC-1449501)、スイス国立科学財団(200021_188546)、および米国国立科学財団(MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849)によって支援されました。この研究の一部はUCデービス・ナノ・マイクロ製造センター(CNM2)で実施されました。顕微鏡インキュベーターとUVC照射システムの設計と製造に協力してくださったスティーブン・ルセロ氏とUCデービス工科工場に感謝いたします。また、マイクロ流体炉の製造に用いられる多孔質媒体形状を提供してくれたYuze Wang博士とJason DeJong博士、そしてフォトリソグラフィーおよびソフトリソグラフィーに関する有益な議論や研修を提供してくれたArunima Bhattacharjee博士、Noah Goshi博士、Gregory Girardi博士、キム・ヘヒョン博士にも感謝します。最後に、実験デザインと画像解析に関する貴重な議論をいただいたGaitan Gehin博士、Tonya Kuhl博士、Filippo Miele博士、Charles Graddy博士に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アダプター継手（Elveflow、6-40から1/4-28）Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08フローセンサーとフランジレス継手間のインターフェースに使用。
アガー（Fisher BioReagents）Fisher ScientificBP9744凍結した菌株を塗布するプレートの作成に使用。
エアコンプレッサー（Jun-Air）ElveflowKCP-110フローコントローラーに圧力を加えるのに使用。
硫酸アンモニウム（（NH4）2SO4、CAS：7783-20-2）Sigma-AldrichA4915実験用培地や溶液に使用。
アングルピンセットTDI International7-SAマイクロ流体リアクターにチューブを取り付けるのに使用。
AutoCADソフトウェアAutodesk--マイクロ流体リアクターのジオメトリを設計するのに使用。
オートクレーブSteris--材料や液体を滅菌するのに使用。
バランスMettler ToledoME2002TPDMSエラストマーベースと硬化剤の重量測定に使用。
バルブ付きアダプター（1/4-28スウィベルから3/32インチバルブ付き）ElveflowKFI-06ポリエーテルポリウレタンチューブをマニホールドと流体リザーバーラックに接続するのに使用。
生検パンチ（Rapid-Core、1.2mm径）Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25PDMSマイクロ流体チャネルにインレット/アウトレットホールをパンチするのに使用。
漂白剤（Chlorox）ULINES-19719フロー制御システムを滅菌するために使用。超純水で1％に希釈。
鈍針（Jensen Global、21ゲージ）QSourceJG21-10HPX-J004チューブをシリンジに接続するのに使用。30分間オートクレーブで滅菌。
ブンゼンバーナーHumboldtH-5970無菌実験ワークスペースを維持するのに使用。
塩化カルシウム二水和物（CaCl2・2H2O、Fisher Chemical、CAS：10035-04-8）Fisher ScientificC79実験用培地や溶液に使用。
カサミノ酸（Fisher BioReagents、アシッドカゼインペプトン）Fisher ScientificBP1424実験用培地に使用。
細胞密度計（WPA Biowave CO8000）Avantor490005-906細菌培養のOD600を測定するのに使用。
透明テープ（Scotch Magic）ULINES-10223PDMSマイクロ流体チャネルに埃が付着するのを防ぐのに使用。
塩化コバルト（II）六水和物（CoCl2・6H2O、CAS：7791-13-1）Sigma-Aldrich255599実験用培地や溶液に使用。
圧縮窒素AirgasNIUHP300マイクロ流体リアクター部品を乾燥するのに使用。
コーニカルチューブ（Falcon、15mL容量、ポリプロピレン）Fisher Scientific14-959-49B流入溶液やICP-MSサンプルに使用。事前に滅菌済み。
コーニカルチューブ（Falcon、50mL容量、ポリプロピレン）Fisher Scientific14-432-22LB前培養に使用。事前に滅菌済み。
硫酸銅（II）五水和物（CuSO4・5H2O、CAS：7758-99-8）Sigma-AldrichC8027実験用培地や溶液に使用。
カッティングマットULINES-18543PDMSマイクロ流体チャネルを切り取り、インレット/アウトレットホールをパンチするのに使用。
キュベット（Fisherbrand、1.5mL容量、ポリスチレン）Fisher Scientific14-955-127細菌培養のOD600を測定するのに使用。
デジタルカメラ（Hamamatsu ORCA-Fusion）Nikon77054115マイクロ流体実験の時間経過カラーブライトフィールドイメージングに使用。
分配バルブ（MUX）ElveflowMUX-D-12複数の流体を順番に注入するのに使用。
Elveflow Smart Interface（ESI）ソフトウェアElveflow--フローコントローラーとフローセンサー間の流量/圧力フィードバックを制御し、分配バルブの切り替えを行うのに使用。
エルレンマイヤーフラスコ（Fisherbrand、50mL容量）Fisher ScientificFB50050中期的培養に使用。30分間オートクレーブで滅菌。
エタノール（Fisher Chemical、試薬アルコール、90％純度、CAS：64-17-5）Fisher ScientificA962P-4リアクター製造用にPDMSとカバースリップを洗浄するのに使用。超純水で70％に希釈。
エチレンジアミン四酢酸（EDTA、CAS：60-00-4）Sigma-AldrichEDS実験用培地や溶液に使用。
フランジレス継手（1/4-28から1/16インチODチューブ用）ElveflowKFI-17チューブをElveflowハードウェアコンポーネントに接続するのに使用。キットにはフェルールとねじ込みナットが含まれています。
フローコントローラー（OB1 MK3+）ElveflowOB1-2000制御された流体の注入のための流量/圧力フィードバックを提供するのに使用。
フローセンサー（MFS2）ElveflowMFS-D-2フローコントローラーからの圧力フィードバックを使用して、マイクロ流体実験のための安定したフローを維持するのに使用。
流体リザーバーラックElveflowKPT-4S流入流体に圧力を加えるのに使用。15mL Falconコーニカルチューブと互換性があります。
ガラスカバースリップ（1.42インチx 2.36インチ、#1厚さ）Ted Pella260460-100マイクロ流体リアクターの基板として、PDMSチャネルにプラズマ接合。
ガラスガス密閉シリンジ（5mL容量、Luer-Lock）Hamilton81520リアクター接種や酸消化

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