マウス卵母細胞の体外成熟、受精、着床前胚の培養

サマリー

このプロトコルは、マウス卵母細胞の in vitro 成熟、 in vitro 受精、そしてその後胚培養を胚嚢胞段階まで扱う手順を記述しています。

要約

マウス卵母細胞 のin vitro 成熟と体 外 受精およびその後の胚培養の組み合わせにより、特定の条件下で着床前胚の生成が可能になります。これらの手技は、卵母細胞の成熟、受精、早期胚発生の生物学的機能や分子メカニズムの研究を促進します。しかし、このアプローチの成功は卵母細胞と精子の慎重な取り扱い、適切な培養条件、そして各段階での正確な発達進行の評価に依存しています。ここでは、マウス卵巣から未成熟の積絡-卵母細胞複合体(COC)を分離する方法、卵子の in vitro 成熟、 in vitro 受精、胚胚のblastocyst段階までのin vitro 培養方法を説明します。これらの手順には、培地と培養皿の準備と平衡、卵巣剥離後のCOCの単離・選択、精子の採取とキャパシテメント、標準化された条件下での授精、そしてその後の胚の培養による発生評価が含まれます。発生進行は、雄・雌の前核形成、2細胞段階への切断、胚盤胞形成などの形態学的基準を用いて評価されます。このプロトコルは卵母細胞の成熟や母体因子機能の研究に統合でき、哺乳類生殖生物学の基礎研究に貴重なツールを提供します。

概要

卵母細胞の質と発生能力を理解することは、受精の成功とその後の胚発生に不可欠です ^1,2.卵母細胞の成熟には、核成熟時の正確な染色体分離だけでなく、細胞細胞の再分布や母体mRNAやタンパク質の蓄積を含む細胞質の成熟も必要^です。初期胚の発生は母体から提供されるmRNAやタンパク質に依存し、母体内の卵母細胞貯蔵は着床前の発達を支えます。しかし、哺乳類胚発生の多くの母体調節因子の同一性と機能は完全には解明されていません。したがって、卵母細胞の成熟、受精、胚発生のメカニズムを明らかにするために、さらなる体系的研究が必要です。

マウスは着床前胚の発生を調査するために広く使われているモデルシステムです。体 外 成熟(IVM)とは、卵巣から未成熟卵母細胞を採取し、制御された^{実験室条件下}で成熟させる過程を指します。その後、 体外 受精(IVF)により成熟卵母細胞をキャパシテーションされた精子と共培養し、早期胚発生研究のための受精卵を生成します。しかし、in vivo成熟卵母細胞を用いた従来のIVFと比較して、IVM由来卵母細胞は成熟率や受精率が低く、発生能力が低下することが多い⁶.これらの制限は主に 、in vitro 培養条件下での核成熟と細胞質成熟の非同期に起因しています。さらに、マウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の安定性はIVM中のpHや温度の変化に敏感であり、紡錘体の乱れが成熟停止に寄与する可能性があります⁷。その結果、IVM由来卵母細胞の能力低下は依然として大きな障壁であり、発生的および機構的研究における効率的な胚産を制限しています。

マウスの着床前胚は、 in vivo由来の接合子を採取し、in vitro(IVC)で培養することでも取得できます。生 体内で採集された卵管由来の接合子は、受精後の事象に焦点を当てた実験の比較的同期した出発点を提供します⁸。しかし、卵母細胞の成熟や母体因子の蓄積は、 in vivo受精前に起こっています。したがって、 in vivo由来の接合子は、成熟条件や母体貯蔵を実験的に操作して、その後の胚発生への影響を評価するのが難しくなります⁴。したがって、IVMおよびIVFプロトコルの最適化と、厳格な品質管理(例:温度、pH、取り扱い慣行の厳格な管理)を備えた標準化された操作手順の採用が、手順に関する変動を最小限に抑え、卵母細胞および胚の発生能力を保護するために不可欠です。

ここでは、培地調製、COCの分離と選択、IVMおよびIVF手技、体 外 胚培養(図1)を詳述するIVM–IVF–IVCプロトコルについて説明します。プロトコルには、第一極体(PB1)の押し出、雄・雌前核(2PN)の形成、2細胞切断、胚盤胞形成など、日常的な品質管理のための実用的かつ段階ごとのチェックポイントが含まれています。このプロトコルは、特定の条件下で着床前胚の再現性かつ効率的な生成を可能にし、発生学的研究、培養最適化、そして発生生物学および生殖生物学における後続的な応用を支援します。

プロトコル

すべての動物実験は中国の西北農夫大学の施設動物ケア・利用委員会(許可番号:20230503)によって承認されました。

1. 動物の飼育

1. 野生型の雌のC57BL/6と雄のDBA/2マウスを入手し、特定の病原体フリー(SPF)環境で、12時間の明暗サイクル、温度20–22°C、湿度55%±10%で飼育します。繁殖用の食事と水は 自由に提供してください。オスのマウスは1匹のケージで飼い始めます。

2. メディアの準備

1. 50 IU/mLのPMSG作動液を製製するには、5,000 IUの妊婦用血清ゴナドトロピン(PMSG)を100 mLの無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)に溶かします。
   注意:溶液を1mLの使い捨て分に分割し、–20°Cで保存してください。 使用する直前に、各アリコートを室温で解凍してください。
2. IVM培養培地を準備するには、 表1 に記載された成分を100mLのメディウム199(M199)ベース培地に加えます。pHを7.3〜7.4に調整し、0.22μmフィルターを通して滅菌培地のボトルに送り込みます。ボトルには「IVM」とイニシャル、製造日、賞味期限を記入し、最大1か月間4°Cで保存します。
3. 0.1%(w/v)のヒアルロンダーゼ溶液を調製するには、10 mgのヒアルロンダーゼを10 mLのM2培地に溶かします。
   注意:使用前に1 mLの使い捨てアリコートで保存し、使用前に37°Cまで温めてください。

3. 料理の準備(図2)

注:IVM、IVF、IVCドロップの数は、COCおよび胚の予想数に応じて調整してください。IVMおよびIVFでは100 μLドロップあたり20〜30個のCOC、胚培養では20〜30個の胚を用います。

1. 適切な数の35mm卵母細胞採取皿を用意し、それぞれ2mLのM2培地に0.2 mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を補足します。卵巣穿刺とCOC採取には1皿(女性2人につき1皿ずつ)を使い、もう1皿はCOCの洗浄に使います。使用前に食器を37°Cまで予温してください。
2. IVM料理を用意しましょう。
   1. 60mmの皿に、100μLのIVM培地を5滴準備して洗い(皿に「IVMウォッシュ」とラベル付け)。
   2. 別の60mm皿で、熟成のために100μLのIVM培地を複数滴準備します(皿に「IVM」とラベル付けしてください)。
   3. 滴を覆うのに十分なミネラルオイルを慎重に加え、卵母細胞採取を始める前に、5%_CO2 インキュベーターで少なくとも2時間、37°Cで食器を均等に保ちます。
3. 体外受精の料理を用意しましょう。
   1. 60mmの皿で、300μLの前平衡胚培養培地を1滴または2滴準備し、精子放出とキャパシテーション(「精子キャパシテーション」とラベル付け)を用意します。
      注:2回目の容量滴は、最初の滴で精子の運動性が不足している場合、新たな精巣上体精子サンプルを採取してキャパシテーションする必要がある場合、または受精前に精子濃度を調整する必要がある場合のための予備として準備されます。
   2. 洗浄用に100μLの前平衡培養培地を5滴ずつ入れた60mmの別々の皿を2皿準備します(皿は「IVFウォッシュ」と表記)。
      注意:受精前にIVM成熟したCOCを洗浄するには1つの「IVFウォッシュ」皿を使い、もう1つの「IVFウォッシュ」皿は共抱卵後に推定受精卵を洗浄し、積雲細胞や残留精子を除去してください。
   3. 別の60mm皿で、100μLの前平衡胚培養培地を複数滴準備し、受精(「IVF」とラベル付け)を用意します。
      注:精子のキャパシテーションと受精の両方に、精子の準備と受精の一貫した条件を維持するために、プレ平衡胚培養培地が使用されます。
   4. 滴を覆うのに十分なミネラルオイルを慎重に加え、5%_CO2 インキュベーターで37°Cで少なくとも12時間平衡させてから精子キャパシテーション手順を開始します。
4. IVC料理を用意しましょう。
   1. 60mm皿に、胚を洗浄するための100μLの前平衡胚培養培地を5滴準備します(皿を「IVCウォッシュ」とラベル付け)。
   2. 別の60mm皿で、胚培養用の100μLの前平衡胚培養培地を複数滴準備します(皿を「IVC」とラベル付けしてください)。
   3. 滴を覆うのに十分なミネラルオイルを慎重に加え、胚培養を始める前に、5%_CO2 インキュベーターで37°Cで少なくとも12時間バランスを取ってください。

4. 卵巣採取

1. 8〜10週齢の雌C57BL/6マウスに腹膜内PMSG10IUを投与します。
2. PMSG注射から48時間後、頸椎脱臼によってマウスを安楽死させ、仰向けにします。腹部に70%エタノールをスプレーして毛を濡らし、腹腔に入らないようにします。
3. 細かい解離用のハサミを使い、下腹部に小さな皮膚切開をし、手袋をした手で優しく皮膚を開けて腹膜を露出させます。
4. 腹膜を開けて腸を優しく横に動かします。子宮角を見つけて卵巣の方へ向かいます。腎臓近くの卵巣を特定し、通常は脂肪パッドで囲まれています。
5. 細かい解離ハサミを使って卵巣と子宮角を切り離し、余分な結合組織や脂肪を切り取ります。
6. 直ちに卵巣をIBMXを補給した予温M2培地に移します。反対側の卵巣を採取し、同じ皿に移す手順を繰り返します。
7. 皿を立体顕微鏡下に置き、卵胞穿刺とCOC採取を進めます。

5. COCの収集と培養

1. 立体顕微鏡下で、無菌注射器の針で目に見える蚊毛胞を優しく刺し、M2培地中のCOCを放出します。
   注:マウスGV期の卵母細胞を採取する際は、卵巣表面の目に見える大きな尾部卵胞を優先的に刺します。これらは通常、膨らみがあり半透明で、明確な胃部腔を持ちます。
2. 細かく引き出されたガラス製パスツールピペットを使い、放出されたCOCを回収し、IBMXを補給した予温されたM2培地を含むクリーンな35mm皿に移します。
3. 必要に応じて、35mm皿のきれいな部分に連続移送して洗浄し、剥離した顆粒状細胞や組織の破片を除去し、各移送時に残渣を残します(図3)。
   注意:次のステップ^9,10では、3層以上の緻密なキュムラス細胞層と均一な顆粒状細胞質を持ち、空隙のないCOCのみを使用してください。除去されたGV卵母細胞および部分的に積雲に包まれたGV卵母細胞はこのプロトコルから除外されます。実験条件下では、メスマウス1匹あたり平均26個の未成熟COCが得られました。
4. ゴミ除去後、COCをIVM洗浄皿に移し、IVM洗浄媒体の100μL滴を5滴ずつ順次移送して洗浄します。
   注意:転送中は、ドロップ間の交差汚染を防ぐためにキャリーオーバーボリュームを最小限にしてください。
5. 洗浄したCOCを100μLのIVM培地(1滴あたり20〜30COC)に移し、37°Cで5%_CO2 で14時間培養します。
   注意:COCを最小限の遅延でIVM培地に収集、洗浄、移送し、発達の可能性を維持してください。
6. (任意)IVM後、COCを1 mg/mLのヒアルロンダーゼで短時間培養し、マイクロピペットで優しくピペットを繰り返しして、キュムラス細胞を完全に除去します。
   注意:ヒアルロンダーゼの曝露は最大3分以内に制限してください。長時間の曝露は卵母細胞を損傷する恐れがあります。
7. (任意)脱毛した卵母細胞を加熱したステージで新鮮なM2培地で洗浄し、その後立体顕微鏡で卵母細胞の成熟を評価します。
8. (任意)第一極体が押し出された卵母細胞は成熟し、中期II期(MII)段階にあると考えられます。成熟率を、第一極体が押し出された卵母細胞の数を培養した卵母細胞の総数で割ったものとして計算します。
   注:ステップ5.6–5.8は、指定評価コホートを剥離してIVM後の卵母細胞成熟を評価するために用いられます。これらのステップは、直接IVFに進むCOCには必要ありません。

6. 精子採取と調製

注:この節では新鮮な精子の収集と能力化について説明します。受精前に、新たに放出された精子は37°Cの前平衡胚培養培地で1時間培養し、キャパシテーションを促す必要があります。

1. 成熟した雄のDBA/2マウス(生後10〜16週)を安楽死させ、尾部の上体を除去し、脂肪、血液、組織液をできるだけ避けます(図4)。
2. 各雄については、尾部エピジジミドを300μLの前平衡G-IVF培地に移し、精子の放出とキャパシテーションを行います。
3. 鉗子で尾部を固定し、滅菌注射器で尾部を5〜7箇所切り込み、組織を優しく絞って濃縮した精子を放出します。
   注意:精子の運動性を評価し、大多数の精子が進行的運動(PR)を示す場合のみ進行し、非進行的運動性(NP)や運動停止を示す場合のみ^{進行してください。}
4. 精子のキャパシテーションを促すために、37°Cで5%のCO₂に1時間培養します。

7. 体外 受精

1. IVMを14時間行った後、100μLのIVFウォッシュ培地を5滴ずつ順次移送してCOCを洗浄し、その後洗浄したCOCをIVF人工授精用のドロップに移します(100μL滴あたり20〜30COC)。
2. 受精前にCOCを含む受精皿を37°C、5%_CO2 で30分間プレインキュベートしてください。
3. キャパシテーション後、ヘモサイトメーターを使って精子濃度を測定します。
4. 精子濃度に基づいて必要な接種量を計算し、各IVFドロップに容量を付与した精子を加え、最終濃度は4 × 10⁵ –1 × 10⁶ sperm/mLにします。
   注意:精子追加後は、各受精ドロップに運動性精子が存在するか確認してください。
5. COCと精子を含む体外受精皿は、5%CO₂インキュベーターで37°Cで4〜6時間培養します。

8. 胚培養

1. 4〜6時間の培養後、卵母細胞よりわずかに大きい内径の細かく引き抜いたガラス製パスツールピペットを使い、推定受精卵を最小限の体で吸引し、IVF洗浄滴に移します。
2. 推定受精卵を5滴のIVF洗浄滴で順次移し、各滴内に優しくピペットで洗浄して余分な精子やゴミを除去します(図5)。
3. 洗浄された推定受精卵をIVC洗浄皿に移し、予温胚培養培地の洗浄液5滴で順次移送して洗い、IVF培地の持ち越しを最小限に抑えます。
4. 推定受精卵を胚培養培地の培養滴に置き、37°Cで5%CO₂(100μL滴あたり20〜30個の胚)で培養します。
5. 受精後6〜8時間で、立体顕微鏡で雄前核と雌核の有無を評価し、極体が一方のみで前核が見えない卵母細胞は廃棄します。
6. 受精後24時間で、2細胞胚の数を数え、2細胞発生率を(2細胞胚/受精卵母細胞)として計算します。
7. 数えた後、未切断胚を取り出して廃棄し、残りの割れた胚の培養を続けます。
   注:この段階では胚はガラス化、受容女性への移植、または胚盤胞期まで培養保存されることがあります。
8. 受精後96時間(hpi)まで同じ培養条件下で胚を培養し続けてください。形態学的基準に基づき、96 hpiでの胚盤胞形成を評価する。
   注:この期間中は追加の媒体変更は必要ありません。正常な胚盤胞は、目に見える胚盤腔、明確な内細胞塊、そして完全な栄養胚葉層の存在によって識別されます。

結果

このプロトコルを用いて、マウスCOCはin vitro 成熟、 in vitro 受精、そしてその後の in vitro 胚培養を順次処理し、着床前胚の再現性のある生成と胚盤胞段階への発育を達成しました。IVMを14時間経過すると、COCは通常、積乱の拡大と完全な卵母細胞形態を示しました。卵母細胞減数分裂の成熟は、IVM後に指定された評価コホートを剥離し、PB1の押し出をスコアリングすることで定量化しました(図6A)。3つの独立した複製群で、PB1の押出率は80.4%(41/51)、79.5%(70/88)、83.9%(47/56)で、平均成熟率は81.3%±±1.3%(平均SEM;n = 3複製)でした。このプロトコルでは、成熟率が60%未満は最適とは言えません。このような条件下では、成熟しない卵母細胞は通常PB1の突出を欠き、積雲の拡大が障害されたり、細胞質が暗くなったり不均一になったりすることがあります。

ディスカッション

このプロトコルは、未成熟COCを用いたマウス卵母細胞のin vitro成熟、in vitro受精、in vitro培養の標準化された手順を提供し、定義されたin vitro条件下で胚盤胞段階を経た着床前胚の再現性生成と評価を可能にします。多くの研究で、IVMの結果は培地、培養期間、取り扱いの実験室特有の違いに敏感であり、^IVM後の発生能力が低下する^{ことがあります。}未成熟COCを用いたこのIVM–IVF–IVCプロトコルの適用では、高いPB1突出率(81.3%)および2細胞率(87.6%)、そして胚盤胞形成(52.6%)を支持しました。これらのデータを総合すると、プロトコルがIVM後の効率的かつ再現性の高い着床前発達を支援していることが示されています。

これまでのマウス卵母細胞IVMおよびIVF手技は別々の実験的手法として説明され...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35 mm ペトリ皿	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm ペトリ皿	Thermo Fisher Scientific	150270
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A8806
飼育用飼料（げっ歯類飼育用配合飼料）	Keao Xieli（北京、中国）	N/A
CO2インキュベーター	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-グルコース	Sigma-Aldrich	G7021
使い捨てパスツールピペット	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
上皮成長因子	Gibco	PHG0313
細かい解剖用はさみ	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
細かい先端の鉗子	Rhino	SW14
卵胞刺激ホルモン	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	（予備平衡済み）胚培養培地
ヘモサイトメーター	Millicell	MDH-4N1
ヒアルロンidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX（3-イソブチル-1-メチルキサンチン）	Selleck	S5836
KnockOut 血清代替	Gibco	A3181501
L-システイン	Sigma-Aldrich	C7352
黄体形成ホルモン	Millipore	869003
M2培地	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
マイクロピペット	Gilson	F167350
ミネラルオイル	Sigma-Aldrich	M8410
リン酸緩衝生理食塩水	Gibco	20012027
妊婦用マーゴナドトロピン	寧波第二激素厂（寧波、中国）	N/A
ピルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	P4562
立体顕微鏡	Olympus	SZX10
滅菌培地ボトル	Nalgene	46600-586
滅菌シリンジ針	BD Biosciences	309623	1 mL、27G1/2
シリンジフィルターユニット	Millipore	SLGP033R
サーモプレート	東海ヒット	TPi-SZX2X