形状解析アルゴリズムは、2次元から3次元細胞培養への空間的形態と文脈を定量化し、表現型の新規定量化を可能にします

Summary

本記事では、細胞やオルガノイドにおける新しい形態的特徴を、面積、体積、表面積などの従来の指標では捉えられない空間アルゴリズムである線形圧縮極座標変換(LCPC)を用いて定量化する方法を説明します。形状の向きやアライメントのベストプラクティスについても議論されています。

Abstract

多くの研究により、細胞やオルガノイドの形態表現型が抗がん剤に対する感受性と相関していることが示されています。しかし、従来の表現型測定方法は面積、体積、周囲、信号強度などの空間的指標に依存しており、これらは機能しますが限界があります。これらの手法は、左右利きの特性であるキラリティのような空間的文脈の重要な特徴を多く測定できません。体積はキラリティを記録するために使えません。なぜなら左と右の靴は同じ体積を持つからです。キラリティ、重力方向、極性軸といった空間的文脈は人間にとって直感的ですが、これまでの細胞生物学者、病理学者、放射線科医、機械学習の実務者が用いる従来の指標では、これらの基本的な概念を捉えきれていません。線形圧縮極座標変換(LCPC)は、他のどの指標とも異なる空間的文脈を捉えることができる新しいアルゴリズムです。LCPC変換は、等高線とグリッド線の交点を追跡するグリッドシステムを重ねることで、2次元(2D)の等高線を離散的な正弦波に変換します。この方法により、輪郭線は離散座標の対の列に変換され、独立座標(x座標)は2次元空間内の連続した位置に対応します。各従属座標(y座標)は、等高線と格子線の交点から格子系の原点または基準線までの距離から成り立つ。離散正弦波の形で、高速フーリエ変換がデータに適用されます。このようにして、2Dおよび3D細胞培養における細胞の形状を体系的かつ多次元的に表現し、治療抵抗性に関する洞察を明らかにする強力な定量的層化を可能にします。

Introduction

三次元(3D)オルガノイド培養は、生体内生物学の模倣において二次元(2D)細胞培養よりも優れていることが証明されています^1,2。オルガノイドは、効果的な治療のスクリーニングや^{疾患進行の}洞察を得るために、がん研究において不可欠な存在^{となっています。}がん生物学では、形態学の違いが細胞や組織の異なる生物学的挙動と相関することはよく知られていますが、この分野は従来の形状指標に依存しており、その範囲は限られています。本研究は、面積、体積、表面積といった従来の手法を凌駕し、前例のない精度で微妙な形態的特徴を客観的に定量化する新しい空間アルゴリズムを記述します。

線形圧縮極座標変換(LCPC)は、組織組織病理学で観察される複雑な形態を客観的かつ定量的に記述するために考案され、結腸ポリープ⁷のグレードアップを向上させることを目的としています。このアプローチを拡張して、双極性障害やアルツハイマー病などの脳病理における巨視的なMRI空間的特徴を捉えたいという思いから、さらに強化された拡張が行われました。本研究では、LCPC変換の2つのバージョン、すなわちパラレルグリッドシステムとラジアルグリッドシステムの適用に関するステップバイステップのプロトコルとベストプラクティスを説明しており、いずれもオープンソースのスクリプトとチュートリアル動画があります。

従来の幾何学的手法以外にも、細胞や臓器の複雑な形状を測定するのに効果的な抽象化が複数存在します。これには、離心率、歪み、コントラスト、峰度の測定に加え、円形性、非対称性、辺の不規則性、そしてグローバルな輪郭構造^8,9,10を捉えるためのゼルニケモーメントが含まれます。フラクタル解析はまた、複雑な輪郭線をスカラー値に還元するのにも有用であり、例えば輪郭線の不規則さを測るフラクタル次元や、等高線^11,12における不均一な隙間の現れを測定する欠損度などがあります。テクスチャの測定には、コントラスト、エネルギー、均質性、相関、エントロピーの測定にグレーレベル共現マトリックス(GLCM)法が人気^です。これらの手法はいずれも有益ですが、重力の方向や左利き・右利き、形状変化の方向に影響を与える中央支持構造の位置など、空間的な文脈を捉えるために設計されていません。さらに、多くは空間情報を表すために単一のスカラー値やごく少数のスカラー値を生成するため、引用された研究では複雑な形状を評価する際にこれらを組み合わせて使われることが多いのです。

LCPC変換は、1回の測定から多くの特徴を生成し、重力の方向など空間的文脈を形状に符号化する空間マーカーを追加できるように設計されました。LCPC変換⁷ に最も近い方法は、その¹⁵年後に発表され、同じ核心的な考え方を共有しています。それは、フーリエ変換をセルの輪郭線に適用し、周波数スペクトルの形で形状を測定することです。しかし、LCPC変換は独立した設計で、測定対象の形状外の空間的文脈の知識と組み合わせて適用されることを想定していました。さらに、LCPC変換の発明者はこの論文で、得られる周波数スペクトルには膨大な量の隠れた空間情報が含まれていると説明しています。 補足ファイル1 には、引用された手法を用いる際にしばしば見落とされがちな生物学における空間的文脈と、LCPC変換をどのように応用してこの文脈を捉えることができるかについての詳細な議論が含まれています。形状データで対照群と実験群の間に差が見られない読者、目で形の違いが見えないか、形状データでほとんど差が見られない人がいるなら、もっと大きな差があるはずなのにLCPC変換を試すべきです。

LCPC変換は、形状を多次元で表現するため、空間情報の測定において前例のない精度を提供します。従来の方法である面積や体積法のように、形状ごとに1つのスカラー値(すなわち25cm^²)しか得られませんが、LCPC変換の結果は複数の指標を生成でき、それぞれが形状の異なる形態的側面(例えば、角の丸みと鋭さ、滑らかさとエッジのギザギザ)に対応します。LCPC変換は、2D形状の等高線と交差する直線のグリッドを重ねて表現します。各グリッド系には、線形距離を測定するための原点(図1)または基準線(図2)があります。アルゴリズムを説明した簡略化されたフローチャートについては 図1B および 図2B を参照してください。グリッド線と形状の輪郭との間のすべての交点が検出されます。各交差点の距離は基準線または原点に対して計算されます。このようにして、LCPC変換は2次元形状を連続したx-y座標対の連続に変換します。x座標はグリッド線の位置を0から無限遠まで、y座標は交差点から基準線または原点までの距離を表します。この離散正弦波の形式では、高速フーリエ変換(FFT)を適用して「位置領域」から周波数領域に変換します。もしx座標が時間を表すならば、「位置領域」はFFTの標準的な応用における「時間領域」と同等になります。

放射状グリッド系は各交差点から放射状格子の原点からの距離を測定します(図1A)一方、平行グリッド系は常に形状の左側にある虚想線を参照して交差点の距離を測定します(図2A)。オープンソースのスクリプトは、輪郭線の最も左端のピクセルを見つけ、その位置から10ピクセル左に移動してこの仮想線の位置を決定します。ここで、この位置のx座標がすべての交点を計算する基準線となります。この10ピクセルルールは恣意的ですが、そのためオープンソースの平行グリッドシステムで解析されるすべての輪郭線には、4辺すべてに少なくとも15ピクセルの空白が必要です。

折りたたみや複数の層を持つ2D形状では、グリッド線が輪郭線と複数回交差することがあります。この場合、グリッド線上のすべての交差点の距離を1つの値に合計します。したがって、各グリッドラインはx座標とy座標のみを持ちます。この総和は、LCPC変換という名称の「圧縮」という用語で表されます。非線形の2D形状を離散的な正弦波に描画することは、アルゴリズム名の「線形化」という用語で表されます。最後に、「極座標」という用語は、最初に概念化されたグリッド系が極座標⁷の180度放射状グリッドであることに由来します。極座標とデカルト座標が互換可能であることに気づいた後も、アルゴリズム名はそのまま残されました。謝辞のセクションでは、LCPCトランスフォームの発明と拡張に動機づけられた個人的な理由が説明されています。

プロトコル1は 図3Bに示されるデータを取得するシーケンスであり、プロトコル2は 図3C–Dに示されるデータを取得するシーケンスでした。これらのプロトコルのステップは、GitHubリポジトリ「Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform^」で利用可能な個別のPythonスクリプトで実装されています。プロトコル1は、LCPC変換に備えて「純粋な形状」を導出するための前処理ステップの一例です。プロトコル2は、形状を「スケールで」測定するための前処理ステップの一例であり、これは形状同士の元のスケールでの測定を指します。

セグメンテーションは、MacのPreviewやMicrosoftのPaintなどの画像処理ソフトウェアで手動で行うか、しきい値ベースの手法を用いて行うことができます。手動で行う場合は、青、緑、ピンク/マゼンタ、赤の4色のいずれかを選ぶべきです。GitHubリポジトリ「Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform」¹⁶ には「color extraction scripts」というフォルダがあります。このフォルダには、前述の4色を抽出し、白い背景に青いマスクに変換するPythonコード付きのJupyter Notebookファイルが4つ入っています。このプロセスは、Fiji/ImageJのような画像処理ソフトウェアで輪郭色の閾値を設定することでも実行できます。境界が接触したりエッジが重なったりする等高線(例:ベン図)を含む画像の場合、画像処理ソフトウェアで分離し、複数のオルガノイド輪郭を含む複合マスク画像内で独立したオブジェクトとなる必要があります。これは、接触しないオルガノイドが1つだけ、または複数のオルガノイドが接触しない画像には適用されません。

Protocol

本研究で使用された一次ヒト細胞は、倫理承認およびインフォームドコンセント手続きのもとで取得・培養され、以前に報告された¹⁷細胞。ここに示した画像は、承認された細胞培養から生成され、初めて公表されています。組織標本は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院およびカリフォルニア大学サンフランシスコ校で、倫理審査委員会(IRB)承認のプロトコルのもと、研究用組織の使用に関するインフォームド・コンセントを提供した患者から採取されました。本研究では追加の人体標本採取は行われていません。

1. LCPC変換のための2次元オルガノイド輪郭の純粋な形状の抽出

1. MicrosoftのPaint、MacOSのPreview、Fiji/ImageJなどの画像処理ソフトウェアを使って、各オルガノイドの外縁をセグメント化してください。
2. オルガノイドの輪郭を、白い背景に青い線で開いたマスクとして抽出します。
3. それぞれの青い輪郭線をそれぞれの白いキャンバスに切り離します。
   注意:このステップは画像に複数の輪郭が含まれている場合のみ必要です。
4. 青いオブジェクトの四辺すべてに1ピクセルの余白を持たせるように各輪郭線をトリミングします。
5. 四方すべてに100ピクセルの白紙を追加して新しい余白を作ります。
6. 物体を回転させ、最も長い内部長を水平にします。
   注意:このステップは、各オブジェクト内の最も長い内部線をオブジェクトの幅に変換します。この目的のために2つのスクリプトが用意されています。閉じた形状の場合は、「Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb」というJupyterノートブックを使います。開いている形状や複数のコンポーネントを持つ形状の場合は、「Rotate Green Line_v3.ipynb」というJupyterノートブックを使ってください。Rotate Green Lineツールには、.ipynbファイルと同じフォルダ内のReadMeファイルにリンクされたビデオチュートリアルがあります。
7. 青い物体の四辺すべてに1ピクセルの余白を持たせるように各画像をトリミングします。
   注意:これはステップ1.4と同じです。しかし今回トリミングする目的は、次に来るサイズ調整のステップで、青い物体だけでなくキャンバス全体のサイズを変えることです。したがって、青い物体をキャンバス本体とほぼ同じ幅と高さにすることで、キャンバス幅を400ピクセルにリサイズすると、オブジェクトの幅もほぼ400ピクセルにリサイズされます。「Trim margin to 1-pixel border.ipynb」というJupyterノートブックがあります。
8. 各画像のキャンバス幅を400ピクセルにリサイズしつつ、アスペクト比も制約します。
   注意:このステップで各オブジェクトの幅は同じになります。アスペクト比を制約することで、リサイズ時にオブジェクトが歪むのを防ぎます。JupyterのNotebookには「幅を400ピクセルにリサイズするが、アスペクト比を制限する.ipynb」という名前があります。
9. 四方すべてに100ピクセルの白紙を追加して新しい余白を作ります。
10. 各画像を時計回りまたは反時計回りに90度回転させ、すべての画像で選択する中で最長の内部長さを垂直にします。
    注意:上記のシーケンスでは、純粋な形状はステップ1.6、1.7、1.8、1.9を順次実装することで得られます。ステップ1.9でマージンスペースを追加することは、次に行われるLCPC変換スクリプトの誤りを避けるために必要ですが、純粋な形状の抽出には関与しません。形状を「スケールで」測定したいユーザーは、上記のシーケンスのステップ1.6、1.7、1.8を実行する必要はありませんが、LCPC変換を適用する前に最適な向きを得るためにマスク画像の事前処理を行う必要があります。
11. 各等高線に対してLCPC変換を行います。放射状グリッドメソッド¹⁸または並列グリッドメソッド¹⁹用に提供されているPythonスクリプトを使用してください。

2. LCPC変換のための2次元オルガノイド輪郭のスケール形状の抽出

注:物体のスケール形状を抽出するステップバイステップの方法は、上記のプロトコル1の純粋な形状抽出方法に似ています。両プロトコルでは、マッチングを容易にするためにステップ名が同じです。各ステップについてはプロトコル1の注記を参照してください。純粋な形状と実際のスケール形状の主な違いは、実際のスケール形状にはサイズ調整のステップ1.6、1.7、1.8が不要であることです。

1. 各オルガノイドの外縁をセグメント化します。計算方法を使うか、MicrosoftのPaint、MacOSのPreview、Fiji/ImageJなどの基本的な画像編集ソフトを使って手動で行うこともできます。
2. オルガノイドの輪郭を、白いキャンバスに青い線で開いたマスクとして抽出します。マスクを抽出するにはFiji/ImageJを使うか、提供されているPythonスクリプト¹⁶を使います。
3. それぞれの青い輪郭線をそれぞれの白いキャンバスに切り離します。マスクを抽出するにはFiji/ImageJを使うか、提供されているPythonスクリプト¹⁶を使います。
4. 青いオブジェクトの四辺すべてに1ピクセルの余白を持たせるように各輪郭線をトリミングします。Fiji/ImageJ、または提供されているPythonスクリプト¹⁶を使ってください。
5. 四方すべてに100ピクセルの白紙を追加して新しい余白を作ります。Fiji/ImageJ、または提供されているPythonスクリプト¹⁶を使ってください。
6. 各輪郭を回転させ、最長の内部線を垂直にします。Fiji/ImageJ、または提供されているPythonスクリプト¹⁶を使ってください。
7. 各等高線に対してLCPC変換を行います。放射状グリッドメソッド¹⁸ または並列グリッドメソッド¹⁹用に提供されているPythonスクリプトを使用してください。

Results

乳がんオルガノイドに適用された放射状グリッドLCPC変換

3Dオルガノイドや腫瘍は様々な形状を取ることができ、その中には人間の目とは明らかに異なるものもありますが、従来の指標では統計的に有意な差は見られません。一方で、オルガノイドは人間の目には異質で重要に感じられない形状を示すこともあり、異なる亜型を表す微妙な形態を繰り返し隠すこともあります。ヒト一次乳腺オルガノイドは患者から抽出され、既に発表されたプロトコル^17、20、21に従って3Dで培養されました。 図3A は、視覚的検査で確認可能な3つの形態的カテゴリーを示しています:嚢胞性表現型、多嚢胞性表現型、そして高密度多嚢胞性表現型です。 図3B は、これらのオルガノイドの外輪郭が手作業で分割され、その純粋な形状が抽出されたことを示しています。これにより、形状に与える大きさの影響がなくなります。輪郭線が円形であったため、純粋な形状には放射状グリッドのLCPC変換が適用され、その後PCAが適用されました。図 3B に重ねられた輪郭線は回転されており、最長の内部線が垂直になっているため、元の画像の向きとは異なることに注意してください。 図3B は最初の2つの主成分(PC)のドットプロットを示しており、K平均クラスタリングは0、1、2の3つのクラスターを特定しました。シルエットスコア(SS)は、クラスター0と1(SS = 0.68)とクラスター1と2の間に2つの別々のクラスタが存在する可能性を確認しました(SS = 0.69)であり、クラスター0とクラスタ2の分離は弱い(SS = 0.27)を示しています。クラスター0と2の間のシルエットスコアは弱いものの、各データポイントの純粋な形状でデータポイントをラベル付けすることで、クラスター2が最も特徴的な表現型、すなわち高度に非対称で非円形の輪郭(この場合輪郭の厚さは関係ない)を表していることが正当化されます。

純粋な形状ではサイズが形状に与える影響を排除しますが、面積や体積を測定する際には不可能ですが、オルガノイドの輪郭をスケールで測定することで興味深い洞察が得られます。 図3C は、画像から分割されサイズ変更なしで輪郭線に対して行われた放射状グリッドLCPC変換の結果として、最初の3台のPCの3Dドットプロットを示しています。このアプローチにより、LCPC変換はオルガノイドの形状とサイズの両方を同時に測定します。 図3C は、多嚢胞性オルガノイドと高密度多嚢胞性オルガノイドが嚢胞性オルガノイドに比べて密度が低いことを示しています。この展開を定量化するために、 図3Dは各表現型の共有PCA空間における散乱を示しています。各表現型ごとに平均K近傍距離(KNND)が計算され、嚢胞性オルガノイド(KNND = 1.061)から多嚢胞性オルガノイド(KNND = 1.575)、高密度多嚢胞オルガノイド(KNND = 2.247)へと移動する点の密度減少を視覚的に評価することを支持します。この点の密度の低下は、外側輪郭の形態的異質性の増加とも解釈できます。最後に、LCPC変換と従来の面積指標との比較として、 図3E は嚢胞性オルガノイドと密度の高い多嚢胞性オルガノイドの面積(p = 0.016、ウィルコクソンランク-サム検定)に統計的有意性があるものの、純粋な形状LCPC解析後のK-平均クラスタリングで識別される表現型全体に3つの異なる形態グループが存在するという示唆は示されていません(図3B)または、大規模なLCPC解析(図3C–D)で示される形態的異質性が増していることも示されています。 図3E は、嚢胞性から多嚢胞性、そして高密度な多嚢胞オルガノイドへと移るデータ点の散乱が減少していることを示しており、これは大規模なLCPC解析(図3C)で観察されるものとは逆であり、LCPC変換によって捕捉される空間情報が捕獲される領域とは異なります。

図 3の個々の2D形状や 補足図1 の2D形状にも同様のアプローチが適用されます。これは2D細胞培養中の細胞の輪郭にも適用されます。すなわち、単一細胞(赤血球など)や細胞のクラスター(子宮頸部パップスメアなど)です。これらのケースそれぞれのパイロット研究は動画で説明されています:外側輪郭に異なる程度の折りたたみを示す脳オルガノイドの形状解析²²;肺胞の形状 解析は、同じ原理を2D^{細胞培養の}解析にも適用できます。子宮頸部組織の形状解析(パップスメアによる)では、放射状グリッドLCPC変換²⁴を通じて核と細胞膜の輪郭を同時に定量化します。マラリアに感染した赤血球および感染細胞に隣接するが自身は感染していない細胞の形状解析²⁵;鎌状赤血球病の影響を受けた赤血球の形状分析²⁶.

空間情報の指標としての密度やテクスチャを測定するための並列グリッドシステム

空間情報は、正方形、丸み、曲率といった通常の形状の概念を超え、質感や密度などの概念を含むため、より深く関わります。血管のような複雑な管状ネットワークや、細胞骨格フィラメントのような分岐ネットワークは、円や多角形のような幾何学に基づく直感とは異なる形状の概念に当てはまりません。しかし、密度とテクスチャーは細胞、オルガノイド、腫瘍の構造と機能を理解する上で非常に有用な空間情報の概念です。蛍光画像で複雑なネットワークを定量化する方法を扱う際、細胞生物学者は画像内の平均信号強度や画像全体の面積に信号が含まれている割合などの特徴を測定します。これらのアプローチは、空間情報には幾何学的モチーフで説明される以上のものがあることを認識しています。

チップ上の組織、腫瘍、臓器内の血管ネットワークのパターンは、従来の幾何学的モチーフでは簡単に定義できませんが、質感や密度として解釈することで恩恵を受けます。腫瘍の発生と治療抵抗性における血管リモデリングは、がんのよく知られた特徴です(²⁷でレビュー)。458件の原発性神経芽細胞腫瘍の組織病理学的切片を^解析し、全血管および血管区間の密度、サイズ、形状を特徴付けました。彼らは、予後因子が悪い患者の腫瘍では、好ましいコホートの腫瘍に比べて血管がより大きく、より豊富で、形状も不規則であることを発見しました。興味深いことに、「腫瘍クラスターを包覆する血管」(VETC)²⁹という用語が、より大きな肝細胞癌内の小さな腫瘍のクラスターを取り囲む血管のパターンを指し、転移率や再発率の上昇と関連しています。この用語を作った同じグループは後に、VET陽性肝細胞癌がキナーゼ阻害剤ソラフェニブ³⁰の治療に対する陽性反応と相関していることを発見しました。したがって、血管パターンを定量化する能力は予後や耐性のメカニズム理解に不可欠です。

管、島、枝の密集ネットワークを定量化するために、LCPC変換の並列グリッド系は形状ではなくテクスチャ密度と呼ばれるものを測定するのに有用です。平行グリッドLCPC変換がどのようにこれを行うかの例として、 図4A は心臓血管³¹の研究から得られる心臓微小血管パターンを示しています。肉眼では、梗塞部位と損傷部位から遠く離れた領域とのパターンを客観的かつ定量的に区別するのは非常に困難です。血管のマスクを抽出し(図4A ステップ1)、並列グリッドLCPC変換を適用することで、定量的な差異を観察できます。まず、データのクリーンさを高めるために、各画像を均一な直径の円でトリミングし、その円は正方形画像の中央に配置されました(図4A ステップ2)。これにより、回転に関わらず各画像の高さと幅が同じであることが保証されます。次に、トリミングされた画像を回転させ、血管の主軸( 図4A の赤い二重矢印、ステップ1)を垂直にします(図4A 、ステップ3)。次に、血管パターンがまばらな画像でも青いピクセルの直径が同じになるように画像の周囲に青い線を引きます(図4A 、ステップ4)。ステップ3と4はFiji/ImageJソフトウェア(v2.14.0)を使用して実施されました。最後に、並列グリッドのLCPC変換が適用されます(図4A 、ステップ5)。PCAによる結果解析と最初の3つのPCプロットにより、障害領域は遠隔領域とは別々に集まっていることがわかります(図4B)。面粉距離(CD)の計算は、グラフが示す視覚的パターンを定量化します。損傷から1日後、梗塞部位は非損傷部位よりも基礎状態からより遠い血管パターンを示します1Day_remote(基礎部 vs. 1Day_infarct:CD = 83.89)。損傷から1日目には、損傷していない遠隔部位は基礎疾患よりも損傷部位に近い(1Day_remote対1Day_infarcxt:CD = 34.48)。損傷から3日後、損傷部位および関連する非損傷の遠隔部位の血管パターンが基礎状態および互いに大きく逸脱します(基礎部対3Days_Infarct:CD = 240.63;基礎量対3Days_Remote:CD = 67.28;3Days_Remote vs. 3Days_Infarct:CD = 168.35)。非常に興味深いことに、損傷部位と損傷していない遠隔部位の血管パターンは、基礎状態とほぼ直交する3次元空間を占め、損傷後1日目よりも近い距離で整列しています(7日目のCD = 24.76、1日目の34.48)。データは二つのことを示唆しています。(1) 治癒が進むにつれて、損傷部位と非損傷部位の遠隔部位の血管パターンが基礎疾患とは異なるパターンを取ること;(2) 損傷部位で活性化された再建プログラムは、関連する非損傷の遠隔地でも同様の形態変化を引き起こす。

LCPC変換の多様性を示す指標として、従来の血管面積(図5A)と総周囲長(図5B)を計算しました。面積や周囲は時間経過の点間の変化を示しますが、船舶の異なる空間配置を一貫して定量化することはできません。面積と周囲は多くの異なる血管配置を表す抽象的な概念であり、そのため血管の空間的配置が治療条件や時間経過によってどのように変化しているかを示すには適していません。各グループごとにn=3の場合、t検定とウィルコクソン検定は信頼性が低い。クリフのデルタはノンパラメトリックであり、効果サイズの変化を示すのに効果的です。血管の面積を測定することで明らかになる主な違いは、基礎状態と7日間の時点との間にあります。血管の総周囲長では、基礎状態と1日目、基礎状態と7日後の違いがあります。しかし、面積や周囲からは、発作された発散地と無傷の遠隔地との間に違いが見られず、発散した発散発跡が意図的に損傷したことを考えると非常に驚くべきことです。ここでLCPCトランスフォームの多様性が従来の指標と比べて現れます。各試料に対して、LCPC変換の一部としてのFFTの結果は、一連の周波数に対応する大きさの集合を生成します。各周波数ビンの大きさを平均化し、処理群間で比較することができます(補足図1参照)。これにより、どの頻度ビンが処理群間で最も大きな差を示すかを簡単に評価できます。 図5C は、特に梗塞部位と関連する非損傷の遠隔地間で明確な効果量差を示す6つのビンを示しており、面積と周囲の位置では差が見られませんでした。これら6つのビンの独立した値は、処理条件間の定量的差異を示す複数の指標を提供します。興味深いことに、LCPC変換結果のBin 1のグループ間のパターンは、総周長測定の結果と類似しています。しかし他の指数は、面積と周囲の両方に隠れた定量的な違いを示しています。基礎条件に特有の指標:Bin 49、Bin 56、Bin 21。Day 1グループ間で一意のインデックス:Bin 1、Bin 6、Bin 49。Day 3グループ固有のインデックス:Bin 6、Bin 112、Bin 49。Day 7グループ固有の指数:Bin 6、Bin 49、Bin 112。これらのデータは、LCPC変換が従来の面積や周囲の手法に比べて多用途かつ高精度であることを強調しています。

図1:LCPC変換の放射状グリッド系の説明。 (A) ステップ1:対象の形状を分割し、青いマスクとして抽出します。ステップ2:マスク用のバウンディングボックス(対象物を四辺すべてで囲い、接触する最小の長方形)を決定します。バウンディングボックスの中心から始まる放射状のグリッド線のシステムがマスクに重ねられます。バウンディングボックスの中心を原点として選んだ決定は恣意的でした。ステップ3:グリッド線と形状の間の各交差点の距離を原点に対して計算します。複数の交差点を持つグリッド線は、それらの交差距離を合計して1つの値にまとめます。ステップ4:FFTを適用してステップ3のデータを頻度プロットに変換します。これはステップ1の形状の静的な多次元表現(ステップ5)です。ステップ6:ステップ5からインデックスを使ってスカラー値を作成できます。計算すべき指数の種類については 図10 を参照してください。(B) 放射状グリッド系のLCPC変換のステップを簡略化した手順を示すフローチャート。(C) 放射状グリッドシステムが最適な形状のテーマの例。これらの形はMicrosoft PowerPointで描かれました。これらの画像は作者によって作成されており、出版ライセンスや著作権の許可は必要ありません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:LCPC変換の並列グリッドシステムの説明。 (A) ステップ1:関心のある形状を手動で分割し、バイナリマスクとして抽出します。ステップ2:形状の上に平行なグリッドシステムを重ね、形状を回転させて基部を水平にします。ステップ3:グリッド線と形状の各交差点の距離を基準線に対して計算します。複数の交差点を持つグリッド線は、それらの交差距離を合計して1つの値にまとめます。ステップ4:FFTを適用してステップ3のデータを周波数プロットに変換します。これはステップ1の形状の静的な多次元表現です。ステップ6:ステップ5からインデックスを使ってスカラー値を作成できます。計算すべき指数の種類については 図10 を参照してください。(B) 並列グリッドシステムのLCPC変換ステップを簡略化したフローチャート。(C) 例は、パラレルグリッドシステムが最適なテーマを形成する。これらの形はMicrosoft PowerPointで描かれました。これらの画像は作者によって作成されており、出版ライセンスや著作権の許可は必要ありません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:LCPC形換形は乳がんオルガノイドの形態的サブタイプを客観的に同定します。 (A) 一次ヒト乳腺オルガノイドは、以前に報告された17,20,21および補足ファイル1に記載された通り由来した。視覚的検査により、嚢胞性、多嚢胞性、高密度多嚢胞性の3つの表現型が観察・分類されました。スケールバー = 50 μm。(B) オルガノイドの外側輪郭は手動で分割され(補足図2;補足ファイル1に記載された基準)、これらの輪郭の純粋な形状が得られました。図の等高線はすべて回転しており、最長の内部線は垂直になっていることに注意してください。したがって、元の向きとは一致しません。その後、放射状グリッドLCPC変換を適用し、結果をPCAで解析しました。K-meansクラスタリングは3つのクラスター(0、1、2)を特定し、シルエットスコア(SS)を計算してそれらの存在を確認しました。クラスター0対1、SS:0.68;クラスター0対2、SS:0.27;クラスター1対クラスター2、SS:0.69。(C) オルガノイドの外輪線も、サイズ変更なしに画像上で相位的に見える形状に対して放射状グリッドLCPC変換を用いて測定しました。挿入図は拡大され、多嚢胞性オルガノイドと密度の高い多嚢胞性オルガノイドの緩い詰め合いが、嚢胞性オルガノイドと比べてより緩い配置を示しています。BとCの場合:緑=嚢胞性、紫=多嚢胞性、黄色=高密度多嚢胞性。(D) 最初の3つのPC値は各表現型ごとに別々にプロットされ、平均KNNDは嚢胞性表現型が最も密集している一方、多嚢胞性および高密度多嚢胞性表現型は密度が低い(異質性が高い)を示すように計算されます。別々にプロットされていますが、これら3つの表現型はすべて同じPCA空間を共有しています。嚢胞性表現型については、平均KNNDは挿入部分から計算されました。なぜなら、この表現型にのみ存在する外れ値が計算に歪むためです。平均KNNDs:嚢胞性1.061;多嚢胞症1.575人;致密多嚢胞性、2.247。(E) オルガノイド面積のボックスプロットは、嚢胞性から多嚢胞性、高密度多嚢胞性オルガノイドへのデータ点の散乱が減少していることを示しており、これは大規模なLCPC解析(図3C)で観察されるものとは逆であり、LCPC変換によって捕捉される空間情報が領域の捕捉量とは異なります。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:平行グリッドLCPC変換によるテクスチャ密度測定。(A) 心臓組織中の微小血管のフォトマイクログラムは、別の研究で以前に取得されていました^31,32。これらの画像はこれらの研究から直接再現されたものではありません。むしろ、Gkontraが提供した³¹件の報告された元の3D画像データセットから生成された新しいビューを表しています。データセットは以前に公開されていますが、ここに示されている特定の画像は初めて公開されています。各時点で負傷者がいなかった遠隔地の映像は表示されていません。ステップ1:2Dマスクを生成し、血管の大まかなアライメント軸(赤い二重矢印)を決定します。ステップ2:画像の中央点を中心に円形領域を作り、次のステップで画像を異なる角度で回転させた後、各画像の高さを同じにします(回転度の差を変える正方形画像は回転度に応じて画像の高さが変わります)。ステップ3:各画像を回転させ、ステップ1で決定した一般的なアライメント軸を垂直にします。ステップ4:各画像の直径が同じであることを保証するために均一な青い枠を貼ります。密度が低い画像は短くなることがあります(例:ステップ3の「心筋梗塞後7日」を参照)。ステップ5:並列グリッドLCPC変換を適用します。(B)並列グリッドLCPC変換の出力の最初の3つのPCの点図(紫:基礎状態、緑:梗塞部位、黄色:梗起部位から遠隔の非損傷部位)。3つの条件間の各時刻における面取り距離の計算については、結果セクションを参照してください。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:LCPC変換は領域および周囲に隠された特徴を測定します。 従来の形状指標との比較のために、(A)血管ネットワークの面積パーセンテージ、(B)総周囲長を測定しました。(C)LCPC変換の結果から得られる精度を示すために、FFTから得られる個々の周波数ビンの値を比較しました(補足図1)。処理群間の差異を客観的に定量化するための指標として、6つの頻度ビンが選ばれました。すべてのパネルにおいて、各グループのサンプル数(n=3)が限られているため、効果量の非パラメータクリフデルタが計算され、ウィルコクソンランクサム検定のp値ではなく適用されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図6:きれいなデータを抽出するために形状を体系的に配置することの重要性。(A) 互いに鏡像である同一形状の例と、平行グリッドシステムがどのようにそれらの異なる向きを決定するか、それによって異なる結果を生み出すこと。(B) 形状2を水平に反転させ、その向きが形状1と一致し、形状1とより公平な比較になる方法の例。この構成では、並列グリッドのLCPC変換はシェイプ1とシェイプ2の両方で同じ結果をもたらします。この向きの変更は、シェイプ2を変更すべきでない空間的な文脈がない場合にのみ行うべきです。(C) 数字「3」に似た物体の4つのバリエーションの例で、その中には逆方向を向いているものもあります。(D) 並列グリッドLCPC変換によって得られるデータのクリーンさを最大化するために、各オブジェクトの向き付けの例。(E) パネルDと同じ向きルールに基づいてパネルCのアイテムの広い膨らみを測定した例。(F) パネルCのアイテムの大きなバルブを測定しつつ、パネルDと同様にそのアライメントコンテキストを保つ例。パネルDにアラインメントルールを保持する動機は、広い膨らみの空間情報の寄与と、これらのルール内で狭い膨らみの寄与を分析することです。C–Fに関連するFFTスペクトルについては補足図3を参照してください。A–Bの画像はMicrosoft PowerPointのアイコンです。CからFの形はMicrosoft PowerPointで描かれました。これらの画像は作者によって作成されており、出版ライセンスや著作権の許可は必要ありません。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:従来の形状指標が明白な文脈を認識できないこと。 (A) チェックマークの列は同じ形ですが、左から右へと大きくなります。このシリーズでは、チェックマークの面積は異なりますが、形状の概念は同じです。つまり、チェックマークのスタイルは同じです。(B)正方形は中心を中心に45度回転させ、その形状の概念が人間がダイヤモンドと呼ぶ形になります。正方形の形状概念はダイヤモンドとは大きく異なりますが、その間の回転は主観的に「傾いた正方形」または「傾いたダイヤモンド」と解釈されます。LCPC変換は、この系列の各ステップの差を客観的かつ正確に測定できます。これらの形はMicrosoft PowerPointで描かれました。これらの画像は作者によって作成されており、出版ライセンスや著作権の許可は必要ありません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8:純粋な形状と縮尺形状の説明。 「アットスケール」とは、物体の元の大きさを相対的に測定することを意味します。一方、「ピュアシェイプ」とは、異なる物体の形状を同じスケールで測定し、サイズが形状に与える影響を排除することを意味します。比較対象のリサイズ方法を客観的に見つけることが重要です。最も長い内部線が最適な選択であることが多いです(ステップ1)。両方の物体は回転させ、最長の内部線が水平になるようにします(ステップ2)。この場合、2つの物体も回転させられ、凹んだ側が下向きになります。次に、各オブジェクトの幅(現在は各オブジェクトの最長の内部線と同じ大きさ)を400ピクセルにリサイズし、オブジェクトの歪みを防ぐためにアスペクト比も制約します(ステップ3)。最後に、LCPC変換を適用する前に、リサイズされたオブジェクトを90度(ステップ4)(この場合は反時計回り)回転させることができます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図9:がん研究のための空間マーカーの例。 (A) 2次元培養中の細胞が移動する仮説的な例として、ラメリ足を移動方向に拡大させる。上皮細胞の移動形態の文脈では、移動軸に沿った最長の内部線を垂直に配置することが空間的文脈を捉える最も理にかなっています。(B) 形状が変わらない被膜内で成長する腫瘍や前がん病変の仮定的な例。病変は茎から成長し、茎は中央の支持構造です。病変が成長または萎縮するにつれて、その輪郭は被覆の内壁に近づいたり離れたりします。点線は、エンケースメントのどれだけの部分をなぞるべきか(オレンジ線)を合理的かつ客観的に定義し、追加情報が少なすぎたり多すぎたりしないようにしています。(C) オプション1は、包囲の位置を含まず病変の輪郭に適用した平行グリッドLCPC変換を示しています。オプション2も同じものを示していますが、被覆の場所の空間的文脈も含めています。例として、赤い点はグリッド線(黒い矢印、緑の線)と等高線の交点を表しています。オプション2では、各グリッドラインがオプション1には存在しない4番目の交差点を作り、オプション2の結果に空間的文脈を定量的に加え、オプション1には全く存在しません。これらの形はMicrosoft PowerPointで描かれました。これらの画像は作者によって作成されており、出版ライセンスや著作権の許可は必要ありません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図10:仮想的なFFT結果とそこから導き出せる一般的な指標。 (A) 2つの仮想形状のFFTから得られる頻度プロットが表示されます。Bin 3とBin 4の大きさは逆の傾向を示すため、これら2つのビンの比率はこれら2つの形状の違いを示す良い指標となります。赤と緑の点線は、良いインデックスを導き出すために使える他の周波数ビンを表しています。(B) FFTプロファイルが形態の違いを表す段階的に減少傾向を示す2つの仮想形状のヒストグラム。(C) 周波数ビンの中央領域で最もFFTプロファイルが異なる2つの仮想形状のヒストグラム。(D) その存在と相関する指標をもたらす可能性のある仮説的な形態的特徴の例。これらの形はMicrosoft PowerPointで描かれました。これらの画像は作者によって作成されており、出版ライセンスや著作権の許可は必要ありません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:血管ネットワークのLCPC変換結果における様々な周波数ビンの大きさを比較したボックスウィスカープロット。 図4および図5に示される血管ネットワークのLCPC変換は、各画像を表す周波数ビンとその大きさのセットを得ます。各ビンの大きさのボックス-ウィスカープロットを用いてすべての処理群を比較し、LCPC変換で測定されたテクスチャ密度の層化指標として最も適したビンを特定します。各ボックス・ウィスカープロットはn=3枚の独立した画像から成ります。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:分節型乳房腫瘍オルガノイドの例。 オルガノイドは専門家によって手動で分割され、その専門家は定期的に培養し、顕微鏡で観察します。この図は、セグメント化されたオルガノイド輪郭の例を示しています。すべての顕微鏡画像のスケールバーは50μmです。本研究で使用された一次ヒト細胞は、倫理承認およびインフォームドコンセント手続きのもとで取得・培養され、²¹個が報告されました。ここに示されている画像は、承認された細胞培養から得られたもので、初めて公開されています。追加の人標本採取は行われませんでした。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3:図6の形状のFFTスペクトル。 図6の形状のFFTの結果をここに示し、形状の向きを変えることが空間情報に与える影響を読者が理解できるようにしています。グラフの左列は変わっていないy軸を持ち、右列は切り詰められた軸で、小さなビン値を可視化できます。(A) 図6Cの4つの形状の平行グリッドLCPC変換によるスペクトルで、再向きは不要です (B) 図6Dの形状の並行グリッドLCPC変換によるスペクトルで、本文で説明されているように再向き化されています (C) 図6Eの形状の平行グリッドLCPC変換からのスペクトル (D) 図6Fの形状の並列グリッドLCPC変換によるスペクトルで、図6Eの形状と比較するためのスペクトルです このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1:LCPC変換のベストプラクティスに関する詳細な詳細。 この補足ファイルは、ベストプラクティスに関する詳細な議論とさらなる方法論的注釈を提供しています。文書の概要は以下の通りです:セクション1 - 面積、体積、周囲、粗さでは捉えられない空間的文脈。セクション2 - LCPC変換の利用と結果の解釈に関するベストプラクティス。セクション3 - 自然の固有極性を理解し、LCPC変換を最大化する。第4節 - LCPC変換から得られるFFTスペクトルの解釈。セクション5 - LCPC変換で形状を測定する前に向きをつける方法。第6章 - 「純粋な形状」と「アットスケール形状」とは何か?第7節 - 統計手法に関する方法論的注釈。第8節 - 細胞培養およびオルガノイドの分断に関する方法論的注記。セクション9 - 自分でLCPC変換をコーディングする人のためのFFTパラメータ。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

Discussion

どんな計算ツールにも言えることですが、出力の品質は、入力がツール設計の基準となる予想されるルールに従っているかどうかに依存します。以下のルールに従い、提供されたPythonスクリプトを使用する際は品質管理のチェックとして使用してください。まず、オープンマスクが白い背景に青い線であることを確認しましょう。青は恣意的な決定であり意味はありませんが、LCPC変換を行うスクリプトは白い背景に青いピクセルを探すように書かれていました。次に、4辺すべてで10ピクセル未満の空白を持つ画像に対してLCPC変換スクリプトを実行しないでください。その理由についてはこの動画をご覧ください:「マージン厚みパラメータ - 形状の輪郭の準備方法」³³。三つ目に、このスクリプトはオブジェクトの輪郭が白い背景に青いピクセルであると仮定しています。線の太さは5〜10ピクセルの間であるべきです。その理由についてはこのビデオをご覧ください:「線太さパラメータ - 形状の輪郭の準備方法」³⁴。第四に、LCPC変換スクリプトを空の画像に実行しないでください。これによりスクリプトにエラーが生じます。第五に、わずかなデブリの点だけで構成された画像にはLCPC変換スクリプトを実行しないでください。これにより、グリッドシステムがその点を検出できず、空白画像の解析を試みるためエラーが生じます。第六に、不要なデブリの斑点を含む画像にはLCPC変換スクリプトを実行しないでください。破片は開いたマスクオブジェクトの高さと幅を変え、結果が不正確になります。第七に、LCPC変換でオブジェクトを解析する前にスケールを理解することがなぜ重要か理解するために、この動画をご覧ください:「スケールパラメータ - 形状アウトラインの準備方法」³⁵。

LCPCトランスフォームの最も驚くべき点の一つは、空間的文脈を捉える能力です。生物学は自然を理解する上で極めて重要な空間的文脈に満ちています。例えば、上皮細胞は頂端-基底極性^が36,37,38,39です。さらに、微小重力条件下で変化する重力の方向は、宇宙飛行士の生理学^40,41およびがん細胞の形態42,43,44の両方に大きな影響を与えます。最後に、原所で前腫瘍形成症や腫瘍形成は、血液供給へのアクセスを提供する中心支持構造として機能する茎を通じて腔内腔に成長します。これらの病変が後退すると、腔内から離れて柄に向かって後退します^45,46。そのため、LCPC変換は空間的文脈に非常に敏感であり、ユーザーが注意しなければ余計な異質性が生じる可能性があります。図6は、LCPC変換を適用する前に形状を体系的に配置する方法を示しています。図7は、従来の幾何学が人間にとって明白な形状の概念を測定できないことを説明しています。図8は、純粋な形状とスケール形状の測定の違いを可視化した図を示しています。図9は、2D培養、組織学、3D画像による2Dスライスにおける形状の定量化において、空間的文脈がしばしば見落とされがちであることを示しています。スペースの制約により、補足ファイル1には第5節の図6と図7、第6節の図8と図9の詳細な議論が含まれています。

FFTは多次元スペクトルデータを生成するため、ユーザーはスペクトル内の繰り返されるパターンからインデックスを導き出すことに慣れておくことが重要です。この論文ではLCPC変換にFFTの適用ステップが含まれていると言っていますが、実際のLCPC変換はFFTステップの前に行われます(図1A–B ステップ4、 図2A–B ステップ3)。しかし、FFTを適用することで、LCPC変換の出力の周波数領域から客観的かつ体系的な洞察が得られます。したがって、FFTを最終段階として含めなければLCPC変換は効果的ではありません。LCPC変換では、FFTによって一連のビンとその大きさが導かれ、これらはすべてステップ1の等高線入力の静的な多次元表現となります。情報の静的な多次元表現の類推として、アメリカ合衆国における個人の電話通信チャネルを表す9桁の電話番号があります。形状のスカラー値表現(例えば長さ85cm、幅56度など)と比べると扱いにくいですが、多次元データは洞察を抽出するためのはるかに多くの情報を含んでいます。 図10 は、LCPC変換を適用した際に観察されたいくつかのスペクトルパターンと、それらからインデックスを導出する方法を示しています。 補足ファイル1 のセクション4では 、図10 についてより詳しく論じています。

LCPC変換の周波数領域は、肉眼では容易に認識できない2次元形状の客観的かつ定量的な特徴を明らかにします。曲率、ギザギザ、ねじれの非常に微妙な違いも、しっかりと測定可能です。しかし、この方法で形態的サブタイプが特定されると、量的な違いと相関する視覚的に明確なテーマが観察されます。この機能により、LCPC変換は機械学習(ML)モデルの空間情報を抽出する手法として解釈可能となり、生成されたMLモデル自体もより解釈しやすくなります。ニューラルネットワークは強力な機械学習手法ですが、その結果は人間には解釈できないことが多いため、医療人工知能(AI)分野にとって大きな問題となっています。医師は、なぜモデルが悪い判断を下すのか理解できなければ、臨床判断にMLモデルを用いることに消極的です。さらに、誰もモデルがなぜ、どのように偏った判断をしたのか理解できなければ、これを修正することは困難になります。

質感密度の測定(図4 ・図5)についての議論に加える価値がありますが、人間の目は錯覚や無秩序なパターンに簡単に混乱しやすいです。複雑なパターンの無秩序な配置は、しばしばランダムで測定不可能、あるいは測定する価値がないと解釈されます。LCPC変換は、一見ランダムなパターンの再現可能で客観的かつ定量的な差を測定できます。しかし、ユーザーが自然界の混沌とした無秩序なパターンに惑わされないように訓練されない限り、予測可能なパターンを明らかにするために無秩序を測定しようとする試みは行われません。予測可能なパターンは、システムが完全にランダムでないことの明確な指標です。LCPC変換は、肉眼では微妙に異なる、あるいは想像しがたいほど異なる形状を測定するために考案されました。自然界の多くの形態は、予測可能な無秩序のサブタイプというよりも意味のない混沌とした異質性のように見える小さな違いを示すため、LCPC変換と組み合わせて用いられる「4段階」概念フレームワークが開発されました。まず、複雑に見えるシステムがランダムだという考えに抵抗しましょう。次に、混沌とした異質性を「無秩序」と呼び、合理的な参照条件として機能する秩序のタイプを見つけます。障害が参照から逸脱していると仮定します。第三に、LCPC変換のように基準となるパターンを客観的に測定する方法を見つけましょう。第四に、この客観的な方法をシステム内の障害とみなされるものを測定に適用します。

Materials

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	sklearn.neighbors パッケージ内の NearestNeighbors 関数を使用
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	scipy.spatial パッケージ内の cKDTree 関数を使用
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Python 言語で Cliff's Delta の実装を作成
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	手動セグメンテーションの潜在的な有用なツールとして言及されましたが、この研究では使用されていません
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	sklearn.decomposition パッケージの PCA 関数を使用
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook